腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在泌尿系腫瘤中的研究進(jìn)展①

何天基 葛 波

(桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，桂林 541199)

腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)是腫瘤細(xì)胞和間質(zhì)組織細(xì)胞之間雙向、動(dòng)態(tài)、錯(cuò)綜復(fù)雜的作用網(wǎng)絡(luò)。因此，充分研究TME中的每一種細(xì)胞類型，對(duì)明確腫瘤發(fā)生和進(jìn)展過程中的腫瘤生物學(xué)與分子機(jī)制具有重要意義。免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells，NK)和肥大細(xì)胞是與腫瘤細(xì)胞相互作用的重要細(xì)胞，是復(fù)雜微環(huán)境網(wǎng)絡(luò)的主要參與者[1]。間質(zhì)組織也是參與腫瘤發(fā)生的重要元素，由成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，其中成纖維細(xì)胞是其主要成分，成纖維細(xì)胞分泌的多種因子可導(dǎo)致更具侵襲性的癌癥表型[2]。Rosenberg等[3]于1986年從荷瘤小鼠組織中發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lympho-cytes,TILs)并命名。TILs是腫瘤組織中一類特殊淋巴細(xì)胞，主要包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，是TME的主要構(gòu)成部分，可通過不同細(xì)胞間的相互作用影響TME，從而直接或間接影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。此外，TILs建立復(fù)雜的細(xì)胞間相互作用網(wǎng)絡(luò),有助于維持免疫抑制性微環(huán)境，促進(jìn)免疫逃逸，引發(fā)腫瘤。TILs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后中具有重要意義，已成為近年研究熱點(diǎn)。研究表明原位活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞在機(jī)體富集時(shí)可改善預(yù)后，影響相關(guān)腫瘤進(jìn)程，在乳腺癌、黑色素瘤等實(shí)體腫瘤的研究中預(yù)后良好[4，5]。

1 TILs的概念及評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

1.1TILs概念 TILs是腫瘤組織中浸潤(rùn)的一類特殊淋巴細(xì)胞，存在兩組相互作用的細(xì)胞，一組以CD4+輔助性T細(xì)胞(Th1)、CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)、CD4+細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M1及樹突狀細(xì)胞(DC)Ⅰ型等通過特異性免疫應(yīng)答抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等過程；另一組主要通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、CD4+Th2細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M2、樹突狀細(xì)胞Ⅱ型及其他髓系來源的相關(guān)抑制細(xì)胞等免疫抵抗方式導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。有報(bào)道指出當(dāng)腫瘤細(xì)胞中的程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-ligand，PD-L1)與機(jī)體CTL中的程序性死亡受體1(programmed death 1，PD-1)結(jié)合后CTL可能失活或凋亡，可能有助于TILs中抗腫瘤效應(yīng)性T細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[6,7]。TILs的主要成分包括約75%的CD3+T淋巴細(xì)胞、約20%的B淋巴細(xì)胞、不到10%的單核細(xì)胞和NK細(xì)胞；對(duì)腫瘤增殖轉(zhuǎn)移起抑制作用的細(xì)胞仍以T淋巴細(xì)胞為主，是機(jī)體持續(xù)抗腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵因素[8]。

1.2TILs判定標(biāo)準(zhǔn) TILs分為腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞和間質(zhì)浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞，其主要研究方法為：①通過對(duì)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色的病理玻片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，采取定量或半定量標(biāo)準(zhǔn)判斷腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的相關(guān)淋巴細(xì)胞，但其判斷標(biāo)準(zhǔn)受病理科醫(yī)師主觀因素影響較大[9]。②免疫組織化學(xué)(immunohisto-chemistry，IHC) 法標(biāo)記各種免疫細(xì)胞，如CTL、CD4+Th、FOXP3+、Treg、NK、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，但由于細(xì)胞種類繁多，所需標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量較大，細(xì)胞間抗體染色對(duì)觀察效果有影響；IHC切片還可運(yùn)用數(shù)字化方式精確定量分析腫瘤組織中免疫細(xì)胞，此方法已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)[10]。③通過多重免疫熒光可識(shí)別各種免疫細(xì)胞亞型，并可對(duì)亞型免疫細(xì)胞成分和分布進(jìn)行定量分析，但因其費(fèi)效較低，數(shù)據(jù)分析及存取技術(shù)要求較高，尚不能在臨床上大規(guī)模應(yīng)用[11]。④流式細(xì)胞術(shù):通過單克隆抗體可對(duì)單個(gè)細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行多參數(shù)、快速的定量分析，能夠在短時(shí)間內(nèi)分析上萬個(gè)細(xì)胞，同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，具有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，但因其只能分析新鮮組織，且不能分析免疫細(xì)胞的分布情況，故其在TILs的研究中受限[12]。其他方法還有mRNA表達(dá)譜檢測(cè)、CIBERSORT軟件(https://cibersort.stanford.edu/)分析TILs、Opal/TSA多標(biāo)記免疫熒光技術(shù)等，研究方法種類多，尚缺乏統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)[13-15]。2014年國(guó)際腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞協(xié)作組(International Working Group，IWG)擬訂了以腫瘤內(nèi)TILs百分比率評(píng)判TILs表達(dá)的評(píng)估辦法，具體標(biāo)準(zhǔn)見文獻(xiàn)[16]。隨著技術(shù)的進(jìn)步及對(duì)TILs認(rèn)識(shí)的加深，研究人員嘗試將相關(guān)機(jī)器及軟件用于TILs判定。Saltz等[17]用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算法對(duì)圖像分類染色，得到卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) (CNN) 識(shí)別 TILs 的分布情況，從而得到TCGA中13種腫瘤類型的HE圖像的TIL映射，如圖1；該團(tuán)隊(duì)還使用開源軟件編寫了名為TIL-Map的基于WEB的軟件，用于圖像預(yù)測(cè)結(jié)果的修改。

圖1 卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算識(shí)別 TILs 的分布[17]Fig.1 Convolutional neural network calculation to identify distribution of TILs[17]

2 TILs的作用機(jī)制

T淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中起重要作用，以CTL為主，其Ⅰ類MHC對(duì)腫瘤抗原有限制性和特異性結(jié)合激活時(shí)產(chǎn)生穿孔素及其他細(xì)胞毒素使腫瘤細(xì)胞死亡而不損傷正常細(xì)胞，具體的作用機(jī)制為：①直接接觸殺傷：TILs的T淋巴細(xì)胞受TCR和CD28雙刺激信號(hào)后激活為效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，從而接觸靶細(xì)胞，殺滅腫瘤細(xì)胞或通過自身分泌的干擾素等相關(guān)因子消滅靶細(xì)胞；② 活化的CTL高表達(dá)FasL，與靶細(xì)胞表面Fas抗原結(jié)合誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡；③穿孔素(performing protein，PFP)/ 顆粒酶 B(GranB)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡：在鈣離子作用下，腫瘤細(xì)胞表面會(huì)存在多聚PFP相關(guān)的“孔道”，通過不同的滲透壓或端粒酶間協(xié)同作用促進(jìn)靶細(xì)胞融解或凋亡；④TILs分泌淋巴毒素直接殺傷靶細(xì)胞：如在TNF-α、IFN-γ、IL-2等介導(dǎo)下靶細(xì)胞出現(xiàn)的融解與凋亡[18]；CD4+Th細(xì)胞的一個(gè)亞群對(duì)于CTL增殖和功能發(fā)揮至關(guān)重要。NK細(xì)胞不具M(jìn)HC限制性，且無需抗原事先致敏，即可釋放PFP、顆粒酶和細(xì)胞因子消除腫瘤細(xì)胞。這些淋巴細(xì)胞是細(xì)胞抗腫瘤免疫的中介細(xì)胞。B細(xì)胞在被抗原特異性激活后可形成產(chǎn)生抗體(Ab)的漿細(xì)胞，從而介導(dǎo)體液抗腫瘤免疫。腫瘤治療中，是T細(xì)胞還是B細(xì)胞起主要作用尚存爭(zhēng)論。在抗體治療腫瘤期間，NK細(xì)胞的抗腫瘤免疫活性很大程度上被認(rèn)為是在具有抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的情況下發(fā)揮作用的。因此，細(xì)胞的協(xié)同作用對(duì)抗腫瘤反應(yīng)的發(fā)生至關(guān)重要。在回顧性研究中，腫瘤組織中高表達(dá)CD4+Th1的細(xì)胞均具有較好預(yù)后，其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等風(fēng)險(xiǎn)均低于低表達(dá)者，提示T細(xì)胞在腫瘤免疫應(yīng)答中不可或缺。巨噬細(xì)胞作為初始抗炎的主要細(xì)胞，在清除受損組織和細(xì)胞壞死碎片及相關(guān)病原體等方面起重要作用，但其抗腫瘤機(jī)制仍需深入研究，其他類型的浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞也有待進(jìn)一步研究。

3 TILs在泌尿系腫瘤中的研究

3.1TILs在腎癌中的研究 免疫療法較早應(yīng)用于晚期或轉(zhuǎn)移性腎癌術(shù)后輔助治療，以IFN、IL-2輔助治療最為常見，但文獻(xiàn)報(bào)道其有效率不足15%[19]。伊匹單抗是抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)的阻斷抗體，2018年歐盟及FDA首次批準(zhǔn)其聯(lián)合用于中、高危晚期腎細(xì)胞癌(RCC)患者的一線治療，主要基于CheckMate-214 Ⅲ期臨床研究的結(jié)果[20]。納武利尤單抗與伊匹木單抗聯(lián)合治療相較于舒尼替尼單獨(dú)治療可明顯延長(zhǎng)總生存時(shí)間(overall survival，OS)，死亡風(fēng)險(xiǎn)降低37%(HR=0.63，P<0.000 1)，截至目前，其客觀緩解率為(41.6% vs 26.5%，P<0.000 1)，治療組具有更高完全緩解率(9.4% vs 1.2%，P<0.000 1)，此外治療組所發(fā)生的3或4級(jí)不良事件更少(65% vs 76%，P<0.001)，該方案極大促進(jìn)了免疫療法的進(jìn)展[20]。Iida等[21]評(píng)估了87例腎癌根治術(shù)后標(biāo)本的TILs概況，結(jié)果顯示CD276+和Foxp3+TILs的高計(jì)數(shù)為根治性腎切除術(shù)后轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)預(yù)后不良的獨(dú)立因素(P=0.033，P=0.006)，且高CD276+TILs計(jì)數(shù)與術(shù)前血清TNF-α和IFN-γ水平相關(guān)(P=0.027，P=0.035)。Zhu等[22]對(duì)135例腎透明細(xì)胞癌患者進(jìn)行了生存率分析，TC-PD-L1陽性患者被分為有或無CD8+T細(xì)胞時(shí)，存在更明顯的預(yù)后差異(P<0.05)。Ghatalia等[23]研究表明術(shù)后復(fù)發(fā)的RCC與低T細(xì)胞浸潤(rùn)、低適應(yīng)性免疫反應(yīng)和高中性粒細(xì)胞基因表達(dá)有關(guān)。Lin等[24]通過酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)舒尼替尼治療 108例轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(mRCC)，IHC法觀察腫瘤浸潤(rùn)性B淋巴細(xì)胞(TIBs)，并評(píng)估其臨床病理學(xué)特征，結(jié)果顯示TIBs陽性浸潤(rùn)患者對(duì)舒尼替尼治療反應(yīng)更好(P=0.006)，OS更長(zhǎng)(P<0.001)，無進(jìn)展生存期(P=0.028)，且TIB與CD8+TIL正相關(guān)(P<0.001)，2種細(xì)胞高浸潤(rùn)患者顯示出更好的OS(P=0.015)，因此TIB密度不僅是mRCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素，也是TKI治療的預(yù)測(cè)標(biāo)志，其可在mRCC募集和激活CD8+TILs以增強(qiáng)抗腫瘤能力。

3.2TILs在膀胱癌中的研究 卡介苗(BCG)作為免疫療法早已應(yīng)用于高危組非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌(NMIBC)，療效確切，復(fù)發(fā)率低，但存在結(jié)核擴(kuò)散、價(jià)格高昂等缺點(diǎn)，其作用機(jī)制可能與TILs相關(guān)。Kates等[25]使用6個(gè)療程的BCG治療實(shí)驗(yàn)大鼠，結(jié)果顯示CD4+細(xì)胞比例提高49%(P=0.003)，CD8+細(xì)胞比例下降28%(P=0.019)；與未治療組相比，BCG引起CD4+淋巴細(xì)胞總比例提高74%(P<0.001)，提示BCG誘導(dǎo)膀胱T細(xì)胞募集，表明T細(xì)胞活化劑與BCG結(jié)合可能改善臨床預(yù)后。Huang等[26]對(duì)259例接受鉑類化療的轉(zhuǎn)移性尿路上皮癌(mUC)患者進(jìn)行免疫組化研究，其中179例(69%)高表達(dá)TILs，80例(31%)低表達(dá)TILs，2組中位OS分別為15.7和6.7個(gè)月(P<0.001)，表明高表達(dá)TILs患者具有較好預(yù)后；Chen等[27]基于PD-L1和CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)的mUC腫瘤微環(huán)境的多組學(xué)觀察分析腫瘤微環(huán)境與免疫基因相關(guān)性，為膀胱癌分類及治療提供新思路。Rouanne等[28]回顧性分析了147例行TURBt術(shù)的pT1G3 NMIBC患者，其中82例患者基質(zhì)TILs較高，與腫瘤浸潤(rùn)深度及變異組織學(xué)癌癥呈正相關(guān)(P=0.01)。對(duì)于癌癥特異生存率分析，高(≥10%)與低(<10%)基質(zhì)TILs風(fēng)險(xiǎn)比為1.70(95%CI為0.7～3.9，P=0.2)，表明TILs在NMIBC中可能與浸潤(rùn)深度有關(guān)，但其與預(yù)后關(guān)系尚不明確。Liu等[29]共納入了102例病理診斷為膀胱癌的患者，通過免疫組織化學(xué)標(biāo)記中性粒細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞TILs與存活率呈正相關(guān)(P<0.01)。齊奧等[30]通過建立小鼠皮下瘤模型研究氧化鐵納米顆粒通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性氧進(jìn)而抑制膀胱癌細(xì)胞的種植與生長(zhǎng),有望成為新型膀胱灌注藥物。近年來過繼性免疫治療(adoptive cell transfer therapy，ACT)成為腫瘤微環(huán)境的研究熱點(diǎn)，Poch等[31]通過收集原發(fā)性膀胱腫瘤或者存在淋巴結(jié)(LN)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織，并以高劑量IL-2繁殖4周后行流式細(xì)胞術(shù)對(duì)擴(kuò)展的TIL進(jìn)行表型分析，結(jié)果顯示70%原發(fā)性腫瘤和所有LN轉(zhuǎn)移瘤顯示出TIL擴(kuò)增，其中擴(kuò)增的TIL主要為CD3+和CD8+T細(xì)胞，具有潛在的臨床治療前景，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3.3TILs在前列腺癌中的研究 Hardenberg等[32]應(yīng)用IHC分析了39例前列腺癌患者神經(jīng)內(nèi)分泌分化的石蠟包埋組織，其中37.5%標(biāo)本中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞≥10%，與生存分析結(jié)合均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺(mCRPC)對(duì)抗免疫檢查點(diǎn)阻斷具有對(duì)抗性，Mo等[33]通過IHC法分析了73種原發(fā)性前列腺癌和7種去勢(shì)抵抗性前列腺癌(CRPC)中PD-L1的表達(dá)，結(jié)果顯示PD-L1僅在1種原發(fā)性前列腺癌患者的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，而在CRPC中均未表達(dá)，PD-L1+腫瘤相關(guān)神經(jīng)的密度與CD8+TAL密度呈負(fù)相關(guān)，神經(jīng)免疫相互作用可能對(duì)免疫抑制微環(huán)境起促進(jìn)作用。Anker等[34]研究顯示患者來源的前列腺特異性細(xì)菌CP1與抗PD-1免疫療法相結(jié)合，CP1可通過激活的CD8+T細(xì)胞、Th17細(xì)胞、成熟樹突狀細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞導(dǎo)致免疫原性細(xì)胞死亡，并使其他耐藥癌癥對(duì)免疫治療敏感。檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)包含稀有腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的免疫“冷”腫瘤(如前列腺癌)效果欠佳，因此未來如何激活前列腺癌組織中相關(guān)免疫細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用仍有待進(jìn)一步探索。

4 結(jié)語

隨著對(duì)TILs研究的不斷深入，其作為潛在治療靶點(diǎn)研究仍存在較多困難，如TILs結(jié)果評(píng)判、TILs的內(nèi)分類及分離腫瘤內(nèi)相關(guān)淋巴細(xì)胞判斷等尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。目前TILs在泌尿系腫瘤研究中多集中于TME、生存預(yù)后及免疫治療等方面，且大多數(shù)為回顧性分析，仍需要在大規(guī)模、多中心、隨機(jī)對(duì)照、前瞻性等實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究，從而發(fā)揮TILs在抗腫瘤免疫治療中的巨大潛能，擴(kuò)大免疫治療在泌尿系腫瘤中的應(yīng)用。