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    動態(tài)高壓微射流協(xié)同谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶復(fù)合修飾對魚明膠凝膠特性和結(jié)構(gòu)的影響

    2020-10-09 08:35:06趙慧竹林俊杰李卓恒陳興朋李承恒楊文鴿張秋婷
    核農(nóng)學(xué)報 2020年9期
    關(guān)鍵詞:哺乳動物膠體明膠

    趙慧竹 林俊杰 李卓恒 陳興朋 李承恒 楊文鴿 黃 濤 張秋婷

    (1寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院,浙江 寧波 315832;2南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210097)

    明膠是由膠原蛋白經(jīng)適度水解生成的一種不含脂肪的天然高分子多肽聚合物[1]。明膠因具有良好的乳化性、起泡性、凝膠性和成膜性等物理功能特性,常作為膠凝劑、穩(wěn)定劑、乳化劑和增稠劑等應(yīng)用于肉制品、蛋糕、冰淇淋、啤酒和果汁等生產(chǎn)制作中[1]。目前,全球98.5%的商業(yè)明膠來源于哺乳動物,如豬皮、牛皮和豬骨等[2-3]。因明膠應(yīng)用范圍廣、工業(yè)性能好,市場需求量亦不斷增大。但受瘋牛病、口蹄病和非洲豬瘟等哺乳動物傳染病的影響,哺乳動物明膠的食用安全性備受質(zhì)疑;此外,由于宗教信仰,哺乳動物明膠的應(yīng)用亦受到一定的限制[3-4]。因此,開發(fā)可替代哺乳動物明膠的新型明膠原料成為明膠領(lǐng)域研究的熱點和難點之一[1,5]。

    魚明膠因具有類似于哺乳動物明膠的物理特性,被公認(rèn)為是一種潛在優(yōu)良的哺乳動物明膠替代品。然而,與哺乳動物明膠相比,魚明膠脯氨酸和羥脯氨酸含量較低,使得其無充足的羥基與水形成氫鍵來穩(wěn)定明膠膠體的三股螺旋結(jié)構(gòu),導(dǎo)致其凝膠特性較差,限制了魚明膠在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用[6]。因此,改善魚明膠凝膠特性是提升魚明膠應(yīng)用價值的關(guān)鍵。魚明膠凝膠性的改善方法主要包括生物酶交聯(lián)[7-8]、磷酸化修飾[9-10]、戊二醛交聯(lián)[11]、輻照[12-13]和高壓處理[14]等。其中,谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase,TG)可通過催化魚明膠分子上的賴氨酸和谷氨酰胺生成ε-(γ-Glu)-Lys(G-L) 共價鍵來提高魚明膠的凝膠特性[1,11]。然而高含量TG 修飾易導(dǎo)致魚明膠分子過度交聯(lián),抑制均勻蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成,降低魚明膠的凝膠強度,致使其無法替代哺乳動物明膠[2]。因此,單一的修飾方法不能滿足提高魚明膠凝膠特性的市場需求,復(fù)合修飾法已成為主要的趨勢。目前,有關(guān)魚明膠的復(fù)合修飾大多是基于魚明膠-多糖復(fù)合體系,如酶法-多糖復(fù)合法[6]、多酚-多糖復(fù)合法[1]等。

    研究表明,動態(tài)高壓微射流(dynamic high pressure microfluidization,DHPM)技術(shù)通過對流體進(jìn)行高速剪切、高頻振蕩、空穴以及瞬時高壓等作用,可顯著改善蛋白質(zhì)的大分子結(jié)構(gòu),暴露更多的可修飾位點[15-17],有助于改善蛋白質(zhì)的物理特性[18]。但有關(guān)DHPM 協(xié)同TG 復(fù)合修飾法對魚明膠凝膠特性的研究尚鮮有報道。因此,本試驗通過對比研究TG 修飾和DHPM-TG復(fù)合修飾對魚明膠凝膠特性和膠體結(jié)構(gòu)的影響,旨在確定最佳修飾方法,為高品質(zhì)魚明膠的開發(fā)提供新方法和思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    鳙魚魚鱗(夏季),購于寧波水產(chǎn)市場;TG(活力1 000 U·g-1),泰興市一鳴生物有限公司;戊二醛、鹽酸、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 主要儀器

    M-700 型動態(tài)高壓微射流均質(zhì)機,美國Microfluidics 公司;CR-10 色差儀,日本MINOLTA 美能達(dá)公司;T6 新世紀(jì)紫外-可見分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;烏式粘度計(0.9 ~1.0 mm),上海申誼玻璃制品有限公司;CXDC-0510 低溫恒溫槽,南京舜馬儀器設(shè)備有限公司;TA.XT Plus 質(zhì)構(gòu)儀,英國Stable Micro Systems 公司;Quanta200F 環(huán)境掃描電子顯微鏡,美國FEI 公司;1835 型烏氏粘度計,臺州市椒匯玻璃儀器廠。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 魚明膠的提取 參照Sha 等[19]的方法并略作修改。將魚鱗清洗干凈,用組織搗碎機間歇性攪打90 s,除去魚鱗表面銀白色物質(zhì),用清水洗凈。按照0.5 mol·L-1鹽酸∶魚鱗=1∶20 (v/m)進(jìn)行脫鈣1 h 處理[11]。脫鈣結(jié)束后,用清水沖洗魚鱗至pH 值為6.0。按脫鈣魚鱗∶蒸餾水=1∶3(m/v),加入蒸餾水,置于80℃水浴鍋中浸提2 h。提取液經(jīng)過濾、濃縮、凍干即得魚明膠。

    1.3.2 DHPM 處理魚明膠溶液 稱取凍干的魚明膠于蒸餾水中,50℃水浴加熱溶解,配制成6.67%(m/v)的魚明膠溶液。然后,將魚明膠溶液于100 MPa 的DHPM 處理3 次,備用。

    1.3.3 TG 修飾魚明膠 稱取適量的TG(1 000 U·g-1)分別加入經(jīng)DHPM 處理和未經(jīng)DHPM 處理的魚明膠溶液中,充分混勻,其中TG 濃度分別為0、0.0050%、0.0075%、0.0100%、0.0125% (m/v)。將混合溶液置于40℃水浴鍋中水浴40 min,再置于沸水浴10 min 滅酶活,冷卻至室溫后,置于冰箱備用[2]。

    1.3.4 色度測量 移取20 mL 魚明膠溶液于小燒杯中,置于10℃恒溫恒濕箱中孵化16 ~17 h,使其凝固成膠體。用色差儀測量膠體顏色,每個樣品測量3 次[20]。

    1.3.5 濁度測量 取300 μL 魚明膠溶液,加入蒸餾水稀釋25 倍,用紫外分光光度計于440 nm 波長處測定吸光值,以蒸餾水為空白對照調(diào)零,根據(jù)公式計算濁度[20]:

    式中,Abs440為吸光值;X 為玻璃皿的厚度,mm。

    1.3.6 膠融溫度測定 參考Muyonga 等[21]的方法并稍作修改。將魚明膠溶液置于螺口試管中擰緊,倒置于10℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化16 ~18 h。將試管置于10℃低溫恒溫槽中,并以0.5℃·min-1的速度升溫,當(dāng)試管底部有氣泡溢出時,開始記錄槽中溫度,即為魚明膠的膠融溫度。

    1.3.7 特性粘度測量 參照王淑潔[22]的方法。用0.1 mol·L-1NaCl 等比例稀釋魚明膠,取18 mL 魚明膠溶液于烏式粘度計中,記錄溶液從毛細(xì)管中流出的時間。采用哈金斯公式得樣品特性粘度,測試溫度為室溫。

    式中,ηsp為增比黏度;[η]為特性粘度,d L·g-1;k為Huggins 常數(shù);c為魚明膠濃度,g·mL-1;η為濃度為c的魚明膠溶液粘度,mPa·s;ηs、ηr分別為溶劑粘度和相對粘度,mPa·s;t1、t2分別為樣品流出時間和溶劑流出時間,s。

    1.3.8 凝膠強度測定 參考Kaewruang 等[10]的方法。將魚明膠溶液置于25 mL 小燒杯中,于10℃恒溫培養(yǎng)箱中孵化16~18 h,用質(zhì)構(gòu)分析儀測定凝膠強度。探頭直徑為12.7 mm,測試速度為0.5 mm·s-1。凝膠強度表示為穿透距離達(dá)到4 mm 時的最大力(g)。

    1.3.9 質(zhì)構(gòu)測定 參考Sow 等[23]的方法。將魚明膠溶液倒入模具中,于10℃恒溫箱孵化16~18 h,將膠體切成直徑2.2 cm、高1.5 cm 的圓柱體。探頭直徑為47 mm,測試程序:壓縮量40%,速度1.0 mm·s-1。

    1.3.10 掃描電子顯微鏡測量 參照Huang 等[9]的方法。將魚明膠膠體置于含2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液(0.2 mol·L-1,pH 值7.0)中,4℃條件下固定2 h。用蒸餾水沖洗3 次后,采用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇進(jìn)行逐級脫水。將干燥后的樣品置于樣品臺上并用導(dǎo)電膠帶固定,利用環(huán)境掃描電鏡在低真空模式下觀測膠體的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。測試電壓為10 kV,放大倍數(shù)為1 000×。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    每組試驗重復(fù)3 次,數(shù)值均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS 17.0 軟件處理分析數(shù)據(jù)。采用AI 軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 色度和透明度分析

    由表1可知,隨著TG 濃度的增加,DHPM-TG 修飾的魚明膠膠體的L值和溶液的濁度呈增大趨勢,TG 和DHPM-TG 修飾的魚明膠b?值呈降低趨勢(DHPM-TG4除外),說明TG 修飾可以改善魚明膠的表觀顏色。這可能是由于TG 催化魚明膠分子發(fā)生交聯(lián)生成大分子聚合物,改變了魚明膠的晶體結(jié)構(gòu),影響了其表觀顏色[20]。此外,在較低TG 濃度下,DHPM-TG 復(fù)合修飾的魚明膠L值略低于TG 系列膠體,這可能是由于DHPM處理改變了魚明膠的結(jié)構(gòu),影響了魚明膠對光的反應(yīng)特性。因此,低濃度DHPM-TG 復(fù)合修飾可以更好地改善魚明膠的表觀顏色。

    表1 修飾對魚明膠膠體(顏色、膠融溫度和凝膠強度)和溶液(濁度、特性粘度)物理特性的影響Table1 Effect of modification on the physical properties (color,melting temperature and gel strength)of fish gelatin gels and fish gelatin solution (opacity and intrinsicviscosity)

    2.2 特性粘度、膠融溫度和凝膠強度分析

    由表1可知,魚明膠的特性粘度和膠融溫度均隨著TG 濃度的增加而逐漸增大。這可能是由于TG 催化明膠分子中或分子間的賴氨酸和谷氨酸形成共價鍵,提高了魚明膠的分子量[24-26],從而提高了魚明膠的特性粘度與膠融溫度。然而,凝膠強度卻隨著TG濃度的增加呈先增大后減小的趨勢,且在TG 濃度為0.0100%時,魚明膠的凝膠強度最大。這可能是由于TG 過度交聯(lián)生成的聚合物阻礙了魚明膠分子的聚集,弱化了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的生成,導(dǎo)致凝膠強度降低[7,27]。與TG 系列魚明膠相比,DHPM-TG 復(fù)合修飾的魚明膠具有更高的特性粘度、膠融溫度和凝膠強度。這可能是由于DHPM 處理的魚明膠暴露出更多的交聯(lián)位點[18],有助于TG 催化魚明膠中谷氨酰胺殘基的γ-酰胺基和賴氨酸的ε-氨基之間進(jìn)行酰胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng),形成ε-(γ-Glu)-Lys(G-L)異型肽鍵,從而增強膠體的穩(wěn)定程度及其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的致密性。此外,與豬皮明膠的膠融溫度(30.13℃)和凝膠強度(298.67 g)相比[1],DHPM-TG3 和DHPM-TG4 的膠體具有類似于豬皮明膠的膠融溫度和凝膠強度。因此,DHPM-TG 復(fù)合修飾技術(shù)可明顯改善魚明膠的凝膠特性,可應(yīng)用于生產(chǎn)替代哺乳動物明膠。

    2.3 質(zhì)構(gòu)特性分析

    由表2可知,所有魚明膠膠體的硬度和咀嚼性均隨著TG 濃度的增加先增大后減小,且在TG 濃度為0.0100%時達(dá)到最大。DHPM-TG1 和DHPM-TG2 魚明膠的硬度均低于TG1 和TG2,而DHPM-TG3 和DHPM-TG4 的魚明膠硬度均高于TG3 和TG4,表明DHPM-TG 復(fù)合修飾技術(shù)在一定程度上可增大魚明膠的硬度。這可能是由于魚明膠經(jīng)過DHPM 處理后暴露出更多的可交聯(lián)位點[18],增大了魚明膠的交聯(lián)程度,膠體結(jié)構(gòu)更加致密。此外,TG 修飾和DHPM-TG復(fù)合修飾均會改變魚明膠膠體的粘性、彈性、凝聚力和膠黏性。因此,TG 修飾和DHPM-TG 復(fù)合修飾均可改善魚明膠的質(zhì)構(gòu)特性。

    表2 修飾對魚明膠凝膠的結(jié)構(gòu)特性的影響Table2 Effect of modification on the textural properties of modified fish gelatin gels

    2.4 掃描電子顯微鏡分析

    如圖1所示,未修飾的魚明膠膠體呈現(xiàn)較多的孔洞,隨著TG 濃度的增加,膠體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更加致密。這與Jongjareonrak 等[28]發(fā)現(xiàn)的TG 修飾的大眼鯛魚皮明膠具有致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)相一致。與TG 修飾的膠體相比,DHPM-TG 復(fù)合修飾的膠體結(jié)構(gòu)更加致密,這與其凝膠特性分析結(jié)果相一致。表明DHPM-TG 復(fù)合修飾技術(shù)使魚明膠膠體結(jié)構(gòu)更加致密,明顯提高了魚明膠的凝膠特性。

    圖1 修飾的魚明膠電鏡掃描圖(1 000×)Fig.1 Microstructure of modified fish gelatin (1 000×)

    3 討論

    魚明膠因具有類似于哺乳動物明膠的物理特性,被公認(rèn)為是一種潛在優(yōu)良的哺乳動物明膠替代品。但與哺乳動物明膠相比,魚明膠較差的凝膠特性限制了其在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用。因此,本研究分別采用TG 修飾和DHPM-TG 復(fù)合修飾技術(shù)對魚明膠進(jìn)行修飾,結(jié)果表明,TG 修飾和DHPM-TG 復(fù)合修飾技術(shù)均可有效提高魚明膠的特性粘度、膠融溫度、凝膠強度和硬度。

    凝膠強度、膠融溫度和特性粘度是評價明膠品質(zhì)的重要因素[1]。TG 可催化蛋白質(zhì)分子內(nèi)部或分子間發(fā)生交聯(lián),生成ε-(γ-Glu)-Lys(G-L)異型肽鍵,提高魚明膠的凝膠強度和膠融溫度;此外,生成的高分子量聚合物,可增大溶液的密度,增加流動阻力,降低水的流動性[26,29],從而增大魚明膠溶液的粘度。然而,高濃度的TG 易導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度交聯(lián),弱化凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),降低魚明膠的凝膠強度和硬度。Huang 等[2]發(fā)現(xiàn)魚明膠的膠融溫度隨著微生物谷氨酰胺酶(microbrial transglutaminase,MTGase)濃度的增大逐漸增大,而硬度則先增大后減小。此外,與TG 膠體系列相比,DHPM-TG 系列膠體具有更高的特性粘度、膠融溫度、凝膠強度和硬度,可能是由于DHPM 可以促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)折疊,暴露出更多的可催化位點,TG 催化魚明膠分子間或分子內(nèi)形成更多的ε-(γ-Glu)-Lys(G-L)異型肽鍵,膠體結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。這與葉云花等[18]研究發(fā)現(xiàn)DHPM-TG 改性技術(shù)可提高大豆分離蛋白凝膠強度的結(jié)果相一致。

    4 結(jié)論

    本研究結(jié)果表明,隨著TG 濃度的增加,魚明膠的亮度、濁度、特性粘度、膠融溫度均呈增大趨勢,凝膠強度和硬度先增大后減小。與TG 系列膠體相比,DHPM-TG 膠體具有更高的特性粘度、膠融溫度、凝膠強度和硬度,且DHPM-TG3 和DHPM-TG4 的膠體具有類似于豬皮明膠的膠融溫度和凝膠強度。綜上可知,與TG 修飾相比,DHPM-TG 復(fù)合修飾可明顯提高魚明膠的凝膠特性。但本試驗僅對比分析了TG 和DHPMTG 復(fù)合修飾對魚明膠凝膠特性的影響,有關(guān)其如何有效改善魚明膠的內(nèi)在分子機制還需進(jìn)一步探究。

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