順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素通過降低SRPK1的表達抑制骨肉瘤細胞的惡性行為①

鐘秀波 繆繼東 李家偉 王 剛

(自貢市第四人民醫(yī)院腫瘤科，自貢 643000)

骨肉瘤是一種多發(fā)于兒童和青少年的惡性腫瘤，其具有高轉移率并且病情進展快速、致死率高等特征，因此導致骨肉瘤患者臨床治愈率差[1,2]。骨肉瘤是骨科最難治療的腫瘤，其發(fā)生發(fā)展過程復雜，往往伴隨著炎癥因子的釋放和癌細胞、淋巴結轉移[3,4]。目前有研究表明骨肉瘤發(fā)生的分子機制可能與腫瘤免疫有關，多種腫瘤免疫相關蛋白均參與了腫瘤細胞的增殖、轉移和侵襲等過程，而腫瘤免疫信號通路又與多種磷酸激酶相互作用，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起到不同的作用[1，5，6]。目前臨床上常用的骨肉瘤化療藥物順鉑具有一定的副作用，例如腎毒性和嚴重的嘔吐，因此針對順鉑臨床應用，降低其臨床使用劑量具有一定的臨床意義[7]。祖國傳統(tǒng)中醫(yī)藥博大精深，白花蛇舌草素作為一味傳統(tǒng)中藥具有增強免疫功能和抗腫瘤作用[8]。本研究采用順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素體外給藥處理骨肉瘤細胞，觀察藥物聯(lián)合作用對骨肉瘤惡性生物學行為的影響及潛在的機制，為臨床上順鉑和白花蛇舌草素的聯(lián)合用藥提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1患者來源 本研究共納入2017年1月～2018年10月自貢市第四人民醫(yī)院收治的63例骨肉瘤患者和同期63例骨肉瘤患者正常組織。納入標準：①所有患者均首次來院就診，并且經過病理檢驗科診斷證實，均未經過任何治療；②無傳染病和血液傳染?。虎蹆山M性別、年齡的差異無統(tǒng)計學意義，且均無其他骨病或系統(tǒng)性疾病。排除標準：①患有嚴重傳染性疾??；②對醫(yī)囑依從性差，無法配合研究者；③合并用藥嚴重感染、心腦血管疾病以及肝腎功能嚴重障礙者。本研究獲得自貢市第四人民醫(yī)院倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。

1.1.2試劑 骨肉瘤細胞系MG-63和Saos-2購自中國科學院上海細胞庫；白花蛇舌草素(SX20190124)購自四川省食品藥品檢驗院；順鉑購自Sigma公司(P4394)、蛋白定量試劑盒(P503021-0500)、SDS凝膠試劑盒(P0012A)、細胞裂解液(P0013)、結晶紫(P8470-25g)均購自上海吉瑪生物有限公司；DMEM(SH30021)、胎牛血清(SH30406)、胰蛋白酶消化液(SV30042)購自美國 HyClone；青鏈霉素混合液(P1400)、4%多聚甲醛(P1110)、苯胺藍(28631-66-5)和蘇木素(C0107)均購自武漢依科有限公司，β-actin(ab179577)、SRPK1(ab346089)和兔二抗(ab150077)購自英國Abcam。PrimeScriptTMRT試劑盒(R0047A)和SYBR(RR1297)購自中國TaKaRa。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色 石蠟切塊進行脫蠟和水化處理，抗原修復后滴加封閉液；1∶500稀釋HGF一抗孵育；孵育結束后用PBS進行沖洗，加生物素標記的二抗進行孵育；PBS再次沖洗，滴加鏈親和素-過氧化酶溶液孵育。次日DAB顯色液顯色，蘇木素染液復染，中性樹脂膠固封；PBS作為一抗陰性對照組，陽性細胞著色為棕黃色。

1.2.2CCK-8實驗 調整MG-63和Saos-2細胞數(shù)為 4×105個/孔，Control組細胞直接鋪板，Cisplatin組細胞貼壁后給藥1.5 μmol/L(Cisplatin)，Cisplatin+HD組細胞貼壁后給藥1.5 μmol/L(Cisplatin)+30 μg/ml(HD)，37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)1 d、2 d 和3 d。培養(yǎng)結束后每孔加入20 μl CCK-8，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內避光孵育2 h，室溫于搖床振蕩10 min。酶標儀490 nm波長處檢測同一時間點OD 值，用測得的OD值進行細胞增殖影響的分析。

1.2.3克隆形成實驗 細胞分組同1.2.2，細胞接種5 d后每孔各加500 μl胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)。 貼壁生長15 d后，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min。固定后用0.1%結晶紫溶液染色15 min，PBS 輕輕沖洗細胞，室溫風干后計數(shù)多于50個細胞的克隆。

1.2.4qRT-PCR 細胞分組同1.2.2，培養(yǎng)箱設定37℃、5% CO2進行細胞培養(yǎng)36 h后收集細胞，向細胞中加入1 ml Trizol試劑以提取總RNA，嚴格按照PrimeScriptTMRT試劑盒的說明將RNA逆轉錄成cDNA，隨后加引物和SYBR Green。PCR反應程序如下：95℃ 5 s，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸15 s，40個循。每個樣本設3個復孔。使用β-actin作為參考標準，使用2-ΔΔCt計算mRNA的相對表達水平。引物序列如下：β-actin：F 5′-ACCCACTCCTCCACCTTTG-3′；R 5′-CACCACCCTGTTGCTGTAG-3′；SRPK1：F 5′-ATGCTTTCCTTCGACACCCGAT-3′；R 5′-TCCCTGGCGTCGACCAA-3′。

1.2.5Western blot 細胞分組同1.2.2，培養(yǎng)箱設定37℃、5% CO2進行培養(yǎng)細胞36 h后收集細胞，PBS洗滌1 min后加含有蛋白酶抑制劑的裂解液放置冰上裂解，30 min后高速離心(13 000 r/min)吸取蛋白。蛋白定量完成后加上樣緩沖液，沸水煮5 min。SDS-PAGE電泳后轉膜，轉膜成功后用脫脂牛奶進行封閉，PBST清洗，均為1∶1 000稀釋β-actin、PI3K及p-Smad7，室溫孵育1 h后4℃過夜。次日反復清洗條帶，加入兔二抗室溫孵育90 min，PBS反復沖洗，發(fā)光拍照。

1.2.6RNA轉錄組測序 檢測RNA質量，首先用DNA酶Ⅰ處理RNA樣品防止樣品污染，隨后dT磁珠富集mRNA，再將mRNA片段化成短片段，合成cDNA的第一鏈，再進行末端修復和腺嘌呤添加。最后，將測序銜接子連接到片段上，通過PCR擴增富集片段。使用Agilent 2100 Bioanaylzer實時PCR系統(tǒng)對樣品庫進行鑒定和定量，通過Illumina HiSeqTM4000對文庫產物進行測序。比對數(shù)據用于計算參考基因的讀數(shù)分布和映射比率，進行下游分析，包括基因表達和基于基因表達的深度分析(PCA，相關性，篩選差異表達的基因等)。

2 結果

2.1白花蛇舌草素抑制骨肉瘤細胞的增殖 分別用0～40 μg/ml白花蛇舌草素處理體外骨肉瘤細胞，發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草素對骨肉瘤細胞MG-63的抑制作用呈濃度依賴性，且作用3 d后 30 μg/ml白花蛇舌草素對骨肉瘤細胞的抑制作用最強，因此后續(xù)實驗以30 μg/ml為白花蛇舌草素作用濃度。見圖1。

2.2順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素抑制了骨肉瘤細胞的增殖能力 CCK-8(圖2A、C)和克隆形成實驗(圖2B、D)結果均表明，順鉑和白花蛇舌草素聯(lián)合給藥可以顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖能力，其抑制作用明顯強于順鉑單獨給藥組，差異具有統(tǒng)計學意義，(P<0.05)。

2.3順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素抑制了骨肉瘤細胞的遷移能力 細胞劃痕實驗結果顯示順鉑和白花蛇舌草素聯(lián)合給藥可以顯著抑制骨肉瘤細胞的劃痕愈合能力，并且其抑制作用強于順鉑單獨給藥組(圖3A、B)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素抑制了骨肉瘤細胞的侵襲能力 Transwell實驗結果顯示順鉑和白花蛇舌草素聯(lián)合給藥可以顯著抑制骨肉瘤細胞的侵襲能力，并且其抑制作用強于順鉑單獨給藥組(圖4A、B)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5白花蛇舌草素給藥后降低骨肉瘤細胞SRPK1

圖1 不同濃度白花蛇舌草素對MG-63細胞增殖能力的影響Fig.1 Effects of different concentratin Hedyotis diffusa on proliferation of MG-63 cellsNote: ***.P<0.001.

的表達 RNA-seq技術檢測順鉑給藥和聯(lián)合給藥組MG-63細胞給藥后各基因在RNA水平表達差異，結果發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫相關蛋白SRPK1在聯(lián)合給藥后在MG-63細胞中下調明顯。推測白花蛇舌草素可能通過降低SRPK1的表達來增強順鉑的抑瘤作用，隨后在RNA(圖5A)和蛋白水平(圖5B)分別在MG-63和Saos-2細胞水平進行了驗證。結果發(fā)現(xiàn)SRPK1在順鉑和白花蛇舌草素聯(lián)聯(lián)合給藥組表達最低，且明顯低于順鉑單獨給藥組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖2 白花蛇舌草素增強順鉑抑制MG-63和Saos-2細胞增殖能力Fig.2 Hedyotis diffusa enhances ability of cisplatin to inhibit proliferation of MG-63 and Saos-2 cellsNote:A,C.CCK-8 test to detect the proliferation of MG-63 and Saos-2 cells by Hedyotisin combined with cisplatin;B，D.Clone formation test to test MG-63 and Saos-2 cell clone forming ability.**.P<0.01,***.P<0.001.

圖3 白花蛇舌草素增強順鉑抑制MG-63和Saos-2細胞劃痕愈合能力Fig.3 Hedyotis diffusa enhances ability of cisplatin to inhibit scratch healing of MG-63 and Saos-2 cellsNote:A.Scratch test to detect the healing of MG-63 cells in different treatment groups;B.Scratch test to detect healing of Saos-2 cells in different treatment groups.*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.

圖4 白花蛇舌草素增強順鉑抑制MG-63和Saos-2細胞侵襲能力Fig.4 Hedyotis diffusa fortunei enhances invasive ability of cisplatin to inhibit MG-63 and Saos-2 cellsNote:A.Trans-well test detects the invasion ability of MG-63 cells in different treatment groups;B.Transwell test detects the invasion ability of Saos-2 cells in different treatment groups.*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 白花蛇舌草素聯(lián)合順鉑組MG-63細胞和Saos-2細胞SRPK1均表達降低Fig.5 Reduced expression of SRPK1 in MG-63 cells and Saos-2 cells of Hedyotis diffusa combined with cisplatin groupNote:A.RNA-seq differential gene heat map;B and C.qRT-PCR and western blot to detect SRPK1 expression in MG-63 cells in different treatment groups;D and E.qRT-PCR and Western blot to detect SRPK1 expression in Saos-2.**.P<0.01.

圖6 SRPK1在腫瘤組織和正常組織中的表達Fig.6 SRPK1 expression in tumor tissues and normal tissuesNote:***.P<0.001.

圖7 白花蛇色草素提高順鉑對PI3K/AKT/TOR信號通路抑制Fig.7 Hedyotis diffusa enhances inhibition of PI3K/AKT/TOR signaling pathway by cisplatinNote:A.KEGG analysis of enrichment of differential fund pathways;B.Western blot detection of PI3K/AKT/TOR signal-related protein expression in MG-63 cells of different treatment groups.**.P<0.01,***.P<0.001.

2.6SRPK1在骨肉瘤組織中的表達 免疫組化染色，結果發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，骨肉瘤組織中SRPK1表達明顯較多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖6)。

2.7白花蛇舌草素增強順鉑抑制PI3K/AKT/TOR信號通路作用 通過RNA-seq結果進行KEGG分析，結果表明白花蛇舌草素給藥處理后骨肉瘤細胞內SRPK1下調倍數(shù)最明顯，同時KEGGE分析結果顯示其與PI3K/AKT/TOR信號通路相關，因此qRT-PCR檢測不同處理組骨肉瘤細胞PI3K/AKT/TOR信號通路相關蛋白的變化，結果顯示順鉑可以有效抑制PI3K和Akt蛋白磷酸化從而促進mTOR的表達，而白花蛇舌草素進一步加強抑制作用。見圖7。

3 討論

骨肉瘤因其具有高轉移和增殖能力，導致患者5年存活率較低[9]。臨床治療過程中骨肉瘤具有容易復發(fā)和治療效果不佳等特點[10]。順鉑是臨床治療骨肉瘤的常用化療藥物，具有一定的副作用[11]。隨著祖國傳統(tǒng)醫(yī)藥研究的不斷深入，傳統(tǒng)中草藥對腫瘤的治療成為研究熱點。白花蛇舌草為一年生披散草本，其成藥味苦、淡，性寒，主要功效是清熱解毒、消痛散結、利尿除濕，尤善治療各種類型炎癥[12]。在臨床實踐中，發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草素若配伍得當，可治療多種疾病[13]。目前研究表明其提取物可以通過刺激網狀內皮系統(tǒng)，增加白細胞吞噬功能以提高血清殺菌力，提高免疫功能，同時白花蛇舌草素在體內對白血病細胞如急性粒細胞白血病細胞、急性淋巴性白血病細胞有抑制作用[14]；白花蛇舌草素素對小白鼠腹水肝癌細胞有抑制、殺滅作用[15]。

研究順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素對MG-63和Saos-2細胞增殖的影響，結果發(fā)現(xiàn)與空白對照組和順鉑單獨給藥組相比，聯(lián)合給藥組顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖作用，初步說明白花蛇舌草素和順鉑聯(lián)合給藥起到協(xié)同抑瘤作用。用細胞劃痕和Transwell實驗檢測聯(lián)合給藥對骨肉瘤細胞轉移和侵襲能力的影響，結果與增殖結果相似，聯(lián)合給藥組細胞不論是遷移能力還是侵襲能力均被顯著抑制，且抑制效果強于順鉑單獨給藥組。進一步證實了二者的協(xié)同抑瘤作用。

為了探討其可能的作用機制，使用RNA-seq技術檢測順鉑聯(lián)合白花蛇舌草素組和順鉑單獨給藥組之間差異基因在RNA水平的變化，結果顯示腫瘤免疫相關蛋白SRPK1在聯(lián)合給藥組中的表達明顯低于順鉑單獨給藥組，因此推測白花蛇舌草素可能是通過抑制SRPK1的表達從而起到協(xié)同抑瘤作用，隨后檢測了兩種骨肉瘤細胞MG-63和Saos-2經過不同給藥處理后SRPK1的表達，結果發(fā)現(xiàn)不論在MG-63細胞還是Saos-2細胞SRPK1在聯(lián)合給藥組的表達最低，與RNA-seq結果相吻合。除了在體外的檢測外，進一步在臨床腫瘤標本進行了免疫組化染色檢測SRPK1的表達，結果顯示SRPK1在骨肉瘤腫瘤組織中的表達顯著高于正常組織。說明SRPK1對骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展起到促進作用，而白花蛇舌草素可以通過抑制腫瘤免疫相關蛋白SRPK1的表達與順鉑聯(lián)合給藥有效抑制了骨肉瘤細胞在體外的增殖、轉移和侵襲等一系列惡性生物學行為。

文獻報道通過敲低SOX2靶向抑制SRPK1介導的PI3K/AKT信號通路抑制皮膚基底細胞癌細胞的遷移和侵襲能力[16]；miR-216b 通過靶向SRPK1抑制大結腸癌的增殖、遷移和侵襲[17]；靶向作用SRPK-1的嵌合抗體可以抑制非小細胞肺癌增殖、遷移和侵襲[18]；microRNA-1296通過靶向SRPK1介導的PI3K/AKT途徑來抑制肝細胞癌的轉移和上皮-間質轉化[19]。而KEGG分析結果進一步顯示在骨肉瘤中白花蛇舌草素同樣作用于PI3K/AKT/TOR信號通路，蛋白分析結果進一步驗證了KEGG分析結果，白花蛇舌草素可以提高順鉑抑制PI3K和Akt蛋白磷酸化的作用，從而抑制PI3K/AKT/TOR信號通路的激活。但是在骨肉瘤中PI3K/AKT/TOR信號通路與SRPK1的關系如何，對其腫瘤免疫機制的研究將成為下一步重點關注的研究熱點。