分析Tim-4促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞侵襲與遷移及其相關(guān)機(jī)制

邢天容

【摘 要】 目的：分析Tim-4促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞侵襲與遷移及其相關(guān)機(jī)制。方法：使用實(shí)時熒光定量PCR法檢測子宮頸上皮永生化細(xì)胞系H8和子宮頸癌細(xì)胞系Siha中Tim-4的表達(dá)水平，用Tim-4的慢病毒載體感染低表達(dá)Tim-4的Siha細(xì)胞系，觀察癌細(xì)胞感染后的Tim-4表達(dá)水平，進(jìn)行細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)檢測Tim-4對子宮頸癌細(xì)胞系Siha的侵襲與遷移能力的影響，最后使用蛋白質(zhì)印跡法檢測子宮頸癌細(xì)胞系Siha中Tim-4和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白的表達(dá)。結(jié)果：Siha細(xì)胞系中Tim-4mRNA表達(dá)水平（1.63±0.03）>H8細(xì)胞系（0.97±0.06），P<0.05;Tim-4過表達(dá)的Siha細(xì)胞的穿模數(shù)為（102.14±5.14）>空載體（56.34±10.21），P<0.05;蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示Tim-4增強(qiáng)了EMT蛋白的表達(dá)。結(jié)論：Tim-4能夠促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞侵襲與遷移能力，其機(jī)制為Tim-4促進(jìn)了癌細(xì)胞中的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。

【關(guān)鍵詞】 Tim-4;子宮頸;癌細(xì)胞侵襲與遷移;Siha細(xì)胞

Tim-4全稱T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白-4，是一種新型的免疫調(diào)節(jié)分子[1-2]。Tim-4主要在巨噬細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)，能夠調(diào)控巨噬細(xì)胞。有研究表明，Tim-4在肺癌中有異常表達(dá)的情況，在癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于正常組織細(xì)胞，且異常表達(dá)程度與肺癌的分期和預(yù)后呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，可以說Tim-4促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長和增殖[3]。不過是否與子宮頸癌有關(guān)目前未見具體研究，據(jù)國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報道得知，Tim-4與宮頸癌的侵襲與遷移有關(guān)，本文作者為分析Tim-4促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞侵襲與遷移及其相關(guān)機(jī)制，利用Tim-4感染低表達(dá)癌細(xì)胞和細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)來進(jìn)行研究，作出如下報告。

1 資料與方法

1.1 一般資料

子宮頸上皮永生化細(xì)胞系H8和子宮頸癌細(xì)胞系Siha（購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所）;細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)試劑盒和六孔板。Tim-4抗體（購于Santa Cruz）;Tim-4的慢病毒載體（上海吉凱基因）。

1.2 方法

構(gòu)建含Tim-4慢病毒載體的子宮頸癌細(xì)胞系Siha。使用實(shí)時熒光定量PCR法檢測子宮頸上皮永生化細(xì)胞系H8和子宮頸癌細(xì)胞系Siha中Tim-4的表達(dá)水平，用Tim-4的慢病毒載體感染低表達(dá)Tim-4的Siha細(xì)胞系，觀察癌細(xì)胞感染后的Tim-4表達(dá)水平。使用細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)檢測Tim-4對子宮頸癌細(xì)胞系Siha的侵襲與遷移能力的影響。細(xì)胞遷移侵襲小室孔徑為8.0μm，使用稀釋液對上室預(yù)先處理，使Tim-4慢病毒載體和空載體轉(zhuǎn)染Siha細(xì)胞饑餓24h，再制備細(xì)胞懸液，在上室中加入200μL細(xì)胞懸液，再將FBS培養(yǎng)基放入下室。設(shè)置3個平行的觀察孔，24h后使用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察，并拍照。使用蛋白質(zhì)印跡法檢測子宮頸癌細(xì)胞系Siha中Tim-4和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

將數(shù)據(jù)納入SPSS 20.0軟件中分析，計量資料比較采用t檢驗(yàn)，并以（±s）表示，P<0.05為差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tim-4mRNA表達(dá)水平對比

Siha細(xì)胞系中Tim-4mRNA表達(dá)水平為（1.63±0.03），H8細(xì)胞系中Tim-4mRNA表達(dá)水平為（0.97±0.06），P<0.05。見表1。

2.2 細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)結(jié)果對比

細(xì)胞遷移侵襲試驗(yàn)結(jié)果顯示：Tim-4過表達(dá)的Siha細(xì)胞的穿模數(shù)為（102.14±5.14），空載體的穿模數(shù)為（56.34±10.21），P<0.05，見表2;蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示Tim-4增強(qiáng)了EMT蛋白的表達(dá)。

3 討論

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，其病因可能與病毒感染、性行為、分娩次數(shù)等生物學(xué)因素和行為因素有關(guān)。造成宮頸癌患者主要的死亡原因是轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[4]。Tim基因家族是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤、炎癥息息相關(guān)的基因家族，Tim-4作為主要的家庭成員之一，在抗原呈遞細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞中都有表達(dá)。鼠系研究顯示，Tim-4在淋巴細(xì)胞中不表達(dá)，與Tim-1受體結(jié)合刺激T細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫作用[5]。

在Duo Y等[6]相關(guān)研究中，突變體Tim-4分子結(jié)構(gòu)中的Arg-Gly-Asp（RGD）基序可以消除其促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖的作用。Tim-4通過RGD基序與avβ3整合素相互作用，對肺癌細(xì)胞增殖起到促進(jìn)作用。相關(guān)學(xué)者認(rèn)為Tim-4的高表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤疾病的進(jìn)展有著密切的聯(lián)系。早期，該研究小組的研究結(jié)果表明，Tim-4在宮頸癌組織中的表達(dá)相比較鄰近組織較高，而Tim-4高表達(dá)組的存活率與Tim-4低表達(dá)組相比則低得多。提示Tim-4能夠在宮頸癌的轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)中起到重要的作用。其在腫瘤轉(zhuǎn)移中的確切分子機(jī)制目前還未予以明確。在相關(guān)研究中表明。對患者進(jìn)行了檢測Tim-4 mRNA，以體現(xiàn)其在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果表現(xiàn)為Tim-4在宮頸癌細(xì)胞系中表達(dá)相對較高。用Tim-4慢病毒感染表達(dá)量較低的Siha細(xì)胞系，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Tim-4可顯著增強(qiáng)子宮頸癌細(xì)胞系Siha的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。深入研究表明，Tim-4的高表達(dá)能夠?qū)m頸癌細(xì)胞Siha的侵襲和轉(zhuǎn)移能力予以顯著提高。在Jie J等[7]研究中得知，Tim-4轉(zhuǎn)染后Siha細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和神經(jīng)鈣黏附蛋白的表達(dá)明顯高于正常組，但E-鈣黏蛋白的表達(dá)則會出現(xiàn)降低。結(jié)果證明，Tim-4能夠后對質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9和神經(jīng)鈣黏附蛋白的表達(dá)予以增強(qiáng)，且對E-鈣黏蛋白的表達(dá)予以降低。表明Tim-4可經(jīng)對Siha細(xì)胞EMT予以促進(jìn)，提高腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制主要涉及原發(fā)灶向周圍基質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的局部浸潤，且經(jīng)過血液/淋巴管轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處的器官以及組織。此過程主要與上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化及其主要參與分子E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白有關(guān)。在上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，上皮癌細(xì)胞失去E-鈣粘蛋白而獲得神經(jīng)鈣黏附蛋白，因此對上皮組織中細(xì)胞間連接予以破壞，低于腫瘤細(xì)胞的遷移以及侵襲能力予以提高。

有研究發(fā)現(xiàn)，Tim-4能夠通過調(diào)控巨噬細(xì)胞來對抗炎性疾病，而且在NSCLC（非小細(xì)胞肺癌）中的表達(dá)遠(yuǎn)高于機(jī)體正常組織，且與肺癌的發(fā)展呈負(fù)相關(guān)，可以認(rèn)為Tim-4能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和增殖。

本次研究為分析Tim-4促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞侵襲與遷移及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：Siha細(xì)胞系中Tim-4mRNA表達(dá)水平（1.63±0.03）>H8細(xì)胞系（0.97±0.06），P<0.05;Tim-4過表達(dá)的Siha細(xì)胞的穿模數(shù)為（102.14±5.14）>空載體（56.34±10.21），P<0.05;蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示Tim-4增強(qiáng)了EMT蛋白的表達(dá)。在相關(guān)研究中得知，Tim-4可以增強(qiáng)MMP2、MMP9、N-cadherin的表達(dá)，并下調(diào)E-cadherin的表達(dá)，提示Tim-4可能通過促進(jìn)Siha細(xì)胞EMT，促使腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制主要涉及原發(fā)灶局部浸潤到在檢測子宮頸癌細(xì)胞中的Tim-4mRNA的表達(dá)水平時有高表達(dá)結(jié)果，提示過表達(dá)Tim-4可以增強(qiáng)子宮頸癌細(xì)胞系Siha的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，將轉(zhuǎn)移與侵襲過程準(zhǔn)確呈現(xiàn)。

綜上所述，Tim-4能夠促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞侵襲與遷移能力，其機(jī)制為Tim-4促進(jìn)了癌細(xì)胞中的上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。

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