聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞氧化損傷的影響

鄭永征,劉光輝,潘銘東

0引言

眼內(nèi)炎是眼科手術(shù)的嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響視力。術(shù)前結(jié)膜囊內(nèi)聚維酮碘消毒是最為有效地預(yù)防術(shù)后眼內(nèi)炎的方法[1]。目前國內(nèi)外主要使用50g/L聚維酮碘結(jié)膜囊內(nèi)消毒3min[2-3]。但部分患者術(shù)后出現(xiàn)眼干、眼痛等角膜刺激征。2017年《我國白內(nèi)障摘除手術(shù)后感染性眼內(nèi)炎防治專家共識》建議對眼表有問題患者使用10g/L或低于50g/L聚維酮碘結(jié)膜囊消毒[4]。聚維酮碘是廣譜殺菌消毒劑，聚維酮碘殺菌的主要原理是氧化損傷。聚維酮碘在水中能緩慢釋放出游離碘，游離碘可與菌體蛋白的氨基酸結(jié)合使其變性，游離碘還可氧化細(xì)菌蛋白中的SH-、OH-、NH-等活性基團(tuán)和不飽和脂肪酸的雙鍵，從而滅活微生物的活力，殺滅微生物，抑制微生物繁殖、釋放毒素[5]。但聚維酮碘的作用沒有特異性。除微生物外，它還可以作用于正常的角膜上皮細(xì)胞。本研究通過體外培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞，研究聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞氧化損傷的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞來源人角膜上皮細(xì)胞株(Scien Cell，Cat.6510)。

1.1.2試劑及儀器50g/L聚維酮碘(上海利康消毒高科技有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、2.5g/L胰酶(美國HyClone)，CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)，人丙二醛(malondialdehyde,MDA)、人超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)ELISA試劑盒(MDA：CSB-E08557h；SOD：CSB-E08554h，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)，Annexin V-FITC/PI流式試劑盒(美國Beckman Coulter)。酶標(biāo)儀(美國Thermo公司，軟件版本SkanIt Software 5.0 for Microplate Readers RE,ver.5.0.0.42)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)角膜上皮細(xì)胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿，加入含100g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基10mL，置于37℃ 5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2d后換液一次，細(xì)胞融合達(dá)80%時按照1∶3傳代。選取生長良好的對數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及處理

1.2.2.1不同濃度聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞的影響取體外培養(yǎng)的生長良好的角膜上皮細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字法分為：對照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組。低濃度組采用10g/L聚維酮碘孵育3min，中濃度組采用25g/L聚維酮碘孵育3min，高濃度組采用50g/L聚維酮碘孵育3min。然后使用PBS潤洗3次，每次2min，加入含100g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。采用ELISA檢測各組MDA、SOD含量，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，倒置顯微鏡觀察角膜上皮細(xì)胞形態(tài)，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.2.2不同消毒時間聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞的影響取體外培養(yǎng)的生長良好的角膜上皮細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字法分為：對照組、短時間組、中等時間組和長時間組。短時間組采用50g/L聚維酮碘孵育1min，中等時間組采用50g/L聚維酮碘孵育2min，長時間組采用50g/L聚維酮碘孵育3min。然后使用PBS潤洗3次，每次2min，加入含100g/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。采用ELISA檢測各組MDA、SOD含量，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性，倒置顯微鏡觀察角膜上皮細(xì)胞形態(tài)，采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.2.3 ELISA檢測各組MDA含量各組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1mL培養(yǎng)基，每組各設(shè)3個復(fù)孔。按處理因素處理后培養(yǎng)24h，吸走培養(yǎng)液，PBS潤洗3次，每孔加入200μL細(xì)胞裂解液后置于搖床5min，用細(xì)胞刮反復(fù)刮底壁，將所得細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移入冰浴的1.5mL EP管中，4℃ 12 000g離心10min，取上清液作為待測樣品。按試劑盒說明書取100μL細(xì)胞裂解上清液，200μL MDA檢測工作液，混勻后100℃ 15min，冷卻至室溫，1000g離心10min，取200μL上清液到96孔板中，采用532μm波長檢測OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。

1.2.2.4 ELISA檢測各組SOD含量各組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1mL培養(yǎng)基，每組各設(shè)3個復(fù)孔。按處理因素處理后培養(yǎng)24h，吸走培養(yǎng)液，PBS潤洗3次，每孔加入100μL SOD樣品制備液后置于搖床5min，用細(xì)胞刮反復(fù)刮底壁，將所得細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)移入冰浴的1.5mL EP管中，4℃ 12 000g離心10min，取上清液作為待測樣品。按試劑盒說明書取20μL細(xì)胞上清液，160μL WST-8/酶工作液，20μL反應(yīng)啟動工作液，混勻后37℃孵育30min，采用450μm波長檢測OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其含量。

1.2.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞活性檢測時各組細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL培養(yǎng)基，每組各設(shè)3個復(fù)孔。按處理因素處理后培養(yǎng)24h，更換新鮮培養(yǎng)基每孔100μL，每孔再加入10μL CCK-8試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2h后，采用420μm波長檢測OD值。

1.2.2.6 Annexin V-FITC/PI測細(xì)胞凋亡各組細(xì)胞接種于直徑10cm的培養(yǎng)皿，每孔10mL培養(yǎng)基，每組各設(shè)3個復(fù)孔。按處理因素處理后培養(yǎng)24h，吸走培養(yǎng)液，PBS潤洗3次，用2.5g/L胰酶消化為單個細(xì)胞，1000g離心3min。2mL PBS重懸細(xì)胞并且計(jì)數(shù)，使細(xì)胞密度為1×106個/mL，取100μL細(xì)胞懸液加入Annexin V-FITC抗體5μL和PI抗體5μL，避光室溫孵育15min后加入400μL結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測各組細(xì)胞的凋亡率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS22.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步使用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 ELISA檢測聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞MDA含量的影響對照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組中角膜上皮細(xì)胞MDA含量分別為4.182±0.306、9.269±0.106、12.282±0.263、17.733±0.423nmol/L。聚維酮碘濃度越高，角膜上皮細(xì)胞的MDA含量越高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1092.91，P<0.01)。對照組、短時間組、中等時間組和長時間組MDA含量分別為4.195±0.261、12.123±0.557、15.194±0.476、17.583±0.554nmol/L。聚維酮碘消毒時間越長，角膜上皮細(xì)胞的MDA含量越高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=454.51，P<0.01)。

2.2 ELISA檢測聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞SOD含量的影響對照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組中角膜上皮細(xì)胞SOD含量分別為7.132±0.370、6.815±0.185、6.422±0.338、5.866±0.234U/mg。聚維酮碘濃度越高，角膜上皮細(xì)胞的SOD含量越低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.481，P<0.01)。對照組、短時間組、中等時間組和長時間組SOD含量分別為7.148±0.316、6.320±0.318、6.050±0.196、5.832±0.254U/mg。聚維酮碘消毒時間越長，角膜上皮細(xì)胞的SOD含量越低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.112，P<0.01)。

2.3 CCK-8法檢測聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞活性的影響對照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組中角膜上皮細(xì)胞活力分別為1.269±0.055、1.192±0.061、1.042±0.077、0.892±0.038。聚維酮碘濃度越高，角膜上皮細(xì)胞的活性越低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=23.547，P<0.01)。

圖1 不同濃度聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞的影響(×200) A：對照組；B：低濃度組；C：中濃度組；D：高濃度組。

圖2 不同消毒時間聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞的影響(×200) A：對照組；B：短時間組；C：中等時間組；D：長時間組。

對照組、短時間組、中等時間組和長時間組中角膜上皮細(xì)胞活力分別為1.260±0.024、1.119±0.043、1.001±0.042、0.876±0.062。聚維酮碘消毒時間越長，角膜上皮細(xì)胞的活性越低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=39.816，P<0.01)。

2.4倒置顯微鏡觀察聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞的影響不同濃度聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞的影響見圖1。對照組角膜上皮細(xì)胞呈多角形，排列規(guī)則，透光性好；聚維酮碘消毒后部分角膜上皮細(xì)胞變性，活性下降，出現(xiàn)皺縮，透光性降低，甚至出現(xiàn)凋亡小體，聚維酮碘濃度越高，變性的角膜上皮細(xì)胞越多。不同消毒時間聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞的影響見圖2。對照組角膜上皮細(xì)胞呈多角形，排列規(guī)則，透光性好；聚維酮碘消毒后部分角膜上皮細(xì)胞變性，活性下降，聚維酮碘消毒時間越長，變性的角膜上皮細(xì)胞越多。

2.5聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞凋亡率的影響對照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組中角膜上皮細(xì)胞凋亡率分別為3.35%±0.13%、6.50%±0.35%、8.41%±0.10%、15.33%±0.27%。聚維酮碘濃度越高，角膜上皮細(xì)胞的凋亡率越高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1386.175，P<0.01)。對照組、短時間組、中等時間組和長時間組中角膜上皮細(xì)胞凋亡率分別為3.37%±0.28%、8.12%±0.48%、11.31%±0.37%、15.50%±0.271%。聚維酮碘消毒時間越長，角膜上皮細(xì)胞的凋亡率越高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=598.196，P<0.01)。

3討論

術(shù)前殺滅結(jié)膜囊細(xì)菌是預(yù)防術(shù)后眼內(nèi)炎的重要措施。術(shù)前滴用抗生素眼液，術(shù)前用等滲鹽水或抗生素沖洗結(jié)膜囊，術(shù)前結(jié)膜囊內(nèi)聚維酮碘消毒均可降低結(jié)膜囊細(xì)菌數(shù)量，但術(shù)前結(jié)膜囊內(nèi)聚維酮碘消毒是最為有效的方法[1]。聚維酮碘是廣譜殺菌消毒劑，可直接殺滅細(xì)菌、病毒、真菌、芽孢與原蟲。大多數(shù)細(xì)菌30s內(nèi)可殺滅[5]。聚維酮碘殺菌的主要原理是氧化損傷。聚維酮碘在水中能緩慢釋放出游離碘，游離碘可氧化菌體蛋白的氨基酸使其變性[5]。聚維酮碘不含酒精，對皮膚黏膜刺激小，是黏膜的首選消毒劑。

聚維酮碘的作用沒有特異性。除微生物外，它還可以作用于正常細(xì)胞。高濃度的聚維酮碘對組織細(xì)胞有一定的毒性，聚維酮碘結(jié)膜囊消毒時，結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞直接接觸聚維酮碘，局部濃度越高，細(xì)胞毒性也越大。我們研究發(fā)現(xiàn)聚維酮碘消毒后角膜上皮細(xì)胞的MDA含量升高，SOD含量降低，細(xì)胞活性降低，部分角膜上皮細(xì)胞變性，出現(xiàn)皺縮，透光性降低，甚至出現(xiàn)凋亡小體，凋亡率增高。正常結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧系統(tǒng)處于相對平衡狀態(tài)，體內(nèi)產(chǎn)生的自由基會被抗氧系統(tǒng)及時淬滅，維持體內(nèi)自穩(wěn)狀態(tài)[6]。聚維酮碘結(jié)膜囊消毒時，游離碘在氧化細(xì)菌蛋白的同時，也可以氧化結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞中的蛋白，甚至細(xì)胞核內(nèi)DNase活性。這時突然產(chǎn)生的大量自由基超過機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的清除能力，結(jié)膜和角膜上皮細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。細(xì)胞膜或細(xì)胞核模上的磷脂、酶和膜受體上的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)可因氧化應(yīng)激產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物。MDA是細(xì)胞膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，MDA含量升高影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物及線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性，激活P38、JNK、CDC42、JAK、PI3K/Akt、自噬等信號途徑，進(jìn)而轉(zhuǎn)錄NF-κB、STAT和EGR1，激活細(xì)胞核內(nèi)DNase活性引起DNA損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-9]。SOD是體內(nèi)的一種抗氧化金屬酶，人體內(nèi)有Cu/Zn-SOD和Mn-SOD兩類。SOD通過金屬離子如Mn+1(氧化態(tài))和Mn(還原態(tài))的交替電子得失實(shí)現(xiàn)催化作用。超氧陰離子自由基與金屬離子形成配合物，Mn+1被還原為Mn，同時生成氧，Mn又被HO2氧化為Mn+1，同時生成過氧化氫，SOD又被氧化為初始氧化態(tài)的SOD。最后，H2O2在過氧化氫酶的作用下，被催化分解為水和氧。SOD催化超氧陰離子自由基歧化生成氧和過氧化氫，消除體內(nèi)超氧自由基，在機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起到至關(guān)重要的作用，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷，減少由于氧化損傷引起的細(xì)胞凋亡[6，10-12]。聚維酮碘消毒后角膜上皮細(xì)胞的MDA含量升高，SOD含量降低，提示聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞也會產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞活力下降，細(xì)胞凋亡增加。Chou等[5]研究發(fā)現(xiàn)聚維酮碘可抑制人角膜纖維細(xì)胞和人角膜上皮細(xì)胞中的線粒體脫氫酶和細(xì)胞內(nèi)酯酶活性，包括DNase活性。盡管細(xì)胞形態(tài)沒有改變，但細(xì)胞生長受到抑制并且細(xì)胞膜完整性被破壞，細(xì)胞對外部刺激沒有反應(yīng)，認(rèn)為聚維酮碘通過固定而不是細(xì)胞凋亡或壞死導(dǎo)致人角膜纖維細(xì)胞和人角膜上皮細(xì)胞死亡。

我們研究還發(fā)現(xiàn)聚維酮碘消毒后對角膜上皮細(xì)胞的氧化損傷呈濃度和時間依賴性。聚維酮碘濃度越高，角膜上皮細(xì)胞的MDA含量越高，SOD含量越低，細(xì)胞活性越低，凋亡率越高。聚維酮碘消毒時間越長，角膜上皮細(xì)胞的MDA含量越高，SOD含量越低，細(xì)胞活性越低，凋亡率越高。這與Shibata等[13]報(bào)道的聚維酮碘對角膜上皮具有一定細(xì)胞毒性，且其毒性呈濃度依賴性一致。增加聚維酮碘濃度和延長消毒時間會增加碘向角膜的滲透量，并可能導(dǎo)致角膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞的毒性，結(jié)膜囊內(nèi)殘留的聚維酮碘可能進(jìn)入前房，損傷角膜內(nèi)皮細(xì)胞。Jiang等[14]通過角膜熒光染色和角膜厚度測量儀檢測不同濃度聚維酮碘對角膜的毒性，研究發(fā)現(xiàn)50g/L和25g/L的聚維酮碘結(jié)膜囊消毒可引起嚴(yán)重的上皮損傷，20g/L和15g/L的聚維酮碘前房注射后可引起明顯的角膜水腫、角膜增厚。認(rèn)為5g/L或10g/L聚維酮碘結(jié)膜囊消毒是安全可行的。封艷等[15]報(bào)道2.5g/L聚維酮碘已可達(dá)到消毒作用，較5g/L聚維酮碘相比患者主觀舒適度更好，球結(jié)膜充血、角膜上皮損傷更輕。樊芳等[16]報(bào)道50g/L聚維酮碘結(jié)膜囊沖洗30s能有效減少結(jié)膜囊細(xì)菌，對眼表的損傷小，白內(nèi)障術(shù)前結(jié)膜囊消毒是安全有效。Alp等[17]將50g/L和100g/L聚維酮碘注入前房一滴，均可引起嚴(yán)重的角膜毒性，認(rèn)為聚維酮碘結(jié)膜囊消毒必須防止聚維酮碘滲漏進(jìn)入前房。張碩基等[18]報(bào)道白內(nèi)障摘除術(shù)前使用50g/L聚維酮碘結(jié)膜囊消毒2.0min或3.5min較30s或1.0min更有效減少術(shù)前結(jié)膜囊細(xì)菌數(shù)量，消毒2.0min術(shù)后1h的角膜上皮損傷好于3.5min，認(rèn)為50g/L聚維酮碘結(jié)膜囊消毒2.0min是安全有效地預(yù)防感染措施。

綜上所述，聚維酮碘對角膜上皮細(xì)胞有氧化損傷作用，損傷呈濃度和時間依賴性。在保證結(jié)膜囊滅菌效果的情況下，適當(dāng)降低使用濃度或消毒時間，可以有效減少角膜上皮損傷。

2中國醫(yī)師協(xié)會眼科醫(yī)師分會, 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會醫(yī)院感染專業(yè)委員會, 中華預(yù)防醫(yī)學(xué)會消毒分會, 等. 我國眼科手術(shù)管理、感染控制、消毒滅菌指南(一). 中華眼科雜志2016;52(3)：167-173