顯微光譜成像裝置研制與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

劉東奇，孔勇發(fā)

（南開大學(xué) 物理科學(xué)學(xué)院，天津 300071）

顯微光譜成像技術(shù)是一種通過有機(jī)整合光學(xué)顯微成像技術(shù)和光譜分析技術(shù)，給出待測(cè)樣品光學(xué)分辨率下的空間位置信息和與之相對(duì)應(yīng)的光譜信息的成像探測(cè)技術(shù)。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了空間顯微成像分辨能力和光譜探測(cè)能力的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可以完成光學(xué)分辨率下的空間成像和位置定位，同時(shí)可以提供樣品的光譜成分分析以及不同光譜成分的選擇性成像。顯微光譜成像技術(shù)在生物熒光成像、醫(yī)學(xué)成像、熒光材料研制等領(lǐng)域都有著廣泛應(yīng)用，是在這些領(lǐng)域中進(jìn)行科研的有效實(shí)驗(yàn)手段[1-6]。

近些年來，如何將科學(xué)研究中常用的一些實(shí)驗(yàn)技術(shù)融合到實(shí)驗(yàn)教學(xué)中是高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的熱點(diǎn)課題之一[7-8]。目前，南開大學(xué)物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心在已開設(shè)的物理實(shí)驗(yàn)課程基礎(chǔ)上，依托本校優(yōu)勢(shì)學(xué)科和已設(shè)立的自制實(shí)驗(yàn)教學(xué)儀器設(shè)備等項(xiàng)目，正在逐步將部分研究成果轉(zhuǎn)化為具體的物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，為物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革提供有益的嘗試?；诖?，本實(shí)驗(yàn)中心嘗試研制了顯微光譜成像裝置，并自行編寫了該裝置的控制和成像軟件。該裝置主要通過振鏡將激發(fā)光束反射進(jìn)入顯微物鏡聚焦在樣品某一位置處，此位置處的樣品經(jīng)激發(fā)后發(fā)出熒光，熒光被同一物鏡收集，透過雙色鏡后進(jìn)入熒光采集光路，探測(cè)器獲取該位置處的熒光和光譜數(shù)據(jù)；通過有序控制光譜儀和振鏡，計(jì)算機(jī)將有序采集的某一區(qū)域的光譜信號(hào)和相應(yīng)位置信息進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，獲得該區(qū)域樣品的顯微光譜圖像?；谠摴庾V成像裝置，設(shè)計(jì)了自組熒光顯微鏡、白光照明成像、熒光光譜測(cè)量和光譜成像等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。

1 光譜成像裝置的光路設(shè)計(jì)和搭建

自組顯微光譜成像裝置是基于我校物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心已搭建的自組熒光顯微鏡，通過在自組熒光顯微鏡光路中加入振鏡裝置實(shí)現(xiàn)對(duì)激光光束和熒光光束的位置控制，再通過編寫軟件有序控制振鏡和光譜儀之間的聯(lián)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)顯微光譜成像功能。其中，自組熒光顯微鏡的搭建可參見文獻(xiàn)[9]。顯微光譜成像裝置的光路設(shè)計(jì)見圖1，主要由光源光路、可控激光掃描光路和熒光收集光路等組成，具體包括激光光源、白光光源、平面反射鏡、可移動(dòng)位置的平面反射鏡、雙色鏡、掃描振鏡、透鏡、物鏡、三維平移臺(tái)、熒光樣品、CMOS相機(jī)、光纖光譜儀等。光源光路包括532 nm 激光光源和白光光源，兩者可以通過可移動(dòng)的平面反射鏡實(shí)現(xiàn)激光激發(fā)成像和白光照明成像之間的自由切換。激光光束經(jīng)雙色鏡和振鏡反射后，依次經(jīng)過透鏡、物鏡后聚焦到裝載于三維平移臺(tái)的樣品上，樣品受激發(fā)出的熒光被同一物鏡收集，經(jīng)透鏡、振鏡、雙色鏡進(jìn)入后方熒光采集光路，后方的CMOS 相機(jī)完成熒光圖像采集或白光照明圖像采集，光纖光譜儀完成光譜數(shù)據(jù)的采集，兩者可以通過可移動(dòng)的平面反射鏡實(shí)現(xiàn)CMOS探測(cè)光路和光纖光譜儀光路的自由切換。通過計(jì)算機(jī)控制振鏡位置，進(jìn)而控制激光光束聚焦位置和熒光采集位置，再通過計(jì)算機(jī)軟件有序控制振鏡和光譜儀之間的聯(lián)動(dòng)，實(shí)現(xiàn)樣品的逐點(diǎn)掃描、光譜數(shù)據(jù)的采集和實(shí)時(shí)處理以及光譜圖像的獲得。

圖1 顯微光譜成像裝置光路

顯微光譜成像裝置的光學(xué)元件主要從大恒光電公司和索雷博公司購置。所用的熒光樣品為CdTeCdS量子點(diǎn)。整個(gè)裝置采用反射式光路，激發(fā)光路和熒光光路共用同一物鏡，且配有白光光源可以隨時(shí)完成白光照明成像，光學(xué)圖像清晰，配合三維平移臺(tái)的操作可以方便地隨時(shí)觀察大范圍樣品和定位樣品區(qū)域。該裝置的光譜測(cè)試范圍為350～1 050 nm，可以完成可見光到近紅外光范圍內(nèi)的光譜信號(hào)采集和分析。

2 顯微光譜成像

顯微光譜圖像采集工作由自行編寫的計(jì)算機(jī)控制軟件完成。圖2 是光譜成像軟件的控制流程圖。光譜成像軟件的整個(gè)工作流程如下：利用LabVIEW 編寫程序，控制掃描振鏡和光譜儀；計(jì)算機(jī)主機(jī)上的主程序輸出坐標(biāo)位置（Xi, Yi）給掃描振鏡，掃描振鏡的X軸驅(qū)動(dòng)電機(jī)和Y 軸驅(qū)動(dòng)電機(jī)帶動(dòng)反射鏡轉(zhuǎn)動(dòng)，使光斑移動(dòng)到（Xi, Yi）位置處；光纖光譜儀采集此處的熒光光譜并存儲(chǔ)，主程序提取光譜數(shù)據(jù)，獲得坐標(biāo)（Xi, Yi）處的特定波段的熒光光譜強(qiáng)度值并存儲(chǔ)；隨后主程序輸出坐標(biāo)位置（Xi+1, Yi+1）給掃描振鏡，重復(fù)后續(xù)過程，獲得坐標(biāo)（Xi+1, Yi+1）處的光譜數(shù)據(jù)；依次改變坐標(biāo)位置，重復(fù)上述過程N(yùn) 次，最終可獲得某一區(qū)域內(nèi)的樣品光譜圖像。

圖2 光譜成像軟件控制流程圖

以CdTeCdS 量子點(diǎn)為測(cè)試熒光樣品，襯底為石英。532 nm 激光光束激發(fā)樣品，可移動(dòng)的平面反射鏡將熒光光路切換到光譜儀光路，熒光信號(hào)經(jīng)透鏡聚焦后通過光纖進(jìn)入光譜儀完成光譜采集。圖3 是光纖光譜儀采集的量子點(diǎn)樣品的熒光光譜曲線，采集時(shí)間10 ms。從圖中可以看到，該量子點(diǎn)樣品的熒光峰值位于717 nm 處，整個(gè)熒光光譜范圍為650～800 nm，半高寬72 nm。

圖3 量子點(diǎn)熒光光譜

為了驗(yàn)證整個(gè)裝置的顯微光譜成像能力和所編控制軟件的可行性，在量子點(diǎn)熒光樣品上做了一個(gè)十字形的標(biāo)記。首先通過光路中的可移動(dòng)平面反射鏡切換成白光光源照明光路，熒光光路切換到CMOS 白光照明圖像采集光路，通過三維平移臺(tái)移動(dòng)樣品位置，使得十字形標(biāo)記進(jìn)入CMOS 相機(jī)視野中，調(diào)整合適的樣品位置后，得到十字形標(biāo)記所在區(qū)域的白光照明灰度值圖像，如圖4(a)所示；隨后通過搭建的顯微光譜成像裝置對(duì)該十字形標(biāo)記所在區(qū)域進(jìn)行熒光光譜圖像采集，設(shè)定單個(gè)光譜的采集時(shí)間為10 ms，共采集10 000組光譜數(shù)據(jù)，獲得的十字形標(biāo)記所在區(qū)域的光譜圖像如圖4(b)所示，圖中所用顏色為偽色，對(duì)應(yīng)光譜強(qiáng)度值。為了凸顯十字形標(biāo)記所在區(qū)域的白光照明圖像和光譜圖像以便相互對(duì)照，圖4(a)和4(b)僅顯示了部分成像結(jié)果。從圖4 可以看到，白光照明圖像和光譜圖像中的十字形標(biāo)記均清晰可見，形狀一致，表明兩者的成像區(qū)域是同一樣品區(qū)域。圖4(b)中用紅色虛線標(biāo)記的區(qū)域，其熒光光譜強(qiáng)度為背景強(qiáng)度，表明此處沒有量子點(diǎn)，這與圖4(a)中相同位置區(qū)域的白光照明圖像相對(duì)應(yīng)，圖4(a)中顯示灰白色，表明此區(qū)域沒有量子點(diǎn)或量子點(diǎn)極少，白光光束直接被石英襯底反射進(jìn)入探測(cè)光路。圖4(b)中用紅色實(shí)線標(biāo)記的區(qū)域，其熒光光譜強(qiáng)度值較大，表明這些區(qū)域有較多的量子點(diǎn)聚集，這與圖4(a)中相同位置區(qū)域的白光照明圖像相對(duì)應(yīng)，圖4(a)中顯示灰黑色，表明這些區(qū)域量子點(diǎn)較多，白光光束照射到量子點(diǎn)樣品上時(shí)，發(fā)生漫反射，僅有較少的白光被物鏡收集進(jìn)入探測(cè)光路。因此，獲得的光譜圖像和白光照明圖像是一一對(duì)應(yīng)的，表明我們的顯微光譜成像裝置和自行編寫的相應(yīng)控制軟件是可以完成顯微光譜成像測(cè)試的。

圖4 同一區(qū)域的量子點(diǎn)白光照明圖像和熒光光譜圖像

3 結(jié)語

在高校物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)課程中，光譜儀相關(guān)實(shí)驗(yàn)是一類基礎(chǔ)的、已被廣泛采用的物理光學(xué)實(shí)驗(yàn)[10-12]。本文通過自組顯微光譜成像裝置和相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以量子點(diǎn)熒光光譜測(cè)量和光譜成像為著力點(diǎn)，將科學(xué)研究中常用的光譜分析手段和顯微成像手段融合進(jìn)高校物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，對(duì)物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)方法和教學(xué)內(nèi)容進(jìn)行了大膽的改革探索，這將幫助學(xué)生在夯實(shí)光譜儀相關(guān)的基本實(shí)驗(yàn)技能和光路調(diào)節(jié)能力的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步拓寬科學(xué)研究視野，領(lǐng)會(huì)光譜成像相關(guān)技術(shù)。通過接觸振鏡和光譜儀等硬件的控制和相關(guān)軟件程序的編寫模式等方式，期望能夠培養(yǎng)和提高學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)和創(chuàng)新能力，為提高本科物理實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平和高校學(xué)生的培養(yǎng)質(zhì)量提供有益的思路。