肺結核活動程度對結核感染T 細胞斑點試驗反應強度的影響

萬 榮，李明武，李光妹，朱惠瓊，馬 萌，劉 才

（昆明市第三人民醫(yī)院結核二科，云南昆明 650041）

結核病仍然是全球十大死因之一，是高于艾滋病在內的單一傳染病中的頭號殺手。每年有數(shù)以百萬的人口罹患結核病。2018 年，全球范圍內估算有1 000 萬（范圍：900～1 110 萬）結核病新發(fā)病例，我國是結核病高發(fā)國家之一，2011～2018 年我國肺結核病報告發(fā)病率一直是全國甲乙類傳染病第二位，2017 年發(fā)病率達60.63/10 萬[1]全球報告。因此早期診斷和治療結核病尤為重要。γ-干擾素釋放試驗為一種新的免疫學檢查方法，已增加到WS288-2017《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準－肺結核診斷》[2]。T-SPOT.TB 作為γ－干擾素釋放試驗一種，其檢測原理是以早期分泌抗原ESAT-6（作為抗原A）和培養(yǎng)濾過蛋白CFP-10（作為抗原B）為結核特異性抗原，刺激T 細胞釋放IFN-γ，通過形成的免疫斑點數(shù)快速診斷結核分枝桿菌的感染，其斑點形成細胞數(shù)反映結核病患者外周血中受結核特異抗原刺激分泌IFN-γ 的T 細胞的頻率強度[3]。本研究采集活動性肺結核患者的靜脈血，采用T-SPOT.TB 檢測分析機體結核病的病情程度對結核特異性抗原應答強度的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018 年6 月1 日至2018 年12 月31 日期間昆明市第三人民醫(yī)院結核二科收住院的400 例活動性肺結核患者為研究對象，所有患者均進行了結核感染T 細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）。180 例病原學陽性且T-SPOT.TB 陽性肺結核患者173 例，其中男性104 例，平均年齡（43.8±17.5）歲，女性69 例，平均年齡（43.7±17.6）歲。220 例病原學陰性且T-SPOT.TB 陽性肺結核患者190 例，其中男性108 例，平均（45.0±18.9）歲，女性82例，平均年齡（44.9±17.8）歲。比較病原學陽性和陰性肺結核患者結核特異性抗原（ESAT-6、CFP-10）應答強度。同時將173 例病原學陽性且T-SPOT.TB 陽性肺結核患者進行以下分組：按照抗酸桿菌涂片量（1 條～1+、2+、3+、4+），進行分組比較；按照治療史，分為初治、復治肺結核；按照耐藥狀況分為非耐藥、耐藥肺結核??；比較不同分組中，結核特異性抗原（ESAT-6、CFP-10）應答強度。具體分組及診斷標準參照《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準－肺結核診斷（WS 288-2017）》[2]及《中華人民共和國衛(wèi)生行標準－結核病分類（WS196-2017）》[4]。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT.TB 試驗方法 采集4 mL 外周血標本置于肝素鋰抗凝的試管中，立即混勻，在4 h內進行PBMC 分離。離心管中預先加入4 mL RPMI 1640 液，將混勻的4 mL 抗凝全血加入離心管中，混勻。另一離心管中預先加入3 mL 淋巴細胞分離液，將混勻的8 mL 細胞懸液緩慢加入淋巴細胞分離液上方，1 600 g 離心22 min，用加樣槍吸取白細胞層到15 mL 離心管中。再加入RPMI 1640 至11 mL，600 g 離心7 min，棄去上棄去上清液。加入AIMV 培養(yǎng)液至11 mL，350 g 離心7 min，棄去上清液。加入0.7 mL AIMV 液，充分搖勻使細胞懸液混勻。吸取10 μL 細胞懸液于40 μL 錐蟲蘭染液中混勻再吸取10μL 加入細胞計數(shù)板上計數(shù)。每份標本調整至每毫升250 萬個PBMC。取出T-SPOT.TB 試劑盒內微孔板，根據(jù)標本量取出板條。1 份標本需4 個微孔板，陰性對照加AIMV，陽對照加植物血凝素（試劑盒內提供），另外2 個孔分別加入抗原A（ESAT-6）和抗原B（CFP-10）各50 μL，然后每孔分別加入100 μL 細懸液（即含有250 000 個PBMC 的懸液）。將微孔板放入5%CO2孵箱中孵育16～20 h，用pH6.8～7.2 的PBS液洗板。加入堿性磷酸酶標記的小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體50 μL，2～8℃冰箱孵育1 h，再用PBS 液洗板，最后每孔加入顯色液50 μL。避光室溫靜置7 min，用蒸餾水沖洗后觀察結果。用放大鏡觀察記錄每個孔中的斑點。陰性斑點數(shù)為0～5個，抗原A 和抗原B 檢測孔計數(shù)-陰性孔計數(shù)≥6判為陽性。如果陰性對照孔斑點數(shù)≥6，檢測孔斑點數(shù)≥2 倍陰性孔斑點數(shù)判為陽性。

1.2.2 實驗室病原學檢查 抗酸桿菌涂片、結核菌培養(yǎng)及藥敏、痰G-xpert 檢測及痰基因芯片等結核相關檢查參照實驗室流程操作。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料呈偏態(tài)分布，以M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗進行比較。計數(shù)資料采用χ2檢驗進行比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 病原學陽性和陰性肺結核T-SPOT.TB 結果比較

180 例病原學陽性肺結核T-SPOT.TB 總的陽性率96.1% （173/180），220 例病原學陰性肺結核T-SPOT.TB 總的陽性率86.4%（190/220），兩者行χ2檢驗比較，有統(tǒng)計學差異（χ2=11.205，P=0.001＜0.05）。病原學陽性且T-SPOT.TB 陽性173例肺結核中，ESAT-6 陽性率為96.0%（166/173）、CFP-10 陽性率為93.6% （162/173），病原學陰性且T-SPOT.TB 陽性190 例肺結核中，ESAT-6 陽性率為84.7% （161/190）、CFP-10 陽性率為88.9%（169/190），病原學陽性肺結核和陰性肺結核ESAT-6 比較有明顯統(tǒng)計學差異（χ2=12.753，P=0.000＜0.05）；病原學陽性肺結核和陰性肺結核核CFP-10 比較無統(tǒng)計學差異（χ2=2.482，P=0.115＞0.05），見表1。

表1 病原學陽性和陰性肺結核T-SPOT.TB 結果比較［n（%）］Tab.1 Comparison of T-SPOT.TB results of pathogenic positive and negative tuberculosis ［n（%）］

2.2 根據(jù)抗酸桿菌涂片量比較T-SPOT.TB 反應強度

常規(guī)抗酸桿菌涂片量（AFB）分為1 條～1+、2+、3+、4+，比較不同的AFB 量下抗原ESAT-6、CFP-10 反應強度。AFB1 條～1+共97例患者，抗原ESAT-6 和抗原CFP-10 的M（P25，P75）分別為（19，110）、（21，111）；AFB2+共40 例患者，分別為（30，85）、（18，108）；AFB3+共21例患者，分別為（22，93）、（38，120）；AFB4+共15例患者，分別為（25，66）、（13，108）。四組進行秩和檢驗，統(tǒng)計學無差異（P=0.795，0.595，均＞0.05），見表2。

表2 不同抗酸桿菌涂片量比較抗原ESAT-6、CFP-10 反應強度[n,M(P25,P75)]Tab.2 Comparing the response intensity of antigens ESAT-6 and CFP-10 in different Acid-fast bacilli smear amount [n,M(P25,P75)]

2.3 比較初治、復治肺結核T-SPOT.TB 的反應強度

按照治療史，分為初治、復治肺結核。初治肺結核121 例，抗原ESAT-6 和抗原CFP-10 的M（P25，P75）分別為（30，86）、（21，116）；復治肺結核52 例，分別為（11，85）、（20，100）。兩組間進行秩和檢驗，抗原ESAT-6 在初、復治肺結核比較中有統(tǒng)計學差異（Z=-2.178，P=0.005＜0.05），抗原CFP-10 比較無統(tǒng)計學差異（Z=-0.856，P=0.392＞0.05），見表3。

表3 初治、復治肺結核比較ESAT-6、CFP-10 反應強度[n，M（P25，P75）]Tab.3 Comparing the response intensity of antigens ESAT-6 and CFP-10 in the primary treatment and retreatment of tuberculosis[n，M（P25，P75）]

2.4 比較耐藥、非耐藥肺結核T-SPOT.TB 的反應強度

按照耐藥相關監(jiān)測，分為耐藥肺結核和非耐藥肺結核。耐藥肺結核病25 例，抗原ESAT-6 和抗原CFP-10 的M（P25，P75）分別為（12，110）、（16，110）；非耐藥肺結核病148 例，分別為（25，85）、（21，110）。兩組間進行秩和檢驗，P=0.238，0.789，均＞0.05，無統(tǒng)計學差異，見表4。

表4 耐藥與非耐藥肺結核病比較抗原ESAT-6、CFP-10 反應強度Tab.4 Comparing the response intensity of antigens ESAT-6 and CFP-10 in non-drug-resistant and drug-resistant tuberculosis

3 討論

T-SPOT.TB 檢測是采用結核分枝桿菌特異性抗原ESAT-6 和CFP-10（遺傳基因RD1 區(qū)丟失），其蛋白編碼來源于結核分枝桿菌基因中的一個菌種特異性基因片段，被稱為RD1，這個基因片段在大部分枝桿菌及所有環(huán)境分枝桿菌（包括卡介苗）中不存在，因此ESAT-6 和CFP-10 作為抗原有較高敏感性和特異性[5]。本研究結果顯示病原學陽性180 例肺結核，T-SPOT.TB 檢測的靈敏度達96.1%，220 例病原學陰性肺結核T-SPOT.TB 檢測的靈敏度達86.4%，顧國林[6]等進行的菌陽和菌陰肺結核患者T-SPOT.TB 檢測的靈敏度94.2%。景淑賢等[7]評價T-SPOT.TB 在活動性結核病診斷中的應用價值，T-SPOT.TB、TB-Ab、抗酸染色的靈敏度分別為94.55%、40.00%、10.91%，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

關于T-SPOT.TB 的臨床研究多在其臨床靈敏度方面的研究，但關于影響T 細胞斑點試驗反應強度的臨床報告較少。羅紅衛(wèi)[8]探討年齡因素對T-SPOT.TB 檢測結果的影響，結果顯示年齡組定義值與T-SPOT.TB 檢測結果呈負相關，相關系數(shù)r＝-0.138，P＝0.001。潘麗萍等[9]也研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB 在年輕的疑似肺結核患者中（14～59歲）有較好的臨床意義，但在老年患者中其診斷價值有相對下降。本組病例的平均年齡在43～45歲，對其診斷結果影響不大。

關于利用T-SPOT.TB 中的抗原ESAT-6、CFP-10 在不同病情狀態(tài)下的研究尚未見有相關報道。本研究發(fā)現(xiàn)病原學陽性和陰性兩組肺結核患者T-SPOT.TB 陽性率分別為96.1%，86.4%，比較有統(tǒng)計學差異，特別是抗原ESAT-6 陽性率比較有統(tǒng)計學差異，CFP-10 陽性率比較無差異。徐茜[10]等研究發(fā)現(xiàn)痰菌陰性組和痰菌陽性組T-SPOT.TB陽性率分別為85.0%，94.1%，兩者統(tǒng)計學比較無差異。病原學陽性且T-SPOT.TB 陽性173 例肺結核患者中，按照抗酸桿菌涂片量（1 條～1+、2+、3+、4+）進行分組比較，四組抗原ESAT-6、CFP-10 進行比較，無統(tǒng)計學差異。昆明市第三人民醫(yī)院檢驗科同樣也發(fā)現(xiàn)T 細胞斑點數(shù)可反映體內的結核分枝桿菌負荷[11]。按治療史分初治、復治肺結核，兩組間ESAT-6、CFP-10 比較，其中抗原ESAT-6 在初、復治肺結核比較中有統(tǒng)計學差異，抗原CFP-10 比較也無統(tǒng)計學差異；按照耐藥狀況分非耐藥、耐藥肺結核，兩組間抗原ESAT-6、CFP-10 比較無統(tǒng)計學差異。由以上結果可以看出：T-SPOT.TB 陽性檢出率在病原學陽性肺結核中較高，且反映其免疫強度抗原ESAT-6 有統(tǒng)計學差異。周玉利[12]等也研究發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB陽性標本中，抗原ESAT-6 陽性且CFP-10 陰性比例高于抗原ESAT-6 陰性且CFP-10 陽性的比例?？傊Y核感染T 細胞斑點試驗對診斷活動性肺結核的敏感性較好，利用其應答強度反映結核感染活動程度有一定臨床意義，特別是早期分泌蛋白抗原ESAT-6 有較大的臨床意義。

總之，結核感染T 細胞斑點試驗對診斷活動性肺結核的敏感性較好，利用其應答強度反映結核感染活動程度有一定臨床意義，特別是早期分泌蛋白抗原ESAT-6 有較大的臨床意義。