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    菊粉酶降低N-羥乙酰神經(jīng)氨酸含量機制的分子模擬研究

    2020-10-09 08:35:12羅先錕梁美蓮朱秋勁
    核農(nóng)學報 2020年9期
    關(guān)鍵詞:外切菊粉殘基

    常 瑞 羅先錕 何 江 梁美蓮 朱秋勁

    (1貴州大學釀酒與食品工程學院/貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點實驗室,貴州 貴陽 550025;2 貴陽市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗測試中心,貴州 貴陽 550004)

    紅肉及其制品是供給人體蛋白質(zhì)、多不飽和脂肪酸、B 族維生素、硒等優(yōu)質(zhì)營養(yǎng)素的來源。但近來諸多流行性病學和免疫學研究表明,日常飲食紅肉及其加工制品而攝入的 N - 羥乙酰神經(jīng)氨酸 (Nglycolylneuraminic,Neu5Gc) 可被機體識別產(chǎn)物抗-Neu5Gc 抗體,這種抗體誘導機體處于低度炎癥狀態(tài),并與結(jié)直腸癌等炎癥的發(fā)生相關(guān)[1]。Neu5Gc 屬于吡喃酮糖衍生物[2],是N-乙酰神經(jīng)氨酸 (Nacetylneuraminic acid,Neu5Ac) 被胞苷單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶 (CMP-Neu5Ac hydroxylase,CMAH) 羥化的產(chǎn)物,其在人體中不能正常合成,主要依靠外源飲食豬肉、牛肉等紅肉攝入[3]。2018年美國牛肉消費量為1 218 萬t,中國豬肉消費量為5 540 萬t,且依然持續(xù)增漲[4],因此,Neu5Gc 成為重要的食品風險因子[5],安全高效降低Neu5Gc 在紅肉中的含量關(guān)乎紅肉制品的安全。

    目前已有不同方式改變紅肉中Neu5Gc 存在狀態(tài)和含量的研究,蔣蕓等[6]通過對豬肉和牛肉進行水煮、微波加熱、有機酸腌制處理使得肉樣中Neu5Gc 含量降低70%;β-半乳糖苷酶處理肉樣后,雖然可使樣品中Neu5Gc 含量降低84%,但這種方式僅破壞了Neu5Gc 與生物分子相連的糖苷鍵,使結(jié)合態(tài)變成了游離態(tài)。鼠傷寒沙門氏菌LT2 唾液酸酶對4-甲基傘形-Neu5Ac 的效果好于4-甲基傘形-Neu5Gc[7],但該酶無法用于食品工業(yè)。梁美蓮等[8]以十多種食品加工常見酶制劑處理肉樣和Neu5Gc 標準品的效果研究表明,外切型菊粉酶能夠降低牛肉中Neu5Gc 的含量,對純標準品含量降低率可達50.52%[8],表明菊粉酶有望成為工業(yè)化降低游離態(tài)Neu5Gc 的有效工具。

    利用分子模擬技術(shù)獲得底物與酶作用的殘基信息,有助于酶的理性設(shè)計和作用機制解析。楊倩等[9]為提高米根霉α-淀粉酶(ROAmy) 的熱穩(wěn)定性,基于分子動力學模擬結(jié)果,對該酶中的3 個氨基酸殘基G128、K269 和G393 進行了突變,獲得了熱穩(wěn)定性更好的突變體。目前已有X-衍射晶體法和分子動力學模擬對外切菊粉酶作用果糖催化位點解析[10]、同源建模分析菊粉酶功能域和活性位點[11]、菊粉酶對果糖六磷酸和蔗果三糖相互作用模擬的報道[12]。但有關(guān)Neu5Gc 與菊粉酶相互作用機制的研究卻鮮有報道。本研究對外切型和內(nèi)切型菊粉酶與Neu5Gc 復合物進行分子動力學模擬,采用密度泛函理論分析相關(guān)殘基與Neu5Gc 分子間作用的類型、強弱和分布,以期獲得菊粉酶與Neu5Gc 相互作用的機制,為菊粉酶在紅肉加工中應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    來自曲霉的外切型菊粉酶標準品(EC 3.2.1.80)、內(nèi)切型菊粉酶標準品(EC 3.2.1.7),購自愛爾蘭Megazyme 公司;Neu5Gc 標準品,購自美國Sigma 公司。菊粉酶結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)PDB 數(shù)據(jù)庫獲取,均來源于曲霉,外切型菊粉酶(PDB 編號:1Y9G),內(nèi)切型菊粉酶(PDB 編號: 3SC7)。Neu5Gc 分子結(jié)構(gòu)取自Pubchem 數(shù)據(jù)庫(CID: 440001)。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    Waters Xevo TQ 沃特世三重四級桿液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國Waters 公司;Mill-Q 超純水儀,美國Milipore 公司。SYBYL-X(2.0)藥物設(shè)計平臺、開源分子動力學程序Gromacs (2 016.4)、Gaussian View6、Gaussian16 (Revision A.03)[13]程序由貴州大學云計算平臺支持。Discovery studio 3.5 客戶端(蛋白去水、去雜原子和對接空腔參數(shù)記錄)、對接程序AutoDock-Vina、波函數(shù)程序Mulitwfn3.6[14]、酶底復合物二維殘基相互作用可視化程序Ligpot+、氨基酸殘基虛擬突變工具Swiss PDB Viewer[15]、等值面圖繪制程序VMD(1.9)[16],均由個人電腦提供計算平臺。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 菊粉酶作用效果檢測 取1 mL 10 mg·mL-1的標準Neu5Gc 溶液于液相瓶中,加入0.8%(w/w)菊粉酶,置于最適溫度50℃酶解30 min,酶解完成后用0.22 μm 膜過濾酶解液,備用。采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進行菊粉酶作用效果檢測,根據(jù)文獻[17]的方法略有修改。取1 μL 酶解液進樣分析,色譜條件:ACQUITY UPLC C18 色譜柱(1.7 μm,2.1 mm×100 mm),流動相A:100%乙腈,流動相B:0.1% 甲酸水溶液,梯度洗脫(5% A 0~3 min,10% A 3 ~5 min,100%A 5~6 min,5% A 6~7 min),流速0.2 mL·min-1,柱溫25℃,進樣量1 μL。質(zhì)譜條件: 離子源為電噴霧化離子源(ESI),源溫度100℃,探針溫度450℃,毛細管電壓3 000 V,錐孔電壓19 V,脫溶劑氣流速1 000 L·hr-1,負離子方式檢測,掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)。定量分析離子對323.8/116.0 時,碰撞氣能量為17 V;定量分析離子對323.8/185.8 時,碰撞氣能量為15 V。

    1.3.2 Neu5Gc 與菊粉酶相互作用 參照文獻[18]的方法,采用分子對接、氨基酸殘基虛擬突變、分子動力學模擬研究Neu5Gc 與菊粉酶的分子間相互作用。為更加全面的考察Neu5Gc 與菊粉酶相互作用過程中涉及的蛋白殘基,同時采用AutoDock-Vina 和SYBYL(2.0)對接方法進行分子動力學模擬,研究實際水環(huán)境下的對接復合物穩(wěn)定性。

    AutoDock-Vina 對接: 對受體菊粉酶和配體Neu5Gc 均以AutodockTool-1.5.6 打開,進行定義原子類型和添加Casteiger 電荷處理,并保存為pdbqt 格式。從PDB 蛋白數(shù)據(jù)庫得到的菊粉酶結(jié)構(gòu)含小分子配體,這些小分子配體構(gòu)成了對接時的活性空腔,為獲得Neu5Gc 與菊粉酶不同配體空腔對接的最佳位置,根據(jù)Discovery studio 3.5 客戶端中顯示的配體空間參數(shù),采用AutoDock-Vina 進行不同配體位置的對接。設(shè)置對接時的最大打分構(gòu)象數(shù)目為9,對接盒子大小設(shè)置根據(jù)空間參數(shù)適當調(diào)整。對接完成后根據(jù)結(jié)合能大小和均方位移(root mean square deviation,RMSD)值作為最佳結(jié)合構(gòu)象選擇依據(jù)。對接后的最佳復合物結(jié)構(gòu)用Ligpot+進行氨基酸二維相互作用分析。

    Surflex-Dock (SFXC)-Geom 對接:受體菊粉酶加氫后刪除配體和水分子以及雜原子,加Casteiger 電荷,在Tripos 力場下采用最陡下降法進行1 000 步的能量最小化處理,其余參數(shù)均為默認。對接空腔由配體坐標產(chǎn)生,在其周圍氨基酸0.5 nm 范圍半徑內(nèi)產(chǎn)生活性空腔。最終對接配體可能的構(gòu)象數(shù)目設(shè)定為20種,配體的RMSD 最小控制在0.5。取對接后打分最高者進行對接分析。

    Gromacs 動力學模擬:依據(jù)結(jié)合能與打分排序?qū)σ陨蠈雍蟮膹秃衔镞M行篩選,對最佳Neu5Gc-菊粉酶復合物在水環(huán)境中進行動力學模擬以考察其結(jié)合穩(wěn)定性。受體分子菊粉酶的力場選擇AMBER99-ILDN,水盒子采用TIP3P 三點水模型,體系大小為盒子邊界距離蛋白文件2.5 nm。配體分子Neu5Gc 采用Amber Tools 17 中的GAFF 力場,產(chǎn)生itp 限制勢文件和gro拓撲文件,使用Gromacs 中的genrestr 工具生成體系距離限制勢文件,使用-DPOSRES 關(guān)鍵詞限制配體的位置。對體系加入抗衡離子平衡電荷。在模擬參數(shù)文件mdp 中先用最陡下降法進行2 000 步,步長為0.01 ps的能量最小化,鄰居列表生成選擇cutoff-scheme =Verlet,靜電作用為庫倫力,非鍵相互作用采用PME 截斷方式,LINCS 算法約束成鍵,每50 步輸出一次能量信息。然后進行500 ps 的控溫、控壓限制性動力學直到平衡溫度298.15 K,熱浴設(shè)定為velocity-rescale,控溫的時間常數(shù)為0.2 ps,壓浴設(shè)定為Berendsen,采用各項同性控壓,控壓時間常數(shù)為0.5 ps,只約束氫鍵,該過程每500 步輸入一次能量信息,每1 000 步輸出一次坐標信息。限制性動力學平衡后,對配體和受體設(shè)置索引和分組,放開限制進行100 ns 的成品模擬,設(shè)定每步0.002 ps,每1 000 步輸出一次能量信息。成品模擬平衡后,選擇平衡末端80~100 ns 處軌跡文件,每隔10幀從軌跡文件中提取平均構(gòu)象,采用g_mmpbsa 工具,基于分子力學泊松-波爾茲曼表面積(molecular mechanics poisson-boltzmann surface area,MM-PBSA)法進行蛋白和配體結(jié)合自由能△Gbind計算?!鱃bind值越低說明受體和配體間的親和力越高。溶劑中蛋白和配體結(jié)合自由能按照公式進行計算[19]:

    式中,Gcomplex是總的自由能;Gprotein和Gligand是溶劑中獨立的自由能。其中,溶劑中獨立的自由能GX按照公式進行計算:

    式中,X代表蛋白或配體或復合物;TS 是真空中構(gòu)象變化導致的熵變對自由能的貢獻,由于構(gòu)象熵對本研究變化影響不大,故不考慮;EMM是真空中的分子力學能;Gsolvation代表溶劑化能;按照公式進行計算:

    式中,Ebond代表成鍵作用,如鍵長、鍵角、旋轉(zhuǎn)等;Enobonded代表非鍵作用力,如范德華力和靜電作用力;Gpolar代表極性溶劑化能,由求解波茲曼方程得到;Gnonpolar由基于溶劑可及表面積SASA 模型、溶劑可及體積SAV 和WCA 模型計算。

    計算完成后,對動力學過程中重要殘基進行能量分解,以獲得殘基對結(jié)合自由能的貢獻。為考察模擬過程的穩(wěn)定性,進行蛋白和復合物的RMSD、殘基的RMSF 分析。

    1.3.3 殘基虛擬突變 當外切菊粉酶1Y9G 的活性殘基ASP189 用ASN 取代時,酶活性降低[9];以外切菊粉酶1Y9G 為模板同源建模構(gòu)建內(nèi)切型菊粉酶,當活性殘基ASP460 突變?yōu)锳LA 后,突變體催化活性喪失[20]。內(nèi)切型菊粉酶3SC7 定點突變表明ASP42 對催化活性有重要作用[21]。采用Swiss PDB Viewer 工具,選擇將外切型菊粉酶1Y9G 的活性殘基ASP41 突變?yōu)锳SN41;將內(nèi)切型菊粉酶3SC7 的活性殘基GLU233 突變?yōu)锳LA233。對突變后的菊粉酶與Neu5Gc 以AutoDock-Vina 對接并產(chǎn)生復合物結(jié)構(gòu),進行分子動力學模擬考察穩(wěn)定性和活性位點殘基變化。提取菊粉酶1Y9G 和3SC7 與Neu5Gc 動力學模擬平衡后最后一幀,在M062X/6-311G(d,p)水平下對活性殘基-Neu5Gc 復合物以分子中原子理論(atom in molecules,AIM) 進行鍵臨界關(guān)鍵點(bond critical point,BCP) 分析,用獨立梯度模型(independent gradient model,IGM)考察分子間弱相互作用。

    1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

    試驗數(shù)據(jù)均用平均值表示,平行3 次。采用SPSS 23. 0 軟件進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)顯著性差異分析采用t檢驗,顯著性水平為P<0.05,采用OriginPro 2016 軟件制圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 菊粉酶對Neu5Gc 的作用效果

    通過液相質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS) 對2 種酶在最適溫度下與Neu5Gc 標準品作用后濾膜液進行Neu5Gc 含量檢測。由圖1可知,外切型菊粉酶對Neu5Gc 標準品中Neu5Gc 含量的平均降低率為55.33%,內(nèi)切型菊粉酶對Neu5Gc 標準品中Neu5Gc 含量的平均降低率為43.81%,兩組間差異不顯著(P>0.05),但均顯著高于對照組(1.73%)。表明外切型菊粉酶對吡喃糖衍生物Neu5Gc 的降低效果略優(yōu)于內(nèi)切菊粉酶。這可能與菊粉酶對吡喃糖衍生物,如蔗糖的水解能力差異有關(guān);外切型菊粉酶能將蔗糖轉(zhuǎn)化為單糖中的果糖;而大多數(shù)內(nèi)切酶轉(zhuǎn)化蔗糖的效率較低[22-23]。

    2.2 Neu5Gc 與菊粉酶不同位點分子對接

    由于2 種菊粉酶對Neu5Gc 作用效果相近,為探究作用過程中二者間活性殘基的差異,首先采用分子對接對二者進行初步探究。用Discovery studio 3.5 客戶端顯示菊粉酶結(jié)構(gòu),外切型菊粉酶1Y9G 共5 個配體,配體1 由NAG1001、NAG1002 組成,配體2 由NAG2001 組成,配體3 由NAG3001 組成,配體4 由NAG5001 組成,配體5 由FRU801 組成。3SC7 內(nèi)切型菊粉酶X 鏈共4 個配體,配體1 由MAN517 組成,配體2 由MAN518 和MAN519 組成,配體3 由NAG750、NAG751 和BMA752 組成,配體4 由EPE520 組成。對菊粉酶不同配體位置與Neu5Gc 進行AutoDock-Vina對接,結(jié)果如表1、2 所示,對接最佳復合物處Neu5Gc-菊粉酶二維活性殘基作用結(jié)果如圖2所示。Surflex-Dock 對接的結(jié)果如圖3所示。

    圖1 菊粉酶對Neu5Gc 標準品的作用效果Fig.1 Effect of inulinase on Neu5Gc standards

    由表1可知,1Y9G 在配體5 處對接結(jié)合能最低,為-30.96 kJ·mol-1,因此Neu5Gc 與1Y9G 在配體5 處對接結(jié)果最佳。由表2可知,3SC7 在配體2 處對接結(jié)合能最低,為-26.77 kJ·mol-1,因此Neu5Gc 與3SC7在其配體2 處對接結(jié)果最佳。由圖2可知,Neu5Gc 與1Y9G 配體5處的殘基ASN40、GLN57、SER103、GLN149、ASN186、ASP189、ASN265 和TRP335 相互作用產(chǎn)生10 個氫鍵,與殘基ASP41、PHE102、ARG188 和GLU241 產(chǎn)生疏水相互作用。由圖3中SYBYL 對接結(jié)果可知,Neu5Gc 與殘基 GLN14、ASN40、GLN57、SER103、GLU241、TRP335 產(chǎn)生8 個氫鍵。外切型菊粉酶1Y9G 催化果糖的活性位點殘基為ASN40、ASP41、TRP65、SER103、ARG188、ASP189、GLU241 和CYS242[10]。對比1Y9G 活性位點可知,Neu5Gc 均可與外切型菊粉酶殘基CYS242 外的其余活性殘基發(fā)生相互作用,且其主要與ASP 型、GLN 型殘基相互作用。

    Neu5Gc 與3SC7 配體2 周圍殘基ASN42、GLU43、GLU233、ASN320、GLY323 產(chǎn)生7 個氫鍵。與殘基VAL23、TRP40、PHE99、THR255、ASN265、ASP298 產(chǎn)生疏水相互作用。SYBYL 對接結(jié)果顯示,與3SC7 的殘基GLU258、ASN265、ARG295、ASN320、GLY323、ASP440 產(chǎn)生8 個氫鍵。內(nèi)切型菊粉酶催化果糖和戊酮糖時共有的殘基為TRP40、GLU43、GLN59、ASN61、TRP67、GLY68、ILE70、PHE99、ARG175、GLU233、ASN320 和GLY323[24]。對比3SC7 的活性位點可知,Neu5Gc 可與內(nèi)切型菊粉酶活性殘基TRP40、GLU43、PHE99、GLU233、ASN320 和GLY323 相互作用,表明其主要與GLU 型殘基作用。已知在外切和內(nèi)切型菊粉酶活性殘基中,ASP 和GLU 分別是重要的催化殘基[25]。綜合以上對接后相互作用殘基分析可知,Neu5Gc 主要與外切型菊粉酶活性殘基中的ASP 殘基和內(nèi)切型菊粉酶活性殘基中的GLU 殘基相互作用。這與Singh 等[12]采用分子對接得到外切型菊粉酶和果糖- 6 -磷酸主要結(jié)合殘基為ASP22、ASP128 和ASP179,內(nèi)切型菊粉酶與酮糖主要結(jié)合殘基為GLU34和GLU200 一致;也和動力學模擬果糖-6-磷酸和酮糖分別與外切型菊粉酶ASP285、GLN350 產(chǎn)生氫鍵作用的結(jié)論一致[26]。

    表1 1Y9G 與Neu5Gc AutoDock-Vina 對接結(jié)果Table1 1Y9G and Neu5Gc AutoDock-Vina docking results

    表2 3SC7 與Neu5Gc AutoDock-Vina 對接結(jié)果Table2 3SC7 and Neu5Gc AutoDock-Vina docking results

    2.3 菊粉酶與Neu5Gc 分子動力學模擬

    2.3.1 動力學模擬穩(wěn)定性評價 為獲得2 種菊粉酶與Neu5Gc 對接后最佳酶底復合物在水環(huán)境中的穩(wěn)定結(jié)合狀態(tài),提取最佳打分復合物進行100 ns 動力學模擬。為驗證動力學模擬中菊粉酶催化殘基對結(jié)合Neu5Gc 并穩(wěn)定其構(gòu)象的貢獻,對菊粉酶催化活性殘基進行虛擬突變。采用蛋白骨架波動、配體與受體蛋白的偏移程度、蛋白殘基波動進行模擬穩(wěn)定性評價,結(jié)果分別如圖4、5、6 所示。波動數(shù)值越大表明穩(wěn)定性越低。由圖4可知,1Y9G 突變后殘基蛋白穩(wěn)定性輕微提高,但突變后復合物穩(wěn)定性小于突變之前。由圖5可知,突變后蛋白殘基運動波動性相似,但均大于晶體結(jié)構(gòu)的殘基波動,這與蛋白穩(wěn)定性是一致的。對3SC7突變活性殘基后,蛋白穩(wěn)定性變小,殘基波動明顯高于晶體試驗值,復合物穩(wěn)定性明顯減弱。

    圖2 Neu5Gc 與菊粉酶1Y9G 和3SC7 AutoDock-Vina 對接結(jié)果二維模式圖Fig.2 Two-dimensional interaction model of Neu5Gc and inulinase 1Y9G and 3SC7 by AutoDock-Vina docking

    圖3 Neu5Gc 與菊粉酶1Y9G 和3SC7 Surflex-Dock 對接結(jié)果三維模式圖Fig.3 Three-dimensional interaction model of Neu5Gc and inulinase 1Y9G and 3SC7 by Surflex-Dock docking

    2.3.2 動力學模擬結(jié)合模式 為獲得穩(wěn)定對接狀態(tài)下Neu5Gc 與菊粉酶活性殘基相互作用過程中二者間的空間結(jié)合模式,對模擬平衡后20 ns 軌跡每隔10 ps進行提取,統(tǒng)計模擬過程中活性殘基與Neu5Gc 作用產(chǎn)生的氫鍵個數(shù)和貢獻權(quán)重,選取模擬平衡后的構(gòu)象進行結(jié)合模式分析。由圖7可知,Neu5Gc 與1Y9G 的殘基ASP41、GLN57、GLU241、ASN265 和TRP335 產(chǎn)生氫鍵。當突變1Y9G 的殘基ASP41 為ASN41 后,產(chǎn)生氫鍵的殘基為ASN40、GLN57、TRP65 和GLN149,其中活性殘基僅ASN40、TRP65 與Neu5Gc 穩(wěn)定相互作用,這是由于突變后ASN41 不能親核攻擊底物的異構(gòu)碳原子形成共價中間體,使得其活性喪失。根據(jù)外切型菊粉酶活性位點可知,在水溶液環(huán)境中Neu5Gc 可與外切型菊粉酶關(guān)鍵活性殘基ASP41、GLU241 以及GLN57 穩(wěn)定相互作用。由于殘基ASP41 和GLU241分別在菊粉酶催化底物過程中充當親核試劑、催化酸堿對[27],表明外切型菊粉酶可對Neu5Gc 時行催化作用。

    圖4 菊粉酶1Y9G(A)和1Y9G-Neu5Gc 復合物(B)動力學模擬蛋白骨架均方根位移Fig.4 Dynamics simulation RMSD of inulinase 1Y9G (A) and 1Y9G-Neu5Gc complex(B) protein skeleton

    圖5 菊粉酶1Y9G (A) 和3SC7 (B)動力學模擬殘基均方根漲落Fig.5 Dynamics simulation RMSF of inulinase 1Y9G(A) and 3SC7 (B) protein residues

    Neu5Gc 與3SC7 產(chǎn)生氫鍵的殘基為ASN42、GLU43、ASN265、ASP298 和ASN320,其中催化活性殘基ASP298 和GLU43 與晶體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果一致[28]。由于Neu5Gc 是N-乙酰葡萄糖的衍生物,且有學者以3SC7 為模板和N -乙酰葡糖胺對接,表明殘基ASP285、PHE352、THR288、VAL284、LEU343、MET289、GLN350、LEU343、HIS351、PRO283、THR271可與其穩(wěn)定相互作用[29]。對比可知,對接獲得的殘基相互作用信息與水環(huán)境中動力學模擬得到的作用殘基結(jié)果差異較大,表明與Neu5Gc 產(chǎn)生較穩(wěn)定氫鍵作用的殘基對結(jié)合過程貢獻較大。當突變GLU233 為ALA233 后,Neu5Gc 僅與殘基ASP176、ARG175 和GLU173 產(chǎn)生氫鍵作用。根據(jù)內(nèi)切型菊粉酶活性位點可知,Neu5Gc 可與內(nèi)切型菊粉酶關(guān)鍵殘基GLU43、ASN320 穩(wěn)定相互作用。突變內(nèi)切型菊粉酶3SC7 的殘基GLU233 為ALA233 時,Neu5Gc 僅與3SC7 的活性殘基ARG175 產(chǎn)生氫鍵作用,這是由于GLU 較大的側(cè)鏈能夠造成底物結(jié)合過程的崩潰,由此影響了活性空腔的酸性環(huán)境。

    2.3.3 結(jié)合過程殘基能量分解 為獲得水環(huán)境下Neu5Gc 與菊粉酶結(jié)合過程中分子間相互作用類型、活性殘基穩(wěn)定Neu5Gc 構(gòu)象到活性空腔中的能量貢獻,對動力學模擬平衡后20 ns 軌跡每隔100 ps 進行提取,采用g_mmpbsa 工具對酶和底物結(jié)合能貢獻進行波爾茲曼能量分解,結(jié)果如表3所示。并對模擬平衡時菊粉酶與底物Neu5Gc 相互作用貢獻較大的殘基進行能量貢獻分解,結(jié)果如圖8所示。

    圖6 Neu5Gc 相對于菊粉酶3SC7(A) 和3SC7-Neu5Gc 復合物動力學模擬均方位移Fig.6 Dynamics simulation RMSD of Neu5Gc on inulinase 3SC7(A) and 3SC7-Neu5Gc(B)

    圖7 Neu5Gc 與菊粉酶1Y9G(A)、3SC7(B)、1Y9G 突變后(C)和3SC7 突變后(D)動力學模擬平衡結(jié)合模式圖Fig.7 Binding model of Neu5Gc and inulinase 1Y9G (A),3SC7 (B),mutated 1Y9G (C) and mutated 3SC7 (D)under dynamics simulation equilibrium

    表3 Neu5Gc 與菊粉酶體系動力學平衡后結(jié)合能貢獻分解Table3 Binding energy contribution decomposition of Neu5Gc and inulinase system under dynamics simulation equilibrium /(kJ·mol-1)

    由表3可知,對Neu5Gc 與菊粉酶結(jié)合過程起阻礙作用主要是極性溶劑化能,起促進作用的是范德華力、靜電相互作用和溶劑可及表面積。未突變時,外切菊粉酶1Y9G 與Neu5Gc 的結(jié)合能明顯小于內(nèi)切型菊粉酶3SC7,表明Neu5Gc 優(yōu)先與外切型菊粉酶相互作用。當突變1Y9G 的催化殘基后,范德華力增強,這可能是由于天冬酰胺使得結(jié)合位點的電荷由原來的負電荷變?yōu)檎姾?,靜電相互作用減少。這與Torabizadeh等[30]通過以1Y9M 建模的菊粉酶活性殘基經(jīng)磷酸吡哆醛修飾后,負電荷增加,靜電作用增強的結(jié)果相似。突變3SC7 的GLU233 為ALA233 后,總結(jié)合能增強,但靜電相互作用對結(jié)合過程的促進作用明顯減少,導致復合物穩(wěn)定性明顯降低。由圖8可知,結(jié)合過程中主要相關(guān)殘基的能量項主要由對結(jié)合過程起促進作用的分子力學能和起阻礙作用的極性溶劑化能組成。從有利于結(jié)合過程的分子力學能變化可知,1Y9G 中促進與Neu5Gc 結(jié)合的關(guān)鍵殘基是ASP41、GLU241 和TRP335,而當突變殘基ASP41 后主要為TRP65 殘基。3SC7 中促進與Neu5Gc 結(jié)合的關(guān)鍵殘基是GLU43、ASN265 和ASP298,當突變GLU233 后主要為ASP176殘基。表明突變關(guān)鍵活性殘基后,菊粉酶對于Neu5Gc穩(wěn)定到活性空腔的靜電能將下降,進一步證明了Neu5Gc 與菊粉酶主要以催化活性殘基相互穩(wěn)定作用。

    2.3.4 AIM 和IGM 分析 為考察動力學平衡后Neu5Gc 與活性殘基形成的氫鍵強度和分布,提取1Y9G 和3SC7 與Neu5Gc 動力學模擬平衡后關(guān)鍵結(jié)合殘基,選擇對弱相互作用計算較好的M062X 泛函,在6-311G(d,p)基組水平下產(chǎn)生波函數(shù)文件對臨界鍵關(guān)鍵點BCP 進行AIM 分析,結(jié)果如表4所示。采用獨立梯度約化泛函IGM 對氫鍵投影進行等值面分析,結(jié)果如圖9所示;分子間和分子內(nèi)相互作用散點圖如圖10所示。

    圖8 Neu5Gc 與菊粉酶1Y9G(A)、3SC7(B)、1Y9G 突變后(C)和3SC7 突變后(D)動力學平衡時殘基能量分解Fig.8 Residual energy decomposition of Neu5Gc and inulinase 1Y9G (A),3SC7 (B),mutated 1Y9G (C)and mutated 3SC7 (D) under dynamics simulation equilibrium

    表4 Neu5Gc 與菊粉酶1Y9G、3SC7 活性殘基分子間氫鍵AIM 分析(能量項ρ、▽2ρ、V、G、HBCP、EHB)Table4 AIM analysis of intermolecular hydrogen bonding between Neu5Gc and inulinase 1Y9G,3SC7 active residues (energy items ρ、▽2ρ、V、G、HBCP、EH B)

    在AIM 理論中,體系坐標函數(shù)的二階鞍點稱為鍵臨界點。鍵臨界點處的電子密度、拉普拉斯密度與鍵的強度和類型有關(guān)[31]。從鍵臨界點搜索結(jié)果可以看出,1Y9G 和3SC7 活性殘基與Neu5Gc 均產(chǎn)生4 個氫鍵臨界點。由Rozas 等[32]的氫鍵強度劃分標準:弱氫鍵(EHB<50.20 kJ·mol-1,▽2(rBCP) > 0,G(rBCP) +V(rBCP) >0),中等氫鍵(50.20 <EHB<100.4 kJ·mol-1,▽2(rBCP) > 0,G(rBCP) +V(rBCP) <0),強氫鍵(EHB>100.4 kJ·mol-1,▽2(rBCP) <0,G(rBCP) +V(rBCP) <0)。由表4可知,外切型菊粉酶1Y9G 活性殘基與Neu5Gc 作用的最大氫鍵強度為-9.65 kJ·mol-1,內(nèi)切型菊粉酶3SC7 活性殘基與Neu5Gc 作用的最大氫鍵強度為-11.53 kJ·mol-1,可知2 種菊粉酶與Neu5Gc均以弱氫鍵相互穩(wěn)定結(jié)合,其中,就氫鍵強度總和而言,外切型菊粉酶稍高于內(nèi)切型菊粉酶的作用效果,這與結(jié)合自由能分解得到Neu5Gc 更易于和內(nèi)切型菊粉酶在水環(huán)境下穩(wěn)定結(jié)合的結(jié)果是一致的。

    約化密度梯度(reduced density gradient,RDG)函數(shù)是基于電子密度拓撲的非共價相互作用分析方法,電子密度梯度降低的區(qū)域與非共價相互作用區(qū)域相關(guān),該區(qū)域用等值面圖可以將非共價作用的位置分布和類型進行可視化[33],以S 作為弱相互作用的等值面函數(shù)。

    圖9 Neu5Gc 與菊粉酶1Y9G(A)、3SC7(B)活性殘基分子間作用IGM 等值面圖Fig.9 Intramolecular IGM isosurface map of Neu5Gc with inulinase 1Y9G (A) and 3SC7 (B) active residues

    圖10 Neu5Gc 與菊粉酶1Y9G、3SC7 活性殘基分子間作用IGM 散點圖Fig.10 Intramolecular IGM scatter plot of Neu5Gc with inulinase 1Y9G and 3SC7 active residues

    式中,ρ 代表電子密度,▽ρ 代表電子密度梯度的模量。在IGM 理論中,當SIGM基于|▽ρ(r)IGM|時,SIGM和S 最大的差值代表鍵臨界點處的RDG 值,定義δg表示相互作用區(qū)域,劃分為片段內(nèi)相互作用的δgintra和片段間相互作用的δginter。其表達式如下:δg(r)=|▽ρ(r)IGM|-|▽ρ(r)|,δg(r)=δg(r)inter+δg(r)intra。將δg 描述符以符號函數(shù)sign(λ2)ρ 投影。當sign(λ2)ρ值為-0.04 時,δginter值顯示明顯的峰,代表了分子間相互作用的氫鍵;當sign(λ2)ρ 值為正值時,代表了空間排斥作用;當sign(λ2)ρ 值在-0.3 附近,δgintra有個較大峰,代表了分子內(nèi)相互作用。默認的sign(λ2)ρ 值在-0.05~0.05 范圍內(nèi)。等值面圖中藍色越強表示吸引作用越強,綠色的代表弱的范德華力作用[34]。

    由圖9可知,與Neu5Gc 穩(wěn)定結(jié)合的菊粉酶活性殘基和Neu5Gc 產(chǎn)生氫鍵的氮氧原子與受體之間有明顯的等值面分布。從等值面分布上看,1Y9G 活性殘基與Neu5Gc 產(chǎn)生的藍色區(qū)域明顯少于3SC7 的活性殘基,表明分子間靜電作用力弱于3SC7,這與結(jié)合能分解得到其靜電作用能較低相一致。由顏色分布可知范德華力是主要作用力,氮原子為供體產(chǎn)生的較強氫鍵僅為1Y9G 的GLN57 處,這與AIM 分析的結(jié)論一致。由3SC7 活性殘基和Neu5Gc 弱相互作用的等值面分布圖可知,產(chǎn)生氫鍵的位置主要為供體羥基氧原子和受體氧之間,與AIM 分析結(jié)果相一致。同樣,散點圖10中觀察到菊粉酶與Neu5Gc 分子間存在的弱氫鍵相互作用峰(sign(λ2)ρ -0.04 處)。以上結(jié)果表明Neu5Gc 羥基氧和酰胺氮與菊粉酶活性殘基提供的親核性質(zhì)是導致該結(jié)合過程穩(wěn)定存在的原因之一。

    3 討論

    菊粉酶廣泛用于功能性低聚糖的制備,但由于菊粉酶催化活性域具有一定保守性,不同底物與不同類型菊粉酶之間相互作用的過程和機制有一定共性。菊粉酶可以作用于單糖衍生物[12],對酮糖也有一定的降低效果[26],推測菊粉酶具有消減吡喃糖衍生物Neu5Gc 的潛在功能。因此,基于前期對多種食品酶制劑作用于Neu5Gc 的篩選結(jié)果進行深入研究,采用液相質(zhì)譜檢測以克服Neu5Gc 液相衍生化檢測干擾,其中,外切菊粉酶結(jié)果(55.33%)較液相法檢測結(jié)果(50.52%)提高了4.81%[7],這是由于衍生化試劑1,2-二氨基-4,5-亞甲二氧基苯(DMB) 會與菊粉酶活性中心競爭性結(jié)合,干擾檢測。外切型和內(nèi)切型菊粉酶活性域的差異性導致其對相同底物的作用效果不同,因此本研究觀察到內(nèi)切型菊粉酶對Neu5Gc 含量的降低率較外切型菊粉酶低6.71%左右。Neu5Gc 雖然不是菊粉酶的高效底物,但高達50%以上的降低率表明菊粉酶對Neu5Gc 具有一定的消減能力。分子動力學模擬廣泛用于酶底物結(jié)合過程細節(jié)的討論,故采用該方法研究2 種菊粉酶作用于Neu5Gc 的效果和差異機制。

    目前對菊粉酶有關(guān)的分子動力學模擬研究多集中在理性設(shè)計和底物識別方面[35],但對其于分子間弱相互作用的討論不夠深入。國內(nèi)武希箭[36]采用分子動力學模擬研究內(nèi)切型菊粉酶對菊粉的分子間相互作用,考察了結(jié)合能、殘基突變情況,發(fā)現(xiàn)主導菊粉酶發(fā)揮作用的關(guān)鍵分子間作用力是靜電力和范德華力,且活性位點殘基側(cè)鏈減少后,對底物穩(wěn)定到活性口袋的作用減弱,這與本研究結(jié)論一致,但其未定量研究活性殘基與底物結(jié)合的氫鍵強度和分布情況[36]。目前對于酶和底物分子對接的研究多采用單一平臺進行分析,形成復合物后采用動力學模擬進行驗證,但由于不同分子對接軟件的打分函數(shù)和評價規(guī)則不同,導致一些潛在的酶活性殘基不能被識別[37]。本研究綜合利用AutoDock-Vina 的高并行性和SYBYL 平臺的高精度分子力場優(yōu)勢進行對接,殘基與底物分子互作結(jié)果也表明了不同對接平臺在識別活性殘基方面的差異,采用多平臺對接可獲取更多酶底物結(jié)合過程信息。本研究在水環(huán)境下對于Neu5Gc 和菊粉酶對接復合物的動力學模擬表明,Neu5Gc 能夠與菊粉酶活性殘基以靜電作用力、范德華力和疏水作用力穩(wěn)定結(jié)合,氨基酸虛擬突變也證實了菊粉酶催化活性殘基ASP 和GLU 的重要貢獻,這與大多數(shù)研究結(jié)論一致[27]。但本研究通過分子中原子理論對活性殘基和Neu5Gc 復合物的分子間氫鍵定量分析發(fā)現(xiàn),外切型菊粉酶1Y9G 與Neu5Gc的分子間氫鍵強度較內(nèi)切型菊粉酶3SC7 高18.7 kJ·mol-1左右,這可能是二者對Neu5Gc 含量降低效果不同的原因之一。氫鍵強度差異對于酶催化過程中過渡態(tài)的形成和反應(yīng)勢壘具有一定影響,隨著量子力學/分子力學(quantum mechanics/molecular mechanics,QM/MM) 法在研究糖苷酶水解、糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)機制方面的應(yīng)用[38],活性殘基對底物作用過程中熱力學和動力學變化逐漸被解析,但該過程涉及復雜力場參數(shù)的新建和優(yōu)化,較為困難。對于開發(fā)高效消減Neu5Gc 及其他食源性風險物質(zhì)的食品加工酶類,在獲知酶底物互作信息基礎(chǔ)上,利用分子生物學技術(shù)即可為實現(xiàn)酶的理性設(shè)計提供參考和支持。

    4 結(jié)論

    體外菊粉酶降低Neu5Gc 標準品含量的試驗結(jié)果表明,外切型菊粉酶和內(nèi)切型菊粉酶分別對Neu5Gc降低效果最佳為55.33%和43.81%。選擇兩類菊粉酶(PDB ID: 1Y9G 和3SC7)與Neu5Gc 穩(wěn)定結(jié)合的分子對接復合物進行分子動力學模擬和弱相互作用,結(jié)果表明,Neu5Gc 可以與外切型菊粉酶1Y9G 的活性殘基ASP41 和GLU241 通過分子間氫鍵產(chǎn)生穩(wěn)定的相互作用,內(nèi)切型菊粉酶3SC7 的活性殘基ASP298 和GLU43 對結(jié)合Neu5Gc 到其活性口袋過程有重要貢獻。突變1Y9G 中的關(guān)鍵活性殘基ASP41 為ASN41,3SC7 的活性殘基GLU233 為ALA233 后的結(jié)果顯示,活性殘基中ASP 的親核性和GLU 的酸堿對性質(zhì)對菊粉酶結(jié)合Neu5Gc 并導致其含量降低過程具有重要作用。殘基能量分解、AIM 分析和IGM 等值面分析表明,Neu5Gc 通過羥基氧原子和酰胺氮原子與菊粉酶活性殘基發(fā)生靜電作用主導的分子間弱相互作用,穩(wěn)定占據(jù)到菊粉酶的活性位點。紅肉是人體多種營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源,本研究通過解析菊粉酶作用Neu5Gc 的活性殘基信息,為菊粉酶的理性設(shè)計和定向進化提供了新的理論參考。

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