不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)的影響

陳映彤，于錫宏,2#，白國梁，張雪，劉漢兵，趙恒田，蔣欣梅,2*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)試驗(yàn)室，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150030；2.林下經(jīng)濟(jì)資源研發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，哈爾濱 150040；3.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150040)

遼東楤木(Araliaelata)也稱刺嫩芽、刺老芽，是五加科楤木屬植物，主要分布在我國東北部地區(qū)。遼東楤木是一種重要的藥食同源植物，食用的嫩芽中含有多種氨基酸、維生素及大量的微量元素，能夠?yàn)槿梭w提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)具有很好的保健作用，具有活血化瘀、抗癌等功效，被譽(yù)為“山野菜之王”[1]。隨著人們對這種藥食同源類植物的需求升高，很多野生資源遭到破壞，大面積的遼東楤木資源消失，人工栽培成為解決遼東楤木資源匱乏的主要途徑。然而，很多野生資源常常因種胚發(fā)育不完全，具有很強(qiáng)的休眠特性[2]，遼東楤木也如此，人工栽培利用種子繁殖的過程中，解除種子休眠是首要的問題。打破種子休眠有很多種方法，包括低溫層積處理、外源激素處理、光照、超聲波及機(jī)械處理等[3]。生產(chǎn)中常常在上凍前采用低溫層積處理——即沙藏方式，第二年早春取出后進(jìn)行播種育苗；采用變溫層積盡管可以有效提高遼東楤木種胚的后熟，但依然存在發(fā)芽率較低且發(fā)芽持續(xù)時(shí)間長的問題[4]。赤霉素作為一種生長素，是植物生長中最重要的物質(zhì)之一，赤霉素含量降低往往意味著植株體的休眠甚至死亡，特別是對于種子來說，赤霉素含量的高低影響著種子內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸?shù)乃俣龋⑶矣绊懪叩姆只蜕L，適宜濃度的赤霉素對種子的萌發(fā)具有促進(jìn)作用[5]。關(guān)于外源施用赤霉素對遼東楤木種子萌發(fā)方面的研究鮮有報(bào)道，為此，本試驗(yàn)通過研究不同濃度外源赤霉素處理變溫層積后的遼東楤木種子，擬明確種子萌發(fā)過程中內(nèi)含物質(zhì)的變化規(guī)律，旨在為探究遼東楤木種子萌發(fā)機(jī)理提供理論依據(jù)，同時(shí)為遼東楤木種苗生產(chǎn)選用適宜的赤霉素濃度提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本材料選用當(dāng)年飽滿成熟的遼東楤木種子，來自于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

將采集的遼東楤木種子洗凈，用水浮法去除癟粒。浸種48 h后選取籽粒飽滿種子進(jìn)行變溫層積處理(沙藏層積用的細(xì)河沙經(jīng)高溫滅菌)，即將層積的遼東楤木種子放在(12±1)℃下恒溫箱中處理90 d、(4±1)℃下處理60 d。將經(jīng)變溫層積處理后的種子采用不同濃度外源赤霉素(GA3)浸種12 h后放在20 ℃條件下催芽。外源赤霉素設(shè)置5個(gè)濃度水平，分別為100、150、200、250、300 mg/kg(代碼分別為T100、T150、T200、T250、T300)，以清水作為對照(CK)。

分別在催芽后的第10 d、30 d、50 d時(shí)，對種子中關(guān)鍵內(nèi)含物質(zhì)含量進(jìn)行測定，其中可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[6]、可溶性蛋白質(zhì)含量測定采用 G-250 法[6]、過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[7]、過氧化氫酶(CAT)活性測定采用高錳酸鉀滴定法[7]、超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用 NBT 法[7]、內(nèi)源激素(赤霉素、脫落酸)含量測定采用高效液相色譜法(HPLc)測定[6]，同時(shí)隨機(jī)選取100粒種子測定發(fā)芽率。3次重復(fù)。

采用Excel 2010和SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子發(fā)芽率的影響

利用赤霉素處理變溫層積處理后的遼東楤木種子可以顯著提高其發(fā)芽率，赤霉素一定濃度范圍內(nèi)，發(fā)芽率隨著濃度的增加而增加。催芽后10 d開始陸續(xù)發(fā)芽；催芽后30 d開始，不同濃度赤霉素處理的遼東楤木種子發(fā)芽率顯著提高，其中催芽后30 d時(shí)的發(fā)芽率盡管在25.67 %～27.99%，但赤霉素濃度在200～300 mg/kg的3個(gè)處理(T200、T250、T300)與T150之間均差異不顯著，但顯著高于T100處理；隨著催芽時(shí)間延長，在催芽后50 d時(shí)各個(gè)處理發(fā)芽率均達(dá)到了50%以上，此時(shí)發(fā)芽率隨著赤霉素濃度的增加而顯著增加，濃度達(dá)到200 mg/kg時(shí)(T200)發(fā)芽率最高，達(dá)到了66.22%，比對照CK提高了 18.74 %，而后再隨赤霉素濃度增加而發(fā)芽率顯著降低。

圖1 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子發(fā)芽率的影響不同字母表示P<0.05水平(n=3)差異顯著。下同。

2.2 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由表1可知，隨著遼東楤木種子的萌發(fā)，可溶性糖含量逐漸降低而可溶性蛋白含量逐漸增加?？扇苄蕴呛吭诖哐亢笄?0 d變化不明顯，進(jìn)入50 d時(shí)，隨赤霉素濃度的增加，可溶性糖含量表現(xiàn)出先下降再上升趨勢; 可溶性蛋白質(zhì)含量在催芽后前10 d各個(gè)處理與對照之間均差異不顯著，催芽后30 d和50 d時(shí)，均隨赤霉素濃度的增加表現(xiàn)出先升高后下降趨勢；其中200 mg/kg赤霉素處理(T200)下的可溶性糖含量在催芽后50 d最低，與其他處理及對照之間差異顯著；T200處理下的可溶性蛋白質(zhì)含量在催芽后30 d和50 d均最高，且與其他處理及對照之間差異顯著。

表1 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響

2.3 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中相關(guān)酶活性的影響

由圖2、3、4可知，隨著處理時(shí)間的增加，遼東楤木種子逐漸萌發(fā)過程中，過氧化物酶活性(POD)、過氧化氫酶活性(CAT)和超氧化物歧化酶活性(SOD)均逐漸升高。對于POD和SOD酶活性，赤霉素處理對遼東楤木催芽前30 d影響不大，均表現(xiàn)為各個(gè)處理以及對照之間均差異不顯著，催芽后50 d時(shí)兩種酶活性隨著赤霉素濃度的增加表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，其中T200處理處于高水平；對于CAT酶活性，赤霉素處理對遼東楤木催芽前10 d影響不大，催芽后30 d和50 d，隨著赤霉素濃度的增加均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，其中T200處理處于較高水平。

圖2 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中過氧化物酶活性的影響

圖3 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中超氧化物歧化酶活性的影響

圖4 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中過氧化氫酶活性的影響

2.4 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中內(nèi)源激素含量的影響

由表2可知，隨著遼東楤木種子的萌發(fā)，赤霉素含量逐漸升高，而脫落酸含量逐漸降低。赤霉素含量在催芽后10 d變化不明顯，催芽后30 d和50 d時(shí)，隨著外源赤霉素濃度的增加，均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢；脫落酸含量在催芽后前10 d和30 d各處理及對照間均差異不顯著，在催芽后50 d時(shí)，隨著赤霉素濃度升高，脫落酸含量表現(xiàn)為先下降后上升的趨勢；其中T200處理下赤霉素含量在催芽后30 d和50 d均最高，而脫落酸含量在催芽后50 d則最低，與對照之間均達(dá)到了顯著水平。

表2 不同濃度赤霉素處理對遼東楤木種子萌發(fā)過程中赤霉素含量和脫落酸含量的影響

2.5 遼東楤木種子發(fā)芽率與內(nèi)含物變化相關(guān)性分析

表3 遼東楤木種子萌發(fā)率與內(nèi)含物變化相關(guān)性分析

對遼東楤木種子發(fā)芽率與內(nèi)含物含量之間進(jìn)行相關(guān)性分析表明(見表3)：遼東楤木種子發(fā)芽率與可溶性糖、脫落酸呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與可溶性蛋白質(zhì)含量、赤霉素含量以及3種酶活性(過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶)呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。可溶性糖與可溶性蛋白質(zhì)、赤霉素、3種酶活性均呈極顯著負(fù)相關(guān)性，與脫落酸呈顯著正相關(guān)關(guān)系。可溶性蛋白質(zhì)與3種酶活性及赤霉素呈極顯著正相關(guān)，而與脫落酸呈極顯著負(fù)相關(guān)。3種酶之間以及3種酶與赤霉素之間均呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

種子休眠的類型多且復(fù)雜，大致為2種情況，一種是種子已經(jīng)成熟，但由于外界條件不適宜而不得不暫停萌發(fā)；另一種是種子的生理后熟和形態(tài)后熟未完成發(fā)育或受內(nèi)源激素物質(zhì)抑制而無法萌發(fā)[8]。遼東楤木種子萌發(fā)困難往往是由于其種胚發(fā)育不完全引起的休眠造成的。本試驗(yàn)采用12 ℃下90 d結(jié)合4 ℃下60 d的變溫層積處理促進(jìn)遼東楤木種胚后熟，經(jīng)顯微觀察層積后遼東楤木的種胚占有率達(dá)到46%，但從發(fā)芽持續(xù)時(shí)間來看，在催芽后50 d時(shí)經(jīng)過赤霉素處理的種子最高發(fā)芽率的僅為66%，說明盡管選用的種子為經(jīng)過水浮法選出的籽粒飽滿的種子，但種子個(gè)體之間種胚發(fā)育的程度不同，雖然經(jīng)過了150 d的層積處理，但依然會存在種胚尚未完全成熟的種子，采用一定濃度外源赤霉素浸種對種胚的發(fā)育有促進(jìn)作用，由于赤霉素的有效性一般在2周左右[9]，本試驗(yàn)中只在層積結(jié)束后對遼東楤木種子處理了1次赤霉素，這也是種子發(fā)芽時(shí)間周期長的原因之一。關(guān)于遼東楤木種子形態(tài)自然成熟過程中種胚發(fā)育情況以及赤霉素處理遼東楤木種子的使用次數(shù)還有待于進(jìn)一步研究。

植物種子解除休眠的過程，是一系列內(nèi)源激素參與調(diào)控的過程，赤霉素(GA3)和脫落酸(ABA)是2種聯(lián)系緊密又極受關(guān)注的一對拮抗機(jī)制激素。其中赤霉素作為促進(jìn)激素，在解除種子休眠方面有顯著的作用，主要表現(xiàn)為軟化種胚周圍組織，促進(jìn)種胚生長；同時(shí)赤霉素能夠提高各類酶活性、促進(jìn)種子內(nèi)物質(zhì)的分解與合成[10]。一定濃度的赤霉素能夠有效的克服種子休眠，使種子迅速萌發(fā)[11]。赤霉素處理在不同程度上提高了天女木蘭種子和節(jié)節(jié)麥種子的發(fā)芽率，在天女木蘭種子萌發(fā)過程中，內(nèi)源赤霉素含量不斷積累，呈現(xiàn)上升的趨勢；節(jié)節(jié)麥種子內(nèi)源赤霉素含量明顯增高[12-13]。種子休眠及解除與脫落酸水平的降低密切[14]，隨種子的萌發(fā)，脫落酸含量可自我調(diào)節(jié)而明顯下降[15]。赤霉素和脫落酸在種子內(nèi)的平衡決定了之后種子是休眠還是萌發(fā)。本試驗(yàn)表明，種子萌發(fā)過程中赤霉素增加而脫落酸減少，更有利于遼東楤木種子的萌發(fā)，其中。200 mg/kg的外源赤霉素浸種效果最佳，能夠顯著提高發(fā)芽率。種子后熟過程中，種皮透性會增強(qiáng)，種子中抑制劑含量降低，使種子逐步達(dá)到可萌發(fā)條件。當(dāng)種子打破休眠，首先會分解種胚中大量貯藏的可溶性糖和可溶性蛋白質(zhì)，為胚的伸長和新陳代謝提供更多的能量[16]。GA3處理種子后, 可使活力毛竹可溶性蛋白質(zhì)含量升高[17]，使華重樓種子可溶性蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢[18]，可使杜鵑花瓣中可溶性糖含量顯著提高[19]。本試驗(yàn)中，遼東楤木種子經(jīng)200 mg/kg濃度的赤霉素處理后，可溶性糖含量逐漸下降而可溶性蛋白質(zhì)含量逐漸上升，說明一定濃度的赤霉素能夠促進(jìn)遼東楤木種子可溶性糖的水解和可溶性蛋白質(zhì)的合成。種子萌發(fā)過程中可溶性糖的降低，可能是在外源赤霉素的作用下，利用糖代謝循環(huán)的速度加快，呼吸消耗的可溶性蛋白質(zhì)高于淀粉水解的速度。大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)為代謝酶類，種子萌發(fā)過程中，酶類含量的變化在一定程度上能夠說明種子代謝活性的強(qiáng)弱。因此可溶性蛋白質(zhì)逐漸升高，可能是由于種子萌發(fā)的相關(guān)代謝酶的積累?？梢姡?00 mg/kg赤霉素處理能夠促進(jìn)遼東楤木種子可溶性糖的水解和可溶性蛋白質(zhì)的合成。

過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)是種子內(nèi)部抗氧化保護(hù)系統(tǒng)的重要保護(hù)酶，相互之間共同作用來保護(hù)種子內(nèi)部細(xì)胞[20]。CAT具有防止過氧化的功能，廣泛的存在于生物體中。POD、SOD是植物體內(nèi)具有生理活性的重要的活性氧自由基清除酶，其中POD能夠水解細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的H2O2，從而保護(hù)細(xì)胞組織[21]，與植物的呼吸作用、木質(zhì)素的合成以及生長素的氧化等都有著密切的聯(lián)系。SOD是生物體內(nèi)清除自由基的主要物質(zhì)，能夠防止自由基損害細(xì)胞并修復(fù)受損細(xì)胞[22]；SOD可以催化超氧自由基歧化反應(yīng)生成H2O2,產(chǎn)生的H2O2再由CAT和POD清除[23]。本試驗(yàn)中，層積后的遼東楤木種子在200mg/kg外源赤霉素處理后3種酶活性逐漸升高，且在50d時(shí)過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的酶活性均達(dá)到最高值，可見，赤霉素處理遼東楤木種子后可提高POD、CAT及SOD活性，減少了自由基對萌發(fā)過程中種子細(xì)胞的損傷，進(jìn)而促進(jìn)了遼東楤木種子的萌發(fā)。這也與前人在露蕊烏頭種子、福建青岡種子及絲瓜種子的研究結(jié)果相一致[24-26]。總之，一定濃度外源赤霉素處理遼東楤木種子，對打破種子休眠、提高種子發(fā)芽率有促進(jìn)作用。其中，以200mg/kg浸種效果最好。高水平的酶活性(POD、CAT、SOD)、可溶性蛋白質(zhì)含量、赤霉素含量以及低水平的可溶性糖含量、脫落酸含量有利于遼東楤木種子的萌發(fā)。