北部灣潿洲島紅色赤潮藻的分子鑒定

徐軼肖 , 何喜林 , 張 騰 , 趙志娟, 韋光領

(1. 南寧師范大學 北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點實驗室, 廣西 南寧530001; 2. 南寧師范大學 廣西地表過程與智能模擬重點實驗室, 廣西 南寧 530001; 3. 南寧師范大學 環(huán)境與生命科學學院, 廣西 南寧530001)

紅色赤潮藻(Akashiwo sanguinea)原名紅色裸甲藻(Gymnodinium sanguineum), 中文又譯作血紅哈卡藻, 隸屬于甲藻門(Dinophyta)、甲藻綱(Dinophyceae)、裸甲藻目(Gymnodiniales)、裸甲藻科(Gymnodiniaceae)、赤潮藻屬(Akashiwo), 是廣溫、廣鹽性種類, 藻細胞呈五角形, 可形成休眠孢子, 具有分布廣的特點[1]。2000 年Daugbjerg[2]等借助分子生物學方法指出紅色赤潮藻與其他裸甲藻進化關系較遠, 因此獨立出來成立1 個新屬, 即赤潮藻屬(Akashiwo), 并把該種命名為Akashiwo sanguinea。目前在赤潮藻屬下尚未命名其他新種, 所以普遍認為赤潮藻屬只有1 種, 即紅色赤潮藻。

紅色赤潮藻赤潮暴發(fā)時海水顏色為褐色或紅褐色, 迄今沒有該藻產(chǎn)毒的報道, 但是紅色赤潮藻大量繁殖引起的赤潮能夠引發(fā)魚蝦類、海洋無脊椎生物的大量死亡[3]。1922 年在日本Kozusa-ura Gokasho Bay 首次記錄到由紅色赤潮藻引起的大規(guī)模赤潮[4],隨后在英國、新西蘭、美國大西洋和太平洋沿岸也發(fā)現(xiàn)該藻赤潮事件。1998 年8 月中旬～9 月中旬在中國煙臺四十里灣第一次記錄到由紅色赤潮藻暴發(fā)的大規(guī)模赤潮, 面積約100 km2[5], 之后在中國南方沿海多處出現(xiàn), 夏秋季多發(fā), 現(xiàn)已成為中國東南沿海常見的赤潮種[6-7]。

近年來, 北部灣藻華發(fā)生頻次、規(guī)模、有害赤潮種類呈增加趨勢[8], 特別是北部灣經(jīng)濟區(qū)開發(fā)后, 藻華發(fā)生的種類發(fā)生了明顯變化。2000 年前, 藻華種主要為藍藻門(Cyanophyta)的微囊藻(Microcystis),2001～2010 年間為藍藻、甲藻(Dinophyta)和硅藻(Bacillariophyta), 2011 年至今主要為定鞭藻門(Haptophyta)的球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)[9]。但2016 年5 月北部灣欽州海域曾發(fā)生約20 km2的紅色赤潮藻赤潮[10], 同一時間在防城港海域發(fā)現(xiàn)紅色赤潮藻水色異常事件, 細胞密度高達3.44×105個/L[11]。遺憾的是, 兩次事件均只是文字報道, 缺乏形態(tài)學和分子生物學數(shù)據(jù)。由于紅色赤潮藻活細胞體形易變, 固定后細胞易被破壞而難以識別其形態(tài), 是裸甲藻中較難鑒定的種類之一。分子標記技術的發(fā)展,使海洋微藻鑒定從形態(tài)學上升到DNA 分子水平, 基于SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 的DNA 序列鑒定及分子系統(tǒng)學研究是區(qū)分變種、地理株、物種的有效手段, 前人已成功將這些方法應用于紅色赤潮藻的分子鑒定中[2,12-13]。

潿洲島作為北部灣最大的島嶼, 是中國地質年齡最年輕的火山島, 因其獨特的地勢特征及民俗風情, 有著非常高的旅游價值和地位[14]。但潿洲島也是北部灣藻華事件的“熱點”區(qū)域, 1985—2017 年,北部灣發(fā)生的 39 次藻華中, 潿洲島占了 15 次(38.5% )[9]。藻華可能破壞海洋漁業(yè)資源和海洋生態(tài)環(huán)境, 帶來嚴重的經(jīng)濟損失, 考慮到紅色赤潮藻是世界分布種, 中國沿海多個海域包括北部灣都曾發(fā)生過由該藻引起的赤潮事件, 有必要弄清分離自潿洲島形態(tài)疑似紅色赤潮藻的種類。作者對潿洲島海域非赤潮期間的6 株疑似紅色赤潮藻種應用SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 特征序列進行分子鑒定, 結果可為今后北部灣及潿洲島赤潮和海洋環(huán)境安全研究提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 藻種來源

2019 年6 月非赤潮期間, 在廣西潿洲島周圍S1～S8 站位采集海水(圖1), 具體樣品采集、貯存、運輸參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB17378.1—2007)[15]。樣品帶回實驗室, 在倒置顯微鏡(TS100-Nikon)下,根據(jù)文獻報道的紅色赤潮藻典型形態(tài)特征[16]: 細胞長55 μm～77 μm、寬40 μm～50 μm、上錐部鐘狀、下錐部具兩只底角、具橫溝和縱溝、縱溝未伸入上錐部、細胞核位于細胞中間。用毛細管分離法從水樣中挑選疑似紅色赤潮藻藻株洗滌分離并培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為減富K 培養(yǎng)基[17]、22℃、光強150 μE/(m2/s)、光暗比12 h︰12 h。本研究共在S2 和S7 站位分離獲得6 株疑似紅色赤潮藻純培養(yǎng)株, 編號為S2-2019-Ak-1、S2-2019-Ak-2、S2-2019-Ak-3、S2-2019-Ak-4、S7-2019-Ak-1、S7-2019-Ak-2。

圖1 采集地點Fig. 1 Sampling sites

1.2 藻體形態(tài)觀察

取指數(shù)生長期的疑似紅色赤潮藻細胞藻液。(1)因紅色赤潮藻為裸甲藻中的一種, 易變形, 不適合固定后觀察, 故直接吸取適量藻液在載玻片上, 光學顯微鏡(TS100, Nikon)下觀察活體藻細胞并用拍照軟件拍照(NIS-Elements D 4.50.00); (2)吸取適量藻液在載玻片上, 并加入適量的SYBR Green1 熒光染料(上海源葉生物科技有限公司)對細胞核染色, 在熒光顯微鏡(NI-SS, Nikon)下觀察并拍照。

1.3 DNA 的提取和擴增

取指數(shù)生長期藻液, 7 000g/min 離心1 min, 倒掉上清液, 運用杭州博日BioFastSpin 植物基因組DNA 提取試劑盒對紅色赤潮藻提取DNA, 以提取的總DNA 為模板進行SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 特征片段PCR擴增, 具體引物序列見表1, 其中ITS 為簡并引物。PCR反應程序: 94℃預變性5 min; 然后94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共35 個循環(huán); 最后72℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物送到北京擎科新業(yè)生物技術有限公司測序, 共獲得6 條SSU rDNA、6 條LSU rDNA、6 條ITS序列, 所有序列均已提交至GenBank(表2)。

表1 引物序列信息Tab. 1 Primer sequence information

表2 紅色赤潮藻SSU rDNA、LSU rDNA 和ITS 基因序列Tab. 2 SSU rDNA, LSU rDNA and ITS sequences of Akashiwo sanguinea

續(xù)表

1.4 數(shù)據(jù)分析

將獲得的6 株疑似紅色赤潮藻LSU rDNA、SSU rDNA、ITS 基因序列與美國國家生物技術信息中心(NCBI)的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST同源性分析, 下載同源性較高的序列作為參考序列, 其中藻株CCMP1593、CCMP1837、CCMP13215、GnSg02_5、GnSg03_5 同時具有上述3 種序列(表2)。應用軟件MEGA7 中的最大似然法(Maximum Likelihood, ML)構建系統(tǒng)發(fā)育樹并計算序列間遺傳距離。ML 分析時采用啟發(fā)式搜索(heuristic), 建樹進行1 000 次隨機重復取樣, 通過自展分析檢驗分支置信度, 抽樣自展值>90%時為極顯著, 70%～90%為較顯著, <70%為不顯著。

2 結果

2.1 藻體形態(tài)特征

光學顯微鏡下觀察到潿洲島疑似紅色赤潮藻株營單細胞游泳生活, 游動時像落葉一樣飄旋。藻細胞長69 ±4.2 μm、寬54 ±5.7 μm(n=40); 細胞中央處最寬, 具橫溝和縱溝, 橫溝較窄分布在中央, 把細胞分為上錐部和下錐部兩部分, 上下錐部長度近似,縱溝未侵入上錐部; 上錐部呈鐘狀, 下錐部含有兩個底角, 分為兩葉呈W 形; 光學顯微鏡下隱約可見位于細胞中央的細胞核(淺色區(qū))(圖2A)。細胞熒光染色后, 位于細胞中央的圓形細胞核清晰可見(圖2B)。上述特征與文獻中描述的紅色赤潮藻形態(tài)特征相符[16]。

圖2 北部灣潿洲島疑似紅色赤潮藻S2-Ak-2019-1 的光學顯微鏡圖(A)和熒光顯微鏡圖(B)Fig. 2 Light microscopy (A) and fluorescence microscopy images (B) of putative A. sanguinea from Weizhou Island, Beibu Gulf

2.2 PCR 擴增與測序

以藻株S2-2019-Ak-1、S2-2019-Ak-2、S2-2019-Ak-3、S2-2019-Ak-4、S7-2019-Ak-1、S7-2019-Ak-2 的DNA為模板進行PCR 擴增獲得SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 序列電泳圖(圖3), 3 種序列的電泳圖均出現(xiàn)1 條明亮條帶, 表明PCR 擴增正常, 測序所得序列長度分別約為1.7 kb、1.3 kb 和700 bp。

圖3 疑似紅色赤潮藻SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 序列電泳圖Fig. 3 Electrophoresis map of LSU rDNA, SSU rDNA and ITS sequences of putative Akashiwo sanguinea M. Marker DL2000, 1-6. S2-2019-Ak-1、S2-2019-Ak-2、S2-2019-Ak-3、S2-2019-Ak-4、S7-2019-Ak-1、S7-2019-Ak-2

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以球形棕囊藻為外類群, 構建SSU rDNA、LSU rDNA 和ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹, 發(fā)現(xiàn)北部灣潿洲島6 株疑似紅色赤潮藻與世界不同海域的紅色赤潮藻聚成一大分支, 自展值分別為99、100 和100(圖4—圖6)。上述系統(tǒng)樹主要包含3 個分支: (1) 本文6 株紅色赤潮藻與韓國安山海域的GSW0207 藻株(SSU)、新加坡GT6 藻株(LSU)、中國廈門港GSXM02 藻株(ITS)聚在一起, 同源性較高, 自展支持值分別為93、99、84; (2) 美國海域的紅色赤潮藻藻株聚成一小支, 自展值亦較高, 分別為99、99、90; (3) 其他亞洲韓國、日本和歐洲挪威、法國等海域的藻株聚成一小支, 自展值為79、92、99(圖4—圖6)。裸甲藻科內(nèi), 與紅色赤潮藻親緣關系最近的藻屬是環(huán)溝藻屬(Gyrodinium),其次是裸甲藻屬(Gymnodinium)和凱倫藻屬(Karenia),而與旋溝藻屬(Cochlodinium)的親緣關系較遠(圖4—圖6)。

圖4 基于SSU rDNA 序列構建的疑似紅色赤潮藻系統(tǒng)發(fā)育樹(最大似然法)Fig. 4 The Maximum Likelihood (ML) phylogenetic tree based on SSU rDNA sequences of putative Akashiwo sanguine

遺傳距離計算得出, 北部灣潿洲島六株紅色赤潮藻株的SSU rDNA、LSU rDNA、ITS 序列之間的遺傳距離分別為0.000、0.000、0.001～0.005, 它們與親緣關系最近的韓國安山紅色赤潮藻株GSW0207(圖4)、新加坡株GT6(圖5)和中國廈門港株GSXM02(圖6)遺傳距離分別為0.001、0.003 和0.045, 而與世界其他海域的紅色赤潮藻SSU、LSU、ITS 遺傳距離則分別為0.001～0.008、0.003～0.025 和0.045～0.406。上述3 個序列的紅色赤潮藻種內(nèi)遺傳距離(包括潿洲島株)為0.000～0.010、0.000～0.028、0.000～0.406, 明顯小于該藻與裸甲藻科下近緣藻屬環(huán)溝藻屬、裸甲藻屬、凱倫藻屬、旋溝藻屬間的SSU、LSU、ITS 遺傳距離 0.032～0.072、0.165～0.222 和0.589～1.559。因此, 系統(tǒng)發(fā)育樹和遺傳距離結果均確認本文研究的6 株潿洲島疑似紅色赤潮藻株屬于紅色赤潮藻。

圖5 基于LSU rDNA 序列構建的疑似紅色赤潮藻系統(tǒng)發(fā)育樹(最大似然法)Fig. 5 The Maximum Likelihood (ML) phylogenetic tree based on LSU rDNA sequences of putative Akashiwo sanguine

3 討論

紅色赤潮藻是一種混合營養(yǎng)型甲藻, 目前雖尚無產(chǎn)毒報道, 但大量研究表明該藻爆發(fā)的赤潮能使大量浮游植物和水生生物死亡[21-22], 從而破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。北部灣位于中國南海西北部, 是一個半封閉海灣, 水體交換能力和自凈能力差[23], 一旦發(fā)生赤潮, 很可能導致嚴重海洋災害。掌握紅色赤潮藻客觀準確的分子序列特征及該類群的起源和生理特性是防治該藻災害的關鍵。本研究對采自北部灣潿洲島的疑似紅色赤潮藻株進行形態(tài)學特征和目的基因 SSU rDNA、LSU rDNA 和ITS 分析, 判定6 株藻均為紅色赤潮藻, 結果將為北部灣海域赤潮藻種的來源與組成, 及赤潮的發(fā)生與管理提供基礎信息。

總的來說, 源自同一或鄰近海域的紅色赤潮藻株序列差異小, 親緣關系較近; 而地理位置相距較遠的差異大, 親緣關系較遠。紅色赤潮藻北部灣潿洲島株與亞洲海域來源的韓國安山株、新加坡株、中國廈門港株親緣關系較近, 而與地理位置較遠的美國切薩皮克海灣、美國哈靈頓海峽、美國納拉干西特灣株紅色赤潮藻親緣關系較遠。但研究也發(fā)現(xiàn)北部灣潿洲島株LSU rDNA 與韓國長木海域株親緣關系較遠, 反而與地理分布較遠的美國株親緣關系更近, 類似現(xiàn)象在他人研究中[24-25]也有報道, 這可能反映了紅色赤潮藻不同地理株在自然或人為因素影響下的入侵。3 種序列遺傳距離中, SSU rDNA 最為保守, 而ITS 序列相對于SSU rDNA 和LSU rDNA序列有更大的堿基突變速率, 例如紅色赤潮藻北部灣潿洲島株與CCMP1837 藻株SSU rDNA 和LSU rDNA 序列核苷酸差異值分別為0.007 和0.022, 而與ITS 序列核苷酸差異值為0.251～0.266。因此, ITS 區(qū)域進化速率較快, 對鑒定紅色赤潮藻不同株的親緣關系有較好的參考。

圖6 基于ITS 序列構建的疑似紅色赤潮藻系統(tǒng)發(fā)育樹(最大似然法)Fig. 6 The Maximum Likelihood (ML) phylogenetic tree based on ITS sequences of putative Akashiwo sanguine

本研究發(fā)現(xiàn)紅色赤潮藻種內(nèi)遺傳距離超過了其他一些微藻, 如三角棘原甲藻(Prorocentrum triestinum)和纖細原甲藻(Prorocentrum gracile)的 SSU rDNA序列遺傳距離為 0.001, 與慢原甲藻(Prorocentrum rhathymum)的遺傳距離為 0.006[26], 南極棕囊藻(Phaeocystis antarctica)與球形棕囊藻SSU rDNA 遺傳距離為0.008[27], 而紅色赤潮藻SSU rDNA 種內(nèi)遺傳距離最大值為0.010(韓國安山GSW0207 株與美國納拉干西特灣CCMP1593 株), 本文6 株紅色赤潮藻與美國哈靈頓海峽株CCMP1837、美國納拉干西特灣株CCMP1593 的SSU rDNA 遺傳距離也達到了0.008。類似地, 本文紅色赤潮藻LSU rDNA 種內(nèi)遺傳距離最大值0.028, 大于鏈狀亞歷山大藻(Alexandrium catenella)與塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarense)的LSU rDNA 序列遺傳距離0.005[28], ITS 遺傳距離0.000～0.406 與陳月琴[29]等得出的微藻類ITS 序列核苷酸種間差異應大于0.2 也不一致。結合圖4—圖6的系統(tǒng)進化樹拓撲結構, 紅色赤潮藻種下仍具有3個分支, 分支具有較好的自舉值79～99 支持, 且同一地理相近的藻株更易聚成一支, 說明在分子生物學鑒定上, 紅色赤潮藻各個株的遺傳差異較大, 赤潮藻屬下紅色赤潮藻存在進一步定義不同種的可能,但不同分支的紅色赤潮藻究竟是否有可能劃分為不同種, 還需要開展更深入的研究, 尤其需要形態(tài)學等表觀特征的驗證。

4 結論

作者對在北部灣潿洲島采集到的6 株疑似紅色赤潮藻株進行了種類鑒定, 光學顯微鏡和熒光顯微鏡觀察其與赤潮藻屬下的種類紅色赤潮藻相一致。應用SSU rDNA、LSU rDNA 和ITS 基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹, 確定北部灣潿洲島6 株藻均為紅色赤潮藻。它們與來源自亞洲海域的韓國安山株、新加坡株、中國廈門港株序列差異小, 親緣關系較近相近,而與地理位置相距較遠的紅色赤潮藻株序列差異大,親緣關系較遠。

致謝: 感謝西班牙藻類學家Santiago Fraga 對本文討論部分的建議。