醇脫氫酶在聚乙烯膜表面的固定化研究

郭夢雅，季書馨，谷鳳娟，孟子暉，劉文芳，王燕子

（1 北京理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京102488； 2 深圳大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東深圳518060）

引 言

醇脫氫酶（ADH）是一種重要的氧化還原酶，可以催化醇與醛、酮之間的可逆反應(yīng)[1]。ADH 固定于電極材料可制成多種用途的生物傳感器，例如，ADH乙醇生物傳感器可用于分析乙醇濃度，ADH甘油生物傳感器可利用ADH 催化甘油氧化為甘油酸，從而測量人尿中甘油濃度[2]。以ADH 為催化劑，可以生產(chǎn)重要化工原料和中間反應(yīng)物，例如，通過產(chǎn)ADH 的菌株進(jìn)行乙醇生產(chǎn)，相對(duì)于其他方法，具有操作簡便、產(chǎn)物更易獲得等優(yōu)點(diǎn)[3]。ADH 作為人和動(dòng)物重要的生理指標(biāo)，還可用于醫(yī)學(xué)研究，例如，檢測血清中的ADH活性可以診斷肝臟疾患[4]。

由于游離ADH 易受環(huán)境的影響而變性失活，且不易從反應(yīng)體系中分離和回收，使其工業(yè)應(yīng)用受到限制[5]。酶的固定化可有效提高酶的分離、回收效率以及重復(fù)利用性，且能提高酶的穩(wěn)定性[6]。ADH固定化使用的載體可以劃分為無機(jī)和有機(jī)材料兩大類。無機(jī)材料常用的有二氧化硅，其次還有金屬有機(jī)骨架、二氧化鈦、氧化石墨烯、多孔玻璃珠、Al2O3等[7?8]。這些材料的比表面積較高，因此可帶來較高的負(fù)載率和固定化效率，能顯著提高生物催化效率[9?10]。但顆粒材料不易分離，在使用過程中容易流失，與磁性材料復(fù)合后可改善其回收性[11?13]，但材料制備的煩瑣程度增加。有機(jī)材料種類繁多，無論是載體形狀還是表面性質(zhì)都具有很大的調(diào)控空間。常見的有聚合物顆粒、纖維以及聚合物膜。Alsafadi等[14]將來自嗜鹽古菌的ADH 共價(jià)固定到用金屬Co、Ni、Zn 和Ca 衍生后的環(huán)氧化聚甲基丙烯酸微球上，與游離酶相比，固定化酶的穩(wěn)定性、耐熱性和有機(jī)溶劑耐受性都有所提高。Shinde 等[15]用氯丙酰氯對(duì)聚乙烯醇（PVA）纖維載體表面的羥基進(jìn)行功能化，再用乙二胺胺化，最后用戊二醛（GA）將ADH 共價(jià)結(jié)合到PVA纖維表面，固定化后的ADH熱穩(wěn)定性改善，在重復(fù)使用8次后，保留其初始活性的60%。

聚合物膜作為酶固定化載體，有以下優(yōu)點(diǎn)：①組成易于調(diào)節(jié)、表面積大、有較高的孔隙率以及明確的孔徑和結(jié)構(gòu)，酶分子不僅可以固定在載體表面，也可以固定在孔隙中，固定化效率得到提高[16]；②穿過膜的反應(yīng)混合物相對(duì)更容易進(jìn)入酶的活性位點(diǎn)，可減少擴(kuò)散限制，提高反應(yīng)效率[17]；③有利于反應(yīng)混合物的分離和純化，可以在催化反應(yīng)的同時(shí)分離產(chǎn)物[17?18]。Luo 等[19]通過過濾將ADH 和谷氨酸脫氫酶截留在由聚丙烯（PP）支撐層和聚砜（PSF）表層構(gòu)成的反向不對(duì)稱膜上，制成固定化酶膜反應(yīng)器，與游離酶膜反應(yīng)器相比，提高了底物的轉(zhuǎn)化率和酶的重復(fù)利用率。Marpani等[20]先制備ADH、藻酸鹽和氯化鈣的混合物，然后在PSF 超濾膜表面通過凝膠誘導(dǎo)固定化酶，ADH 的固定化效率最高可達(dá)71.4%，甲醛轉(zhuǎn)化率為40%。Ismail 等[21]采用反向過濾法將ADH 固定在聚偏氟乙烯（PVDF）和聚醚砜（PES）膜上，ADH 的固定化效率分別為87.7%和70.9%，酶的相對(duì)活性能保持至少七個(gè)連續(xù)周期，PVDF 膜上甲醛的轉(zhuǎn)化率高達(dá)90%。Hoffmann 等[22]將ADH固定在聚1?乙烯基咪唑接枝的PSF膜上，與原始膜相比，酶負(fù)載量增加，酶活和穩(wěn)定性均得到提高，催化甲醛還原為甲醇，輔酶的轉(zhuǎn)化率大于94%。

聚乙烯（PE）中空纖維膜具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、耐微生物侵蝕和耐氧化性能，而且機(jī)械強(qiáng)度大、長期使用性能穩(wěn)定、不易降解[23?25]，在水處理、生物醫(yī)學(xué)、制藥、化工和食品等行業(yè)應(yīng)用廣泛[25?27]。載體表面經(jīng)紫外活化后可以用羧基聚合物進(jìn)行功能化，丙烯酸（AA）單體具有非?？斓木酆纤俾蔥17]，接枝的聚丙烯酸（PAA）鏈上的羧基能夠與生物分子的化學(xué)官能團(tuán)相互作用，改變材料的表面特征[28?29]。聚乙烯亞胺（PEI）是一種含有伯、仲、叔氨基的聚合物，在廣泛的條件下具有很強(qiáng)的陰離子交換能力，并且能夠在酶或載體上與不同的部分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)[30]，用PEI改性載體可以為酶的固定化提供大量的結(jié)合位點(diǎn)，為提高酶的負(fù)載率提供了可能性。

本文將以PE 中空纖維膜為載體，用PAA 羧基化改性后，采用兩種固定化ADH 的路線，分別考察固定化酶的工藝條件、催化反應(yīng)條件以及固定化酶的重復(fù)利用性。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

PE 中空纖維膜（膜厚0.2～0.4 mm，內(nèi)徑1 mm，孔徑0.3 μm），由中國科學(xué)院化學(xué)所贈(zèng)送，使用之前先用三氯乙烯浸泡12 h，然后用乙醇/丙酮溶液（體積比為1∶1）清洗24 h，最后用去離子水清洗后烘干；來源于釀酒酵母的醇脫氫酶（ADH）（凍干粉末，EC 1.1.1.1，288 U/mg 固體）和還原型輔酶I 二鈉鹽NADH（純度＞98%）購于Sigma 公司；枝化聚乙烯亞胺（分子量600，99%），購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%～40%的甲醛水溶液；二苯甲酮（BP），化學(xué)純，購于天津市博迪化工有限公司；丙烯酸（AA）、戊二醛，分析純，購于天津市福晨化學(xué)制劑廠；酸性橙7，分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N,N?二甲基甲酰胺、三氯乙烯、丙酮、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，分析純，均購于北京化工廠；1?（3?二甲氨基丙基）?3?乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC?HCl）、N?羥基琥珀酰亞胺（NHS），分析純，購于上海共價(jià)化學(xué)有限公司?？捡R斯亮藍(lán)G?250，分析純，購于Sigma 公司。二苯甲酮（BP），化學(xué)純，購于天津市博迪化工有限公司。

1.2 分析測試儀器

UV?6100 紫外?可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；Nicolet IS10 傅里葉變換紅外光譜儀（賽默飛世爾科技公司）；JSM?7500F 掃描電子顯微鏡（日本JEOL公司）。

1.3 PE膜表面改性

1.3.1 紫光接枝法改性PE 膜 將膜絲剪成1 cm 的小段，稱重后置于盛有0.24 mol/L BP 的丙酮溶液的石英瓶中，紫外光照7 min，室溫下磁力攪拌5 min。重復(fù)上述步驟兩次?；罨髮⒎磻?yīng)殘液倒出，加入配制好的濃度為1.89 mol/L 的AA 的水/乙醇混合溶液，通氮?dú)猓?0℃水浴下磁力攪拌10 min，紫外光照射7 min，再在40℃下反應(yīng)45 min。然后將膜絲依次用丙酮、N,N?二甲基甲酰胺、丙酮、去離子水清洗，烘干。接枝后的膜記為PAA?PE，用稱重法計(jì)算接枝率，接枝率為9.7%～14.3%。

1.3.2 PAA?PE 膜表面氨基化 將烘干后的膜絲加入100 ml 濃度為1%（質(zhì)量）的PEI 水溶液，40℃水浴中攪拌1 h，用去離子水清洗后烘干，記為PEI/PAA?PE，制備路線如圖1(a)所示。用酸性橙7法[31]測定膜表面氨基密度，為4.3×10?7～6.5×10?7mol/cm2。

1.4 ADH的固定化及表征

1.4.1 PEI/PAA?PE 膜固定化ADH 采用GA 分別與酶和PEI/PAA?PE 膜表面的氨基結(jié)合生成縮氨，實(shí)現(xiàn)酶的固定化。用2 ml 0.05 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液（PB）（pH 6.5）配制1mg/ml的ADH新鮮酶液，向其中加入GA 使其濃度為0.01%（質(zhì)量），再向反應(yīng)液中加入表面氨基總量為（1.3～1.4）×10?5mol 的PEI/PAA?PE 膜，然后放入搖床（30℃，140 r/min）反應(yīng)24 h。固定化結(jié)束后，將膜取出，用相同條件的PB 清洗，得到的固定化酶記為ADH?PEI/PAA?PE。固定化路線見圖1(a)，簡稱為路線1。

圖1 PEI/PAA?PE膜的制備及固定化ADH路線(a)與PAA?PE固定化ADH路線(b)Fig.1 Preparation of PEI/PAA?PE membrane and immobilization route of ADH on it(a)and immobilization route of ADH on PAA?PE(b)

1.4.2 PAA?PE 膜固定化ADH 在2 ml 的PB（0.05 mol/L，pH6.5）中加入10 根1 cm 的PAA?PE 膜絲，0.15 mmol/L 的EDC 和0.075 mmol/L 的NHS，在搖床（25℃，140 r/min）振蕩1 h，然后加入ADH 使其最終濃度為1 mg/ml，繼續(xù)振蕩24 h，然后將膜取出，清洗后得到ADH?PAA?PE。固定化路線見圖1(b)，簡稱為路線2。

1.4.3 固定化ADH 活力測定 反應(yīng)式見式（1）。用相同條件的PB 配制6 ml 包含38 mmol/L HCHO 和0.2 mmol/L NADH 的反應(yīng)液，加入一定量載有ADH的膜，在搖床（30℃，140 r/min）反應(yīng)2 min 后，取1.5 ml 反應(yīng)液，用紫外?可見分光光度計(jì)測定溶液中的NADH 在340 nm 處吸光度值的變化，計(jì)算反應(yīng)速率，單位μmol/(L·min)，同時(shí)做三組平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。對(duì)路線1，以固定化酶每分鐘轉(zhuǎn)化的NADH的物質(zhì)的量作為酶活（μmol/min，U），然后再除以固定化過程中酶的初始投入質(zhì)量，計(jì)算固定化酶的比活（U/mg）。

1.4.4 固定化效率測定 對(duì)路線2，用考馬斯亮藍(lán)法測固定化效率[32]。在50 μl 待測液中加入2 ml 考馬斯亮藍(lán)溶液，搖晃30 s 后遮光靜置5 min，使用紫外?可見分光光度計(jì)在波長595 nm 下測量吸光度值。根據(jù)固定化前后溶液吸光度值的變化計(jì)算固定化效率。

1.4.5 固定化酶的重復(fù)利用性測定 取新鮮的固定化ADH，反應(yīng)2 min 后測酶促反應(yīng)速率，以此作為100%。反應(yīng)后將膜取出，用PB 清洗后再次測定反應(yīng)速率，與初次使用時(shí)的反應(yīng)速率相比得到相對(duì)活性。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 PE膜表面改性前后的表征

圖2 PE(a)、PAA?PE(b)和PEI/PAA?PE(c)膜的紅外譜圖Fig.2 FTIR spectra of PE(a),PAA?PE(b)and PEI/PAA?PE(c)membrane

對(duì)改性前后的PE 膜進(jìn)行FTIR 表征。由圖2 可知，對(duì)改性前的PE 膜[圖2(a)]，在3000～2750 cm?1處的峰為—CH2的伸縮振動(dòng)峰，在1460 cm?1處的峰為C—H 鍵的彎曲振動(dòng)峰。改性后PAA?PE 膜[圖2(b)]，在1705 cm?1處出現(xiàn)了羧基中羰基（C O）的伸縮振動(dòng)的特征峰，證明PAA 成功接枝到了PE 膜表面。對(duì)于PAA/PEI?PE[圖2(c)]，在1398 cm?1處出現(xiàn)了C—N 的彎曲振動(dòng)峰，在1540 cm?1處出現(xiàn)了N—H的彎曲振動(dòng)峰，在1635 cm?1處出現(xiàn)了酰胺中羰基（C O）的伸縮振動(dòng)峰，證明PEI 成功地接枝到了PAA?PE 膜表面。但在3300～3500 cm?1處沒有觀察到N—H 的伸縮振動(dòng)峰，可能是由于接枝到膜表面的氨基主要以叔胺和仲胺的形式存在，而伯胺較少的緣故[33]。

圖3為PE中空纖維膜外表面的SEM 圖，從圖中可以看出，PE 原膜外表面分布著一些膜孔[圖3(a)]；接枝PAA 后，膜孔變小并有少許凸起，證明表面聚合物層的引入[圖3(b)]；進(jìn)一步用PEI 改性后，表面變化不明顯[圖3(c)]。

2.2 PEI/PAA-PE固定化ADH條件的優(yōu)化

圖3 PE中空纖維膜外表面的SEM照片F(xiàn)ig.3 SEM micrographs of PE,PAA?PE and PEI/PAA?PE

首先，在GA 濃度為0.02%（質(zhì)量）條件下，考察了固定化過程中緩沖液pH 對(duì)固定化酶催化性能的影響。由圖4(a)可知，當(dāng)緩沖液pH 從5.0 增加到7.0時(shí)，催化反應(yīng)的速率先增大后減小；pH 為6.0 時(shí)，反應(yīng)速率達(dá)到最大值，為7.87 μmol/(L·min)。這可能是由于在固定化過程中PEI/PAA?PE 表面的氨基會(huì)引起緩沖液局部pH升高，導(dǎo)致適宜pH向酸性偏移。但酶分子中的氨基與GA 形成的席夫堿在酸性條件下不穩(wěn)定[34]，導(dǎo)致固定化效率降低，所以，pH 也不能過低。

其次，在5～45℃范圍內(nèi)，考察了固定化過程中搖床溫度對(duì)固定化ADH 催化性能的影響。由圖4(b)可以看出，當(dāng)溫度從5℃升高到15℃時(shí)，反應(yīng)速率變化不大；當(dāng)溫度繼續(xù)升高，反應(yīng)速率幾乎呈線性降低；至35 和45℃時(shí)，反應(yīng)速率下降到15℃時(shí)的72.1%和63.6%。由此可見，采用GA 固定化ADH時(shí)，固定化溫度最好不要超過15℃，否則酶容易失活。

接著，考察了固定化過程中酶濃度對(duì)固定化酶催化性能的影響。由圖4(c)可知，當(dāng)酶濃度從0.2 mg/ml 增加到1.0 mg/ml 時(shí)，反應(yīng)速率從2.92 μmol/(L·min)增加到8.63 μmol/(L·min)，原因可能是酶負(fù)載量隨酶濃度增加而相應(yīng)增加。然而，隨著酶濃度增加，酶比活先減小，然后基本不變。說明隨著酶濃度增加，酶的利用率下降；當(dāng)酶濃度為0.6～1.0 mg/ml 時(shí)，酶濃度增加的比例剛好等于反應(yīng)速率增加的比例，所以比活變化不大。

最后，考察了固定化過程中GA 濃度對(duì)固定化酶催化性能的影響。由圖4(d)可知，當(dāng)不加GA 時(shí)，酶也可以負(fù)載上去，因此顯示出一定的催化活性。當(dāng)GA 濃度從0 增加到0.01%(質(zhì)量)時(shí)，反應(yīng)速率從7.4 μmol/(L·min)增加到9.6 μmol/(L·min)；然而，當(dāng)GA 濃度進(jìn)一步增加到0.15%(質(zhì)量)，反應(yīng)速率幾乎呈線性下降；再繼續(xù)增加至0.2%(質(zhì)量)，反應(yīng)速率基本不變。說明低濃度GA 的加入有利于酶分子結(jié)合到膜表面，但隨著GA 濃度的增加，酶分子內(nèi)部及分子之間通過GA形成交聯(lián)聚集體的可能性增加[35]，廣泛的交聯(lián)可能導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)變形，使得底物的可接近性和適應(yīng)性降低，因此酶活降低[36]。

2.3 PAA-PE固定化ADH條件的優(yōu)化

首先，保持PAA?PE 膜用量不變，在EDC 和膜表面羧基的摩爾比為4∶1 的條件下，通過改變NHS的量，考察了EDC 和NHS 的摩爾比（EDC∶NHS）對(duì)酶固定化效率和催化性能的影響。由圖5(a)可知，隨著EDC∶NHS 增大（即NHS 濃度的降低），固定化效率逐漸降低；當(dāng)體系中不添加NHS（1∶0）時(shí)，ADH的固定化效率僅為20.1%。固定化過程中，EDC 和膜表面的羧基反應(yīng)生成O?酰基脲中間體，進(jìn)而和酶分子的氨基反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺鍵[37]，但是O??；逯虚g體不穩(wěn)定極易水解，導(dǎo)致酰胺鍵生成效率低，NHS的加入可以將不穩(wěn)定的O??；逯虚g體轉(zhuǎn)化為較穩(wěn)定的琥珀酰亞胺酯，提高偶聯(lián)效率[31,38]。從圖5(a)還可以看到，不添加NHS時(shí)，反應(yīng)速率僅為5.1 μmol/(L·min)；隨著EDC∶NHS 增大，固定化酶催化反應(yīng)的速率先增加后降低；當(dāng)EDC∶NHS 為1∶0.5時(shí)，反應(yīng)速率最大，為8.5 μmol/(L·min)。這是因?yàn)?，隨著NHS 濃度增加，酶的固定化效率逐漸增加，酶促反應(yīng)速率隨之增加，但當(dāng)NHS 濃度過高時(shí)（EDC∶NHS＜1∶0.5），化學(xué)反應(yīng)可能破壞了酶分子的一部分活性位點(diǎn)，導(dǎo)致固定化酶活力降低。

接著，保持其他條件不變，考察了固定化時(shí)間對(duì)酶固定化效率和催化性能的影響。由圖5(b)可知，當(dāng)固定化時(shí)間從12 h 延長到36 h 時(shí)，固定化效率由28.2%增加到50.2%；此后，固定化效率不再隨時(shí)間延長而增加，可能是因?yàn)榇藭r(shí)反應(yīng)已達(dá)到飽和；當(dāng)固定化時(shí)間繼續(xù)延長至60 h，固定化效率反而有輕微下降，可能是因?yàn)镋DC 水解成相應(yīng)的脲衍生物而失去其活化羧基的能力[39]。從圖5(b)還可以看出，隨著固定化時(shí)間的延長，固定化酶催化反應(yīng)的速率先增加后降低，在24 h 時(shí)達(dá)到最大。原因可能是，在24 h 之前，固定化酶的活性主要由固定化效率決定，固定到膜上的酶越多，酶促反應(yīng)速率越大；24 h 以后，隨著時(shí)間延長，盡管負(fù)載的酶量不斷增加，但由于在25℃下長時(shí)間振蕩，酶活性逐漸降低，導(dǎo)致酶促反應(yīng)速率下降。

最后，在pH 5.5～7.5范圍內(nèi)，考察了固定化過程中緩沖液pH 對(duì)酶固定化效率和催化性能的影響。由圖5(c)可知，隨著pH 增大，固定化效率先逐漸降低，然后保持不變；pH 5.5 時(shí)，固定化效率最高，為95.3%。這說明弱酸性條件有利于酶固定。前已述及，固定化過程中會(huì)生成琥珀酰亞胺酯，而該酯與氨基在弱酸性條件下反應(yīng)[40]。不同的是，隨固定化pH 的增加，酶促反應(yīng)速率先增大后減??；當(dāng)pH 為6.5 時(shí)，所得固定化酶的催化反應(yīng)速率最大。這說明，當(dāng)pH＜6.5 時(shí)，盡管酶固定化效率較高，但ADH可能失活；當(dāng)pH＞6.5 時(shí)，盡管此時(shí)固定化效率已不再降低，酶活卻有所下降。可能是由于pH 6.5 最有利于酶活的保持，高于或者低于該值，ADH 活性都會(huì)下降。

圖4 固定化pH(a)、溫度(b)、酶濃度(c)和GA濃度(d)對(duì)ADH?PEI/PAA?PE 催化性能的影響Fig.4 Effects of pH(a),temperature(b),enzyme(c)and GA concentration(d)in the process of immobilization on the catalytic performance of ADH?PEI/PAA?PE

2.4 固定化酶催化反應(yīng)的最適條件

首先，考察了反應(yīng)pH 對(duì)固定化ADH 催化性能的影響。由圖6(a)可知，對(duì)于ADH?PEI/PAA?PE，當(dāng)pH 從6.0 增加到6.5 時(shí)，反應(yīng)速率從7.2 μmol/(L·min)增加到8.6 μmol/(L·min)；當(dāng)pH 進(jìn)一步增加，反應(yīng)速率幾乎呈線性下降。對(duì)于ADH?PAA?PE，當(dāng)反應(yīng)pH 從5.5 增加到6.0 和6.5 時(shí)，反應(yīng)速率從6.2 μmol/(L·min)增加到10.2 μmol/(L·min)和10.7 μmol/(L·min)；當(dāng)pH 進(jìn)一步增加，反應(yīng)速率線性下降。兩種固定化ADH 的最適反應(yīng)pH 均為6.5，這和游離酶是一致的。過酸或過堿的環(huán)境可能會(huì)影響ADH 的構(gòu)象，使其變性失活，或者影響不同氨基酸殘基攜帶的電荷，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)解折疊和催化活性喪失[1,41]。

相同pH 下，ADH?PAA?PE 的催化反應(yīng)速率均高于ADH?PEI/PAA?PE。在最優(yōu)pH（6.5）條件下，前者是后者的1.2 倍，原因可能是EDC/NHS 法反應(yīng)條件相對(duì)溫和[42]。但固定化ADH 的活性較游離酶均有較大程度的下降，反應(yīng)速率分別為游離酶體系的12.4%和10.0%，這可能是由于共價(jià)反應(yīng)破壞了酶分子部分活性位點(diǎn)，從而導(dǎo)致固定化酶活性降低。

然后，在15～40℃范圍內(nèi)，考察了反應(yīng)溫度對(duì)固定化ADH 和游離酶催化性能的影響。由圖6(b)可知，游離酶在15℃時(shí)反應(yīng)最快，隨著溫度提高，反應(yīng)速率逐漸下降。ADH?PEI/PAA?PE 在15～30℃較寬的溫度范圍內(nèi)都有較高的酶活，反應(yīng)速率均保持在7.5 μmol/(L·min)左右。當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高到35℃和40℃時(shí)，反應(yīng)速率有輕微下降。對(duì)于ADH?PAA?PE，當(dāng)溫度從15℃升高到25℃時(shí)，反應(yīng)速率從4.87 μmol/(L·min)迅 速 增 加 到15.6 μmol/(L·min)，30℃和37℃時(shí)，反應(yīng)速率有輕微下降；40℃時(shí)，反應(yīng)速率明顯下降，僅為25℃時(shí)的48.6%。盡管固定化后酶活有較大程度的降低，但與游離酶相比，ADH?PAA?PE 的最適反應(yīng)溫度提高，并且在較寬的溫度范圍內(nèi)（20～37℃）均能保持較高的活性，高于部分文獻(xiàn)報(bào)道（25℃）[12,43]。這說明固定化在一定程度上提高了酶在更高溫度下的耐受性，特別是在室溫變化范圍內(nèi)，酶活對(duì)反應(yīng)溫度的依賴性降低。這是因?yàn)槊负洼d體之間形成的共價(jià)鍵會(huì)減少酶分子構(gòu)象的靈活性和熱運(yùn)動(dòng)，從而減少酶蛋白的變性失活[44]。

圖5 EDC/NHS摩爾比(a)、固定化時(shí)間(b)和pH(c)對(duì)固定化效率和ADH?PAA?PE催化性能的影響Fig.5 Effects of the molar ratio of EDC and NHS(a),immobilized time(b)and pH(c)on immobilization efficiency and the catalytic performance of ADH?PAA?PE

圖6 反應(yīng)pH(a)、溫度(b)對(duì)固定化和游離ADH催化性能的影響Fig.6 Effects of pH(a)and temperature(b)in the reaction on the catalytic performance of immobilized and free ADH

2.5 固定化酶的重復(fù)利用性

固定化酶的重復(fù)利用性對(duì)其工業(yè)化應(yīng)用至關(guān)重要。以ADH?PAA?PE 的初始酶活為100%，分別考察了兩種固定化ADH 的重復(fù)利用性。由圖7 可知，ADH?PEI/PAA?PE 經(jīng)過10 次循環(huán)后，酶活保持在47.3%左右，ADH?PAA?PE 在重復(fù)使用5 次和10次后，保留活性為75.6%和53.8%，高于大部分使用有機(jī)材料作為載體時(shí)的重復(fù)利用性[15,19,45]?；钚缘牟糠謸p失可能是由于經(jīng)過多次洗滌和重復(fù)利用后，酶分子構(gòu)象發(fā)生變化或者席夫堿分解導(dǎo)致酶從載體上脫落[46]。

3 結(jié) 論

（1）FTIR 和SEM 結(jié)果表明成功制備了PAA?PE和PEI/PAA?PE膜。

（2）PEI/PAA?PE 固定化ADH 的最優(yōu)條件為：pH 為6.0，溫度為5～15℃，酶濃度為1.0 mg/ml，GA濃度為0.01%（質(zhì)量）。

（3）PAA?PE 固定化ADH 的最優(yōu)條件為：EDC和NHS 摩爾比為1∶0.5，固定化時(shí)間為24 h，pH為6.5。

（4）兩種固定化ADH 的最適反應(yīng)pH 均為6.5，與游離酶相同；在同樣反應(yīng)條件下，ADH?PAA?PE的催化性能優(yōu)于ADH?PEI/PAA?PE，原因可能是EDC/NHS 法反應(yīng)條件更溫和。盡管固定化后酶活有較大程度的降低，但與游離酶相比，固定化ADH的最適反應(yīng)溫度提高，并且在較寬的溫度范圍內(nèi)均能保持較高的活性。

（5）重復(fù)利用10 次后，ADH?PAA?PE 和ADH?PEI/PAA?PE分別保留了53.8%和47.3%的活性。