非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的建立①

萬小雨 曾俊豪 張婉怡 韓钘雨 楊天心 王雅琴 周永芹 劉朝奇

(三峽大學(xué)腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素外所致的以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝炎(simple fatty liver，SFL)、非酒精性脂肪性肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及相關(guān)肝硬化[1,2]。NASH是NAFLD疾病譜中的最重要組成之一，是NAFLD進(jìn)展至肝硬化和肝細(xì)胞癌的重要環(huán)節(jié)[3,4]，因此建立動(dòng)物模型探討NASH發(fā)生發(fā)展機(jī)制及尋找有效干預(yù)藥物尤為重要。目前高脂飲食所致NASH的動(dòng)物模型多有報(bào)道，但造模周期平均為3～5個(gè)月，甚至長達(dá)1年，無法滿足藥物高通量和快速篩選的需求[5-7]。近年研究發(fā)現(xiàn)NAFLD發(fā)展機(jī)制的重要環(huán)節(jié)：腸肝軸，即腸道、肝臟和血液代謝之間的相互作用探討給予調(diào)控NAFLD的進(jìn)程[8，9]。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度葡聚糖硫酸鈉(dextransulfatesolin,DSS)對(duì)結(jié)腸造成不同程度的損傷，短期內(nèi)成功再現(xiàn)NASH的動(dòng)物病理模型。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性昆明小鼠80只，4～6周齡，體質(zhì)量(18±2)g，由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供，SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。于恒溫(20±2)℃及濕度(50±2)%條件下，人工照明明暗各12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后隨機(jī)分組。

1.1.2試劑 DSS購自上海翊圣生物科技有限公司，相對(duì)分子量為(36～50)×103；膽固醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物科技有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3動(dòng)物飼料 普通飼料由三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。高脂飼料配方為普通飼料53.5%、果糖20%、豬油20%、膽固醇5%、食鹽1%、膽酸鈉0.5%，混合固定成形，送至武漢農(nóng)科院輻照滅菌備用[10]。營養(yǎng)成分見表1。

表1 高脂飼料營養(yǎng)成分表Tab.1 Table of high-fat diet nutrition composition

1.2方法

1.2.1動(dòng)物飼養(yǎng)及分組 80只昆明小鼠隨機(jī)分為8組，每組10只，對(duì)照組給予普通飼料及正常飲水，2%DSS組、2.5%DSS組、3%DSS組給予普通飼料，HFD組、2%DSS+HFD組、2.5%DSS+HFD組、3%DSS+HFD組高脂飼料喂養(yǎng)。飼養(yǎng)1周后，飲水均換成相應(yīng)濃度DSS溶液，連續(xù)自由攝入5 d，共觀察2周[11-13]。

1.2.2肝臟、結(jié)腸組織病理檢測(cè)及腸道組織學(xué)評(píng)分 肝臟、結(jié)腸組織按常規(guī)方法進(jìn)行石蠟包埋、切片和HE 染色；取新鮮肝臟組織進(jìn)行冰凍切片， 按試劑盒說明進(jìn)行油紅O染色，光鏡下觀察。結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表2，由2名實(shí)驗(yàn)人員獨(dú)立閱片并評(píng)分，總評(píng)分為上皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞浸潤評(píng)分總和(總評(píng)分=E+I)。

表2 結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分Tab.2 Colonic histology score

1.2.3RT-PCR檢測(cè)小鼠肝臟組織中碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate response element，binding protein，chREBF)、IL-6的表達(dá) 稱取凍存肝臟組織50 mg，用Trizol法提取組織總RNA，微量核酸儀測(cè)定RNA濃度，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系按照試劑盒說明書操作，采用RT-PCR法檢測(cè)各組肝臟組織中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因chREBF以及炎癥相關(guān)基因IL-6的表達(dá)情況。RT-PCR所用引物列表見表3。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequences

2 結(jié)果

2.1小鼠一般體征觀察 各組小鼠體質(zhì)量變化見圖1 ，不同濃度DSS組與對(duì)照組相比，均呈下降趨勢(shì)，其中3%DSS組下降趨勢(shì)最顯著(P<0.05)；與相同濃度DSS組相比，聯(lián)合高脂組下降趨勢(shì)均較大，其中3%DSS+HFD組小鼠體質(zhì)量下降趨勢(shì)最顯著(P<0.001)。給予DSS的第3天，DSS組小鼠出現(xiàn)不同程度的腹瀉、肛門紅腫、便血，試驗(yàn)期間無小鼠死亡。

圖1 相同濃度DSS組小鼠體質(zhì)量變化率Fig.1 Body weight change rate of mice in same concentra-tion of DSS groups

2.2結(jié)腸炎癥反應(yīng)的大體觀察 分離整段結(jié)腸組織，肉眼可見對(duì)照組腸道無紅腫、形態(tài)正常，DSS各組可見腸道中含帶血的糞便，腸道呈鮮紅色；各組結(jié)腸組織長度差異見圖2，對(duì)照組結(jié)腸長度相對(duì)正常，3%DSS+HFD組結(jié)腸長度相對(duì)較短，相同濃度DSS組與對(duì)照組相比，2.5%DSS組結(jié)腸長度顯著縮短(P<0.001)；相同濃度DSS與對(duì)應(yīng)聯(lián)合高脂組相比，3%DSS+HFD組結(jié)腸長度顯著縮短(P<0.001)；腸長度顯著縮短(P<0.001，vs 2%DSS+HFD)，結(jié)果顯示3%DSS結(jié)合高脂飲食對(duì)結(jié)腸長度有顯著縮短作用。

圖2 結(jié)腸長度統(tǒng)計(jì)圖及圖片F(xiàn)ig.2 Colon length statistics and pictures

2.3結(jié)腸組織病理變化及病理評(píng)分 結(jié)果如圖3，HE染色顯示，正常組小鼠結(jié)腸上皮結(jié)構(gòu)、腺體完整，黏膜下組織無損傷，部分黏膜下層可見少量的炎癥細(xì)胞浸潤，HFD組與正常組相比，可見少量杯狀細(xì)胞丟失，炎性細(xì)胞圍繞隱窩浸潤，組織評(píng)分結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與正常組相比，3種DSS濃度組均可見炎癥細(xì)胞浸潤、結(jié)腸壁增厚，固有腺體排列紊亂、變形，杯狀細(xì)胞大量流失，病理評(píng)分顯著升高(P<0.001)；相同濃度DSS與對(duì)應(yīng)聯(lián)合高脂組比較，聯(lián)合高脂組炎癥更嚴(yán)重，其中2%DSS與2.5%DSS兩組病理評(píng)分均顯著升高(P<0.01)，提示DSS結(jié)合高脂飲食會(huì)進(jìn)一步加重結(jié)腸炎的進(jìn)展。

圖3 結(jié)腸HE染色結(jié)果及組織病理評(píng)分統(tǒng)計(jì)圖(×200)Fig.3 Colon HE staining results and histopathological score statistics (×200)

2.4肝臟組織病理學(xué)及脂質(zhì)沉積的觀察 HE染色結(jié)果見圖4，正常肝組織肝索以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，細(xì)胞形態(tài)清晰，高脂組中細(xì)胞腫脹，排列紊亂，可見脂質(zhì)空泡；與對(duì)照組比較，單純DSS組均未見病理改變，聯(lián)合高脂組中3%DSS+HFD組脂肪變相對(duì)明顯，脂肪變性細(xì)胞明顯增多，圖片中可見大量脂質(zhì)空泡，且炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量與DSS濃度呈正比；由圖5可見，油紅O染色3種濃度DSS組肝臟中均可見紅色脂滴形成，單純DSS組可見少許紅染脂滴，DSS聯(lián)合高脂組有密布大小不等脂滴及脂滴片狀融合，其中3%DSS濃度聯(lián)合組肝臟脂滴分布相對(duì)較多，結(jié)果提示2.5%和3%DSS濃度聯(lián)合高脂組均可建立明顯脂肪性肝炎模型。

圖4 肝臟HE染色結(jié)果(×200)Fig.4 Liver HE staining results (×200)

圖5 肝組織油紅O染色(×400)Fig.5 Liver tissue oil red O staining(×400)

2.5肝臟組織中chREBF、IL-6的表達(dá)水平 如圖6，與對(duì)照組相比，單純DSS組chREBP表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，IL-6表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)。相同濃度DSS下單純DSS組與聯(lián)合高脂組相比較，聯(lián)合高脂組中chREBP表達(dá)水平均升高，其中DSS濃度為3%時(shí)兩組相比表達(dá)水平差異最大，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)； DSS濃度為2.5%時(shí)，高脂聯(lián)合組IL-6表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，但3%DSS聯(lián)合高脂組較單純DSS組IL-6表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)期間本組小鼠的情況，表現(xiàn)為體質(zhì)量顯著下降(P<0.001 vs對(duì)照組)，活動(dòng)減少，精神萎靡，因此其炎癥反應(yīng)未出現(xiàn)疊加效應(yīng)。結(jié)果提示2.5%DSS+HFD組為建立非酒精性脂肪肝炎最優(yōu)模型。

圖6 RT-PCR檢測(cè)基因chREBP、IL-6的表達(dá)情況Fig.6 Expression of chREBP，IL-6 mRNA by RT-PCR

3 討論

近年來，對(duì)NAFLD/NASH 動(dòng)物模型的報(bào)道成為研究熱點(diǎn)，其對(duì)精確致病機(jī)制的進(jìn)一步研究和積極尋找 NASH 的潛在治療藥物至關(guān)重要。從發(fā)病機(jī)制、病程的發(fā)生發(fā)展及最終組織形態(tài)學(xué)改變與人類組織的差異，及動(dòng)物的死亡率、成本代價(jià)上來考慮，最常采用的動(dòng)物模型為飲食誘導(dǎo)型，此種方法造模要使癥狀明顯，至少需要2個(gè)月以上，時(shí)間成本較高[14-17]。本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)周期為2周，相比文獻(xiàn)中所報(bào)道的，大大縮短了造模時(shí)間，并且再現(xiàn)了NASH肝臟的病理變化，即肝細(xì)胞脂肪病變和炎癥反應(yīng)。

NASH的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，目前公認(rèn)的經(jīng)典學(xué)說為“二次打擊”學(xué)說[18]?！俺醮未驌簟笔侵钢驹诟闻K中堆積，其重要的“第二次打擊”為脂肪堆積的肝臟發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)、肝細(xì)胞變性壞死甚至肝纖維化、肝硬化[19]。文章中肝臟油紅O染色單純DSS組可見紅色脂滴沉積，提示單純DSS組小鼠肝臟中有脂肪堆積，原因在于用DSS處理小鼠后，由于小鼠有高水平的硬脂酰溶血軟磷脂和低水平的油酰溶血卵磷脂導(dǎo)致了肝臟中的硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD-1)表達(dá)受到抑制，而SCD-1是調(diào)節(jié)飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸比例的酶，其下調(diào)導(dǎo)致了脂肪堆積，但此過程還尚未導(dǎo)致肝臟脂肪變化[20,21]。肝臟通過門靜脈系統(tǒng)接收腸道約70%的血液供應(yīng)，通過門靜脈和膽管樹肝臟和腸道緊密相連[22]。在1998年Marshall等提出“腸肝軸”的概念：腸道黏膜屏障被破壞，腸道內(nèi)大量的細(xì)菌和內(nèi)毒素經(jīng)由門靜脈系統(tǒng)移位進(jìn)入肝臟，導(dǎo)致肝臟中庫普弗細(xì)胞活化釋放炎癥因子，進(jìn)一步造成腸黏膜受損，各種細(xì)胞、炎癥介質(zhì)相互作用、影響，構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)[8]。近年來有研究者使用1%DSS喂養(yǎng)小鼠引起腸黏膜損傷后，加重了刀豆蛋白A(ConA)急性肝損傷的肝臟炎癥，使用益生菌灌劑一定程度上修復(fù)了腸黏膜屏障，相對(duì)減輕了肝損傷的炎癥程度，因此認(rèn)為DSS+對(duì)照A 組小鼠肝損傷加重可歸咎于腸黏膜屏障破壞導(dǎo)致的腸道有害物質(zhì)入血增多，加重了肝臟炎癥[23]。G?bele等[24]用高脂飼料飲食聯(lián)合1%DSS飲水處理小鼠12周，結(jié)合慢性結(jié)腸炎建立NASH小鼠模型，促炎基因表達(dá)分析顯示DSS+HFD組小鼠MCP-1和TNF-α mRNA表達(dá)增加，LPS水平升高且TLR4和TLR9在炎癥狀態(tài)下均升高，HE結(jié)果顯示高脂飼料聯(lián)合DSS給藥組脂肪變性評(píng)分顯著升高(P<0.001 vs HFD組)，因此得出結(jié)論DSS給藥加重了高脂飲食小鼠模型的肝臟炎癥。本實(shí)驗(yàn)用高脂飼料聯(lián)合不同濃度DSS飲水處理小鼠，起始DSS濃度為2%，目的是在短時(shí)間內(nèi)造成小鼠急性潰瘍性結(jié)腸炎，對(duì)肝臟進(jìn)行二次打擊，從形態(tài)學(xué)分析2.5%DSS+HFD和3%DSS+HFD組均出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積，但3%DSS+HFD組小鼠疾病表現(xiàn)更嚴(yán)重，有導(dǎo)致小鼠死亡的風(fēng)險(xiǎn)，因此本研究推薦2.5%DSS+HFD組為最優(yōu)NASH模型。

理想的動(dòng)物模型在NASH發(fā)病機(jī)制及防治的研究中起至關(guān)重要的作用，因此應(yīng)該具有與人類病理特征相似、死亡率低、模型重復(fù)率好、造模時(shí)間短、造模成本低等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用高脂飼料飲食聯(lián)合DSS飲水誘導(dǎo)小鼠NASH動(dòng)物模型，并對(duì)其進(jìn)行了組織形態(tài)學(xué)分析和分子水平研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)通過高脂飼料飲食聯(lián)合DSS飲水處理小鼠在2周內(nèi)完全可以建立NASH模型，為 NASH 防治提供新的思路和藥物篩選的平臺(tái)。然而對(duì)于NASH進(jìn)一步發(fā)展為肝纖維化甚至肝癌的病理學(xué)特征，還有待于進(jìn)一步充實(shí)和完善。