超高效液相色譜-電化學(xué)檢測法測定石斛中的石斛酚

羅敏 ，顧雯 ，何婷 ，周昌喜 ，淳澤利 ，陳榮祥 *

1．遵義醫(yī)科大學(xué)分析測試中心（遵義 563000）；2. 遵義醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院（遵義 563000）；3. 遵義市理化分析測試工程技術(shù)研究中心（遵義 563000）

石斛屬蘭科植物，其種類主要有70多種，如金釵石斛、鐵皮石斛、鼓槌石斛、霍山石斛等，藥用部位為新鮮品或干燥的根莖。除藥用外，石斛作為保健食品的使用歷史也有幾千年之久。其中，代表性的品種鐵皮石斛原球莖在2012年被批準(zhǔn)為新資源食品，可直接沖泡或加工成飲品飲用[1]。有研究發(fā)現(xiàn)石斛具有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗糖尿病白內(nèi)障、治療心腦血管疾病、改善胃腸道運動等生理活性[2-4]。近年來，在具藥理活性的40多種石斛中分離出近100種化合物，包括多糖、萜、生物堿、酚、氨基酸、黃酮等[5-7]。其中，天然產(chǎn)物中的酚類化合物具有較強的藥理活性，例如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等[8]。石斛酚（Gigantol）是石斛中典型的酚類化合物，有研究表明石斛酚可抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展中可能有一定保護作用，可以幫助減少新生血管的生成[9]。石斛酚還可以增強細(xì)胞的抗氧化能力并保護高糖損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]，在抗腫瘤方面可以抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[11]。因此，石斛酚的水平可以作為衡量石斛品質(zhì)的重要標(biāo)志。

然而，對于石斛中石斛酚含量測定方法研究較少，大多采用液相色譜分離，紫外檢測器檢測[12-13]。然而，常規(guī)高效液相色譜多采用250 mm色譜柱，分析時間耗時較長，分離效率低。紫外檢測器的檢測靈敏度也較低，對于石斛酚含量較高的樣品來說，比較容易檢測，但是對于低含量的樣本則靈敏度不足，需要采用液相萃取或固相萃取等技術(shù)進行富集后檢測。例如，采用分散液-液微萃取技術(shù)對鐵皮石斛中的石斛酚進行富集，富集倍數(shù)可達27.94倍[12]。然而，復(fù)雜的前處理過程將極大增加時間和經(jīng)濟成本。因而，需要發(fā)展一種更靈敏、快速的方法來對石斛中的石斛酚進行測定。

電化學(xué)檢測器（ECD）靈敏度極高，同時具有良好的選擇性，在藥品和食品質(zhì)量控制方面發(fā)揮重要的作用[14-15]。酚類化合物的酚羥基活性較強，采用電化學(xué)檢測器在直流模式下即可進行檢測，因此酚類物質(zhì)適合運用電化學(xué)檢測器進行檢測[16-17]。在石斛酚結(jié)構(gòu)中，其苯環(huán)上有酚羥基和甲氧基，這2個基團在直流模式下很容易發(fā)生氧化，直接采用電化學(xué)檢測器在氧化模式下即可檢測。同時，采用超高效液相色譜可以縮短分離時間，提高分析效率。因此，試驗擬采用超高效液相色譜結(jié)合電化學(xué)檢測（UPLC-ECD）建立一種簡單、快速、靈敏的檢測方法，并用于不同品種石斛中石斛酚的測定，為合理評價石斛質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Ulti Mate 3000 bio-RS超高效液相色譜儀（美國賽默飛），配備ECD-RS 3000電化學(xué)檢測器（檢測池為6011庫倫檢測池）和DAD-3400 RS二極管陣列檢測器，工作站為Chromeleon 7.1；SB-5200DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；ME104E/02電子分析天平、FE 28 pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Purelab Chorus 2純水超純水系統(tǒng)（英國埃爾格）。

1.2 試驗材料與試劑

乙腈、乙酸銨、冰乙酸（均為色譜純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）；金釵石斛（產(chǎn)自廣西、四川）；鐵皮石斛（產(chǎn)自四川、貴州）；實驗室自制超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解，配制成100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

標(biāo)準(zhǔn)工作液：用上述配制好的100 mg/L石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，加甲醇稀釋，分別配制濃度為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00和10.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 石斛酚提取試驗

將石斛粉碎，過篩，稱取0.05 g樣品粉末，加入一定體積分?jǐn)?shù)的甲醇（50%，60%，70%，80%和90%）進行超聲輔助提取。設(shè)置提取時間分別為5，10，20，30和40 min，料液比為1∶50，1∶100，1∶200，1∶300和1∶500（g/mL）。提取液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后進行上機檢測。根據(jù)峰面積計算石斛酚的含量，以每克樣品中石斛酚的質(zhì)量代表提取率。

1.5 色譜條件

色譜柱Waters XBridge BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，填料粒徑1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相25 mmol/L乙酸銨溶液（pH 3.6）-乙腈65%∶35%（V/V），流速0.4 mL/min，進樣量1 μL；自動進樣器溫度4 ℃；ECD檢測電壓525 mV；二極管陣列檢測器檢測波長230 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

考察提取時間、提取溶劑以及料液比對石斛中石斛酚提取率的影響，分別對三者進行優(yōu)化，以獲得最佳的提取條件。

2.1.1 提取溶劑的選擇

酚類化合物通常采用甲醇、乙醇等進行提取，采用甲醇-水提取石斛中的石斛酚。固定料液比1∶300（g/mL）、提取時間10 min，分別用體積分?jǐn)?shù)50%，60%，70%，80%和90%的甲醇進行超聲提取，結(jié)果如圖1所示。石斛中石斛酚提取效率隨甲醇體積分?jǐn)?shù)（50%～70%）增大而增加，70%甲醇對石斛酚提取率最高，超過70%時，提取率有所下降，因而選擇體積分?jǐn)?shù)70%的甲醇作為提取溶劑。

圖1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對石斛酚提取效率的影響

2.1.2 料液比的影響

采用70%甲醇提取10 min，考察料液比分別為1∶50，1∶100，1∶200，1∶300和1∶500（g/mL）對石斛中石斛酚提取效率的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著料液比比例減小，石斛中石斛酚的提取率逐漸增大，料液比小于1∶300（g/mL）時，提取率趨于平緩。故采取料液比1∶300（g/mL）作為料液比。

2.1.3 提取時間的選擇

采用70%甲醇，料液比1∶300（g/mL），分別設(shè)置提取時間5，10，20，30和40 min，考察不同提取時間對于提取效率的影響，結(jié)果見圖3。提取時間超過10 min后，石斛酚提取率幾乎沒有任何變化，且提取率達到最大，故采取10 min作為提取時間。

因此，優(yōu)化后的最佳提取條件為：采用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇作為提取溶劑，料液比1∶300（g/mL），提取時間10 min。

圖2 料液比對石斛酚提取效率的影響

圖3 提取時間對石斛酚提取效率的影響

2.2 色譜條件的選擇及優(yōu)化

2.2.1 流動相條件的優(yōu)化

電化學(xué)檢測器相比于其他的檢測器有所不同，其在使用時流動相中需要有一定含量的緩沖鹽，通常需要大于20 mmol/L。故試驗采用乙酸銨作為流動相添加劑，通過調(diào)節(jié)有機相的比例以及流動相的pH改善分離。采用pH 7.0乙酸銨溶液時，石斛酚拖尾較為嚴(yán)重。加入冰乙酸后峰形顯著改善，然而過低的pH導(dǎo)致電化學(xué)檢測器的響應(yīng)降低。綜合考慮，選擇乙酸銨溶液（pH 3.6）-乙腈65%∶35%作為流動相。在此條件下，石斛酚能與其他雜質(zhì)完全分離開，且總分析時間較短，峰形對稱。

2.2.2 檢測電壓的選擇

在優(yōu)化的流動相條件下，將檢測池的電壓由0 mV逐漸升高至550 mV，將同一份樣品重復(fù)進樣，考察不同檢測電壓下石斛酚峰面積的變化，以確定最佳的檢測條件，結(jié)果見圖4。電壓低于250 mV時，石斛酚幾乎沒有氧化；電壓500 mV時，石斛酚氧化完全，繼續(xù)增大電壓石斛酚的峰面積增加緩慢，而噪音快速增加。故選擇525 mV作為石斛酚的檢測電壓。

圖4 不同檢測電壓下石斛酚的峰面積變化

2.3 色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確移取不同體積的石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品儲備液（100 mg/L），加甲醇稀釋，分別配制質(zhì)量濃度為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00和10.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照優(yōu)化后的色譜條件進行檢測，以峰面積y（nA·min）作為縱坐標(biāo)，樣品質(zhì)量濃度x（mg/L）作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。石斛酚的回歸方程為y=13.425x+0.177，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6；結(jié)果表明，石斛酚在0.1～10 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。按3倍信噪比計算檢出限為0.8 μg/L，石斛樣品中石斛酚方法檢出限為0.24 mg/kg。在優(yōu)化后的分離和檢測條件下，石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖5。

圖5 石斛酚標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.4 精密度、穩(wěn)定性和回收率考察

取同一份石斛提取液在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，對其進行精密度考察，記錄石斛酚的峰面積并計算RSD值，為1.90%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

石斛酚具有較強的還原性，在室溫下放置極易被氧化。取同1份供試品溶液，將自動進樣器溫度設(shè)置為4 ℃，對其重復(fù)進樣記錄峰面積的變化情況。結(jié)果表明，12 h內(nèi)，石斛酚的峰面積隨其時間變化比較穩(wěn)定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.39%，證明石斛酚在4 ℃下具有較好的穩(wěn)定性。

稱取已知石斛酚含量的石斛樣品，按照400，800和1 600 mg/kg進行加標(biāo)回收試驗，每個加標(biāo)濃度平行操作6次，計算回收率，結(jié)果見表1。不同加標(biāo)水平的回收率在97.53%～103.24%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%，說明方法準(zhǔn)確可靠。

表1 石斛酚的加標(biāo)回收率結(jié)果（n=6）

2.5 樣品測定

在優(yōu)化的提取條件和色譜條件下，分別對不同產(chǎn)地的鐵皮石斛、金釵石斛中的石斛酚進行測定，檢測結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，所有石斛樣品中均可檢出石斛酚，其含量介于51.7～800.2 mg/kg之間。實際樣品的色譜圖見圖6。

圖6 石斛樣品色譜圖（A，金釵石斛；B，鐵皮石斛）

表2 不同石斛中石斛酚含量

2.6 UPLC-ECD與其他方法的比較

制備同一份石斛提取液，按照優(yōu)化的色譜條件分別用UPLC-ECD與UPLC-DAD對其進行含量測定。除檢測器之外的其他條件均相同，結(jié)果如圖7所示。同一樣品在UPLC-ECD上響應(yīng)較好，信噪比高。而采用UPLC-DAD檢測，石斛酚的信號響應(yīng)低于儀器檢出限，無法檢出。

圖7 UPLC-ECD（A）與UPLC-DAD（B）檢測同一樣品的色譜圖比較（料液比1∶300 g/mL）

按照料液比1∶20（g/mL），采用70%甲醇超聲提取，制備高濃度的石斛酚提取液，并按照優(yōu)化后的色譜條件分別采用UPLC-ECD與UPLC-DAD進行測定，結(jié)果如圖8所示。該樣品中的石斛酚采用ECD和DAD檢測器均可檢出，但二者的信噪比差別顯著。ECD響應(yīng)較好，信噪比高，靈敏度遠高于DAD。盡管該條件下DAD可檢出石斛酚，但之前的提取條件優(yōu)化表明1∶20（g/mL）的料液比無法有效提取石斛酚，其檢測結(jié)果與真實值差異較大。因而，相對于DAD，采用ECD檢測石斛酚有明顯的優(yōu)勢，對于含量較高的樣品，在實際檢測過程中可以采用稀釋后進樣，減少樣品中弱極性組分在色譜柱中的殘留，色譜柱的污染程度大幅降低，延長色譜柱壽命，減少檢測成本。

對于石斛酚含量較低的石斛樣品，該方法的優(yōu)勢更為突出。有文獻表明鐵皮石斛中石斛酚含量非常低[18]，也有文獻采用HPLC檢測金釵石斛中石斛酚，結(jié)果含量甚微[19]?？梢姴煌贩N、不同產(chǎn)地的石斛中石斛酚差異很大，采用此次試驗建立的方法，所檢測的樣品中的石斛酚均可檢出，且信噪比較好，靈敏度高。

近年來，隨著液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的發(fā)展，有文獻采用該方法對石斛中的石斛酚、有機酸、黃酮等成分進行測定。例如，采用正離子多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式對石斛酚進行測定，檢出限可達0.2 μg/L[20]。方法采用電化學(xué)檢測器，檢出限與串聯(lián)質(zhì)譜在同一數(shù)量級（方法為0.8 μg/L），同串聯(lián)質(zhì)譜法相比，方法的儀器設(shè)備使用成本較低，且操作簡單，無需考慮不同樣本間基質(zhì)效應(yīng)的差異問題。

圖8 UPLC-ECD（A）與UPLC-DAD（B）檢測同一樣品的色譜圖比較（料液比1∶20 g/mL）

3 結(jié)論

通過對石斛中石斛酚的提取條件、液相色譜的分離條件和檢測條件進行優(yōu)化，建立UPLC-ECD對不同品種的石斛中石斛酚含量的檢測方法。將ECD檢測器同光學(xué)檢測器進行比較。結(jié)果表明該方法前處理簡單快捷、分離快速、靈敏度和準(zhǔn)確度高，能夠滿足不同品種石斛中石斛酚的檢測要求。