血管內(nèi)皮祖細胞外泌體調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞基因表達譜芯片

魏韓笑，張愛君，李 強，金培生

（徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院整形外科，江蘇徐州 221000）

糖尿病創(chuàng)面（簡稱糖創(chuàng)）遷延不愈是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一，致死致殘率高。糖創(chuàng)治療困難且極易復(fù)發(fā)，是臨床上治療的重點、難點。傳統(tǒng)治療方法是皮片或皮瓣移植，但存在局部血液供應(yīng)不良引起皮片或皮瓣壞死。密集的血管網(wǎng)不僅可以將有害代謝產(chǎn)物導(dǎo)出微環(huán)境、排出機體，更重要的是把細胞因子及基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)攜帶到組織缺損區(qū)域[1]。血管內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是內(nèi)皮細胞的前體，是成體干細胞中的一種。EPCs 常與MSCs 聯(lián)合用于微血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。EPCs 不僅有促進組織快速血管化的能力，并且對與其共培養(yǎng)的其他種子細胞也具一定的有營養(yǎng)支持作用[2]，這為臨床上治療組織器官缺血性疾病帶來希望。

研究表明，EPCs 和其他類型干細胞性質(zhì)類似，存在進入機體后無法充分定向分化的技術(shù)瓶頸[3]。因此，EPCs 來源的外泌體為組織修復(fù)和再生開辟了嶄新道路。外泌體是細胞分泌的直徑在40～150 nm 的微囊泡，常以胞吞的形式進入受體細胞，通過“重編程”相關(guān)基因來發(fā)揮作用[4]。因此本研究擬通過基因芯片方法篩選可能在EPC-exos 調(diào)控MSCs 生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用的相關(guān)基因，探索EPC-exos 調(diào)控MSCs 發(fā)揮干細胞優(yōu)越性的具體機制，為后續(xù)外泌體靶向修復(fù)糖尿病創(chuàng)面打下理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 芯片樣本（細胞來源）

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stromal cells，MSCs）和血管內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells derived from peripheral blood，EPCs）均取自同新西蘭大耳白兔，10 周齡，體重約（1 000±50）g，實驗動物均由徐州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，質(zhì)量合格。

1.2 主要試劑和耗材

TRIzol Reagent P/N 15596-018 Invitrogen Life Technologies，Poly-A RNA Control Kit P/N 900433 Affymetrix。

Hybridization Control Kit P/N 900454 Affymetrix。

1.3 細胞復(fù)蘇

細胞復(fù)蘇應(yīng)用文獻報道方法進行分離鑒定MSCs 和EPCs[5-6]，復(fù)蘇細胞后更換干細胞培養(yǎng)液，調(diào)整細胞數(shù)量約為為105/mL，于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 EPC-Exos 的獲取和鑒定

EPCs 在無血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，用超速離心法提取培養(yǎng)液中的外泌體，BCA 法檢測其蛋白濃度。Western Blotting 檢測表達內(nèi)皮祖細胞外泌體表達CD9、CD63 和Alix 情況[7]。

1.5 構(gòu)建聯(lián)合培養(yǎng)裝置

棄培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液，收集細胞。用血球計數(shù)板計數(shù)細胞，取104MSCs 和EPC-Exos 懸液，建立共培養(yǎng)體系，同時設(shè)立單獨MSCs 培養(yǎng)組，以此方法制備送檢樣本。每孔分別滴入2 mL 含有10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，次日換液，連續(xù)培養(yǎng)14 d 后送檢。

1.6 總RNA 質(zhì)檢和雜交芯片

Trizol 提取total RNA，使用分光光度計和電泳技術(shù)定量檢測。取芯片，滴入對應(yīng)雜交液，45℃，60 r/min 旋轉(zhuǎn)雜交約16 h。

1.7 數(shù)據(jù)提取及分析

通 過AGCC 軟 件（Affymetrix GeneChip，Command Console Software）記下探針（Probe）的熒光信號大小。校正背景，將探針信號綜合整理成探針組（Probeset），遺傳物質(zhì)片段利用歸一化將非生物學(xué)因素清除掉。刪去數(shù)據(jù)集中沒有注釋的探針及同時對應(yīng)多個基因的探針，關(guān)鍵基因表達分析采用軟件SPSS 23.0 對最終篩選出的關(guān)鍵基因進行兩獨立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)

倒置相差顯微鏡下見與外泌體共培養(yǎng)的MSCs于72 h 后貼壁狀態(tài)（圖1A），相比較MSCs 單獨培養(yǎng)組，細胞大量增殖（圖1B），出現(xiàn)較多突觸連接，多數(shù)細胞巢式生長，鏡下可見大量復(fù)層細胞。

2.2 EPC-exos 鑒定

從EPCs 中分離出外泌體，并進行透射電鏡、Western Blot 外泌體標(biāo)記蛋白檢測。外泌體呈典型圓形和橢圓形，WB 檢測Alix、CD9、CD63 呈高表達（圖2）。

2.3 待測樣本的Scatter Plot

樣品經(jīng)質(zhì)量檢測后顯示參數(shù)符合質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。為研究EPC-exos 對MSCs 增殖、分化等功能的影響，本研究對與EPCs-exos 聯(lián)合培養(yǎng)的MSCs 和單獨培養(yǎng)的MSCs 間基因表達有差異者進行檢測。結(jié)果顯示EPC-exos 對MSCs 的基因表達影響較大（圖3）。

圖1 顯微鏡下觀察兩組細胞生長情況Fig.1 The cell growth status under microscope

圖2 EPC-exos 經(jīng)WB 檢測Alix、CD9、CD63 呈高表達Fig.2 High expression of Alix、CD9 and CD63 of EPC-exos by Westernblot

圖3 EPC-exos 影響MSCs 基因差異表達情況Fig.3 The differentially expressedgenes of MSCsinfluenced by EPC-exos

圖4 EPC-exos 影響MSCs 差異表達基因GO 分析Fig.4 GO analysis of differentially expressed genes of MSCs cultured with EPC-exos

2.4 差異表達基因

進行GO 功能富集和KEGG 通路富集，分析使用DAVID，篩查差異基因表達，總數(shù)據(jù)顯示差異共1 772 個基因，上調(diào)者664 個，下調(diào)者1 108個，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.5 MSCs 基因差異表達的Gene ontology（GO）分析

GO 富集分析分為三個方面，分別是：分子功能、生物學(xué)過程、細胞組分。利用對基因芯片結(jié)論中差異表達基因的Ontology 研究，筆者發(fā)現(xiàn)染色體、著絲粒等結(jié)構(gòu)差異基因表達活躍，細胞器定位發(fā)生影響。這些都與MSCs 增殖、細胞周期等密切相關(guān)；通過觀察EPC-exos 調(diào)控MSCs 顯著富集的通路，筆者發(fā)現(xiàn)細胞周期、P53 通路及酮體合成和降解影響最大（圖4～圖5）。

圖5 EPC-exos 調(diào)控MSCs 顯著富集通路的影響Fig.5 Significant Enriched pathway of MSCs cultured with EPC-exos

2.6 EPC-exos 調(diào)控MSCs 差異表達基因的Pathway 分析

為了進一步明確EPC-exos 調(diào)控MSCs 增殖和分化的機制，通過KOBAS 數(shù)據(jù)庫對基因芯片的結(jié)果進行分析。通過分析認為EPC-exos 調(diào)控MSCs增殖分化主要通過細胞周期和MARK 通路進而激活MSCs 增殖分化相關(guān)信號傳導(dǎo)的過程。圖6 分別展示的是EPC-exos 對MSCs 影響的信號通路中的一些關(guān)鍵基因（紅色背景）。

圖6 EPC-exos 調(diào)控MSCs 差異表達基因CELL CYCLE 分析Fig.6 EPC-exos regulates CELL CYCLE analysis of MSCs differentially expressed genes

3 討論

近年來，基因測序技術(shù)和基因芯片等高通量檢測技術(shù)的迅速更新迭代使生物學(xué)功能進入更加微觀和精準(zhǔn)的研究中。從這些數(shù)據(jù)中可以挖掘出數(shù)以萬計甚至百萬的與生物體生理、病理過程相關(guān)的基因集。大數(shù)據(jù)時代中科技融合產(chǎn)生科技創(chuàng)新，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中健康和疾病的表征變得簡單和準(zhǔn)確，技術(shù)的進步和診斷儀器的精準(zhǔn)化使當(dāng)代醫(yī)學(xué)得到迅猛發(fā)展[8]。

再生醫(yī)學(xué)是當(dāng)代生命醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、計算機學(xué)、工程學(xué)等有機結(jié)合形成的新興學(xué)科。各個學(xué)科相互引證結(jié)合以解決人類重大疾病問題。組織器官再造是再生醫(yī)學(xué)的重要范疇之一。近年來再生醫(yī)學(xué)的研究逐漸深入，包括細胞治療、微環(huán)境治療、基因靶向治療和組織工程等，學(xué)科和范疇間交叉并且互相滲透。

細胞是再生醫(yī)學(xué)中真正的工程師。隨著再生醫(yī)學(xué)中精準(zhǔn)醫(yī)療時代的開啟，生物樣本采集和測序逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。生物樣本庫為基因、細胞靶向治療或藥物開發(fā)提供了豐富的生物樣本和數(shù)據(jù)，推動著腫瘤、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病等重大疾病的研究和治療進展[9]。在機體眾多細胞中，干細胞是最具潛力的細胞之一。胚胎干細胞或成體干細胞均可自我更新和多項分化，機體在正常生理狀態(tài)通過干細胞增殖分化來代謝更新衰老和死亡細胞，在病理狀態(tài)下可通過干細胞歸巢招募來實現(xiàn)機體修復(fù)[10]。除此之外，各類干細胞可分泌不同細胞因子、生長因子等參與生物體的生理病理過程。

目前對血管內(nèi)皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）特點和機制有了越來越詳盡的認識，但是在應(yīng)用方面，因為生物體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性和多樣性，EPCs 進入活體后的應(yīng)用面臨各種瓶頸。比如因子及信號傳導(dǎo)通路的網(wǎng)絡(luò)性、細胞策略如何迅速建立組織血管化、進入機體后無法充分定向分化等[11]。

外泌體的靶向治療作用可避免細胞治療時移植異體活細胞而帶的免疫排斥反應(yīng)，降低干細胞注入后對全身造成的影響，加快實現(xiàn)臨床無細胞修復(fù)，對進一步臨床研究和應(yīng)用推廣有重要的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)意義。外泌體攜帶的內(nèi)含物（LncRNA、miRNA，mRNA，DNA 和蛋白質(zhì)等）能夠影響受體細胞的生理狀態(tài)[12]。EPC-exos 是來源于EPCs 的外泌體，研究報道EPC-exos 在促進創(chuàng)面愈合方面可能作用機制如下：（1）在創(chuàng)面的局部微環(huán)境下，外泌體參與誘導(dǎo)分化為創(chuàng)面修復(fù)所必需的成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞和血管內(nèi)皮細胞等；（2）外泌體可能具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制作用，可通過調(diào)控創(chuàng)傷后成纖維細胞向肌纖維細胞分化的調(diào)控作用；（3）外泌體促進創(chuàng)傷局部或循環(huán)中的細胞遷移、増殖和新血管形成[13]。

大量臨床前研究證實骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stromal cells，MSCs）在治療糖尿病創(chuàng)面上具備良好的前景。部分研究已經(jīng)進入臨床觀察。Kyung 等[14]將糖尿病創(chuàng)面患者分為治療組和對照組，證實異體脂肪來源的MSCs 應(yīng)用于糖尿病創(chuàng)面，12 周后實驗組創(chuàng)面閉合率遠高于對照組。現(xiàn)階段干細胞的主要移植方式有血管內(nèi)注射和局部注射，但存在劑量層次不好控制且細胞存活時間段等問題，因此如何能加速創(chuàng)面組織血管化進程是目前干細胞應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵問題。

本研究通過構(gòu)建EPC-exos 與MSCs 共培養(yǎng)獲取EPC-exos 與MSCs 共培養(yǎng)后的MSCs 差異表達顯著的基因，通過生物信息分析數(shù)據(jù)，尋找這些基因所影響細胞代謝特點和信號通路以及這些基因可能涉及的疾病，在分子水平闡述EPC-exos 對MSCs增殖、分化和趨化運動等作用機制。從基因芯片的分析結(jié)果來看，MSCs 與EPC-exos 共培養(yǎng)后，MSCs 產(chǎn)生大量表達差異基因共1 772 個，上調(diào)者664 個，下調(diào)者1 108 個。差異基因集中于細胞周期相關(guān)構(gòu)如染色體、著絲粒等。從KOBAS 數(shù)據(jù)Pathway 分析結(jié)果中可以看到，眾多的差異基因在細胞周期和MARK 等通路中起著作用，我們猜測EPC-exos 調(diào)控MSCs 增殖分化是一個主要通過調(diào)控細胞周期和MARK 通路進而激活MSCs 增殖分化相關(guān)信號傳導(dǎo)的過程。

體外細胞和組織模型是病理生理學(xué)研究、疾病建模、藥物開發(fā)和個性化治療策略開發(fā)工作流程中的重要一步。出于這些目的，科學(xué)和制藥研究都采用了體外干細胞模型，因其可以很好反映待測數(shù)據(jù)，并且相對于動物實驗，實驗人員可以更精準(zhǔn)的實施變量調(diào)控。目前干細胞在體外培養(yǎng)方式，如支架細胞模型、類器官或芯片器官，可以克服二維培養(yǎng)系統(tǒng)的局限性，并更好地模擬組織結(jié)構(gòu)和功能。目前基因組編輯和基因治療技術(shù)的出現(xiàn)對干細胞疾病模型的有效建立產(chǎn)生顯著推動作用。本研究討論EPC-exos 調(diào)控MSCs 基因表達的差異影響，并在基因芯片的高通量背景下挖掘檢測結(jié)果并對產(chǎn)生的差異基因進行相關(guān)預(yù)測。

細胞、基因產(chǎn)業(yè)已成為當(dāng)下全球生物醫(yī)藥行業(yè)、生命科技前沿探索最重要的領(lǐng)域之一[15]。但是目前的研究還存在許多瓶頸，例如如何安全合理地將實驗室成果應(yīng)用于臨床，如何建立行之有效的評價體系；如何最大可能減少干細胞對機體致瘤性等等，這些問題的解決都還有很長的路要走。