RP-HPLC 法同時測定防暑清熱飲中5 種活性成分的含量

李 杰，楊育儒，王慶芬，陳錦珊 （中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇九醫(yī)院 / 廈門大學附屬東南醫(yī)院藥劑科，福建 漳州，363000）

防暑清熱飲是由廣藿香、白茅根、菊花、薄荷、枸杞等藥材配伍而成的中藥復方制劑。方中廣藿香為君藥，白茅根、菊花為臣藥，薄荷為佐藥，枸杞為使藥，諸藥合用，具有芳香化濕、清熱解毒、解渴生津之功效[1]。課題組前期已采用紫外分光光度法對防暑清熱飲中總多糖和總黃酮進行質(zhì)量控制[2]。為了更為全面地控制防暑清熱飲的質(zhì)量，本實驗參考現(xiàn)有文獻[3-16]，采取RP-HPLC 法同時測定方中多個活性成分含量，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀（AngiLent 1200 型，DAD 檢測器，美國安捷倫科技有限公司），分析天平（AUX220，日本島津公司）。防暑清熱飲（批號：20200120，202002101，202002102，規(guī) 格：100 ml/瓶，第九〇九醫(yī)院藥劑科），綠原酸對照品（批號：110753-200413）、3，5-O-二咖啡?？鼘幩幔ㄅ枺?11782-201807）、蒙花苷（批號：111528-201710）和廣藿香酮（批號：111822-201904）均購自中國食品藥品檢定研究院，木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷（批號：GZDD-0115，貴州迪大生物科技有限責任公司），甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為純化水。

2 含量測定

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性

色譜柱ZORBAX-SB-C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為0.2%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫0～30 min，88%～82%A；30～45 min，82%～78%A；45～65 min，78%～35%A；65～75 min，35%A；75～78 min，35%～30%A；78～80 min，30%～88%A；80～82 min，88%A；流速為1.0 ml/min，檢測波長為327 nm，柱溫為30 ℃，進樣量20 μl，理論塔板數(shù)按3，5-O-二咖啡?？鼘幩嵊嬎銘坏陀? 000。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

分別精密稱定綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡?？鼘幩釋φ掌愤m量，置于同一10 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋成每1 ml 中含綠原酸2.15 mg、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷1.05 mg、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?.00 mg。分別精密稱定蒙花苷和廣藿香酮對照品適量置于同一25 ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定量稀釋成每1 ml中含蒙花苷0.21 mg 和廣藿香酮0.05 mg，作為對照品儲備液。精密量取各對照品儲備液5 ml，置同一25 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得混合對照品母液。

2.2.2 供試品溶液

精密量取防暑清熱飲5 ml，置10 ml 容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液

按處方量制備不含廣藿香、白茅根、菊花和薄荷的陰性樣品，按“2.2.2”項下供試品方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性考察

分別取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件下進樣，記錄色譜圖。結(jié)果陰性溶液無干擾，方法專屬性良好，見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取對照品母液按比例稀釋，在上述色譜條件下，分別進樣20 μl，以質(zhì)量濃度X（μg/ml）為橫坐標、峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，得線性回歸方程，見表1。

2.5 精密度試驗

取混合對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，記錄色譜峰面積，綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡?？鼘幩?、蒙花苷、廣藿香酮峰面積的RSD 分別為0.29%、0.30%、0.32%、0.45%、0.45%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液6 份（批號：20200120），并按“2.1”項下色譜條件進行含量測定。結(jié)果顯示，防暑清熱飲中綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷、廣藿香酮峰面積的RSD 分別為0.56%、0.68%、0.70%、0.94%、1.75%，表明方法重復性良好。

表1 回歸方程及線性范圍

2.7 穩(wěn)定性試驗

將供試品溶液在室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24 h 進樣20 μl，記錄色譜峰面積，結(jié)果顯示，防暑清熱飲中綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡酰奎寧酸、蒙花苷、廣藿香酮峰面積的RSD 分別為0.64%、1.16%、0.71%、0.59%、1.36%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已知含量的防暑清熱飲2.5 ml，共6 份，置10 ml 容量瓶中，再分別精密加入對照品適量，加水稀釋至刻度，按“2.1”項下色譜條件操作，進樣20 μl，記錄峰面積，測定其含量，計算平均加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.9 樣品測定

取3 個批號的防暑清熱飲樣品（批號：20200120，202002101，202002102），各3 份，按“2.2.2”項下方法制備防暑清熱飲供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件操作，進樣20 μl，記錄峰面積，計算含量，結(jié)果見表3。

3 討論

現(xiàn)代藥理學研究表明廣藿香酮具有抗菌、抗炎、抗氧化、殺蟲以及抑制腫瘤細胞的生長等多種生物活性；綠原酸、3，5-O-二咖啡?？鼘幩釋儆诒奖仡惢衔?，具有解熱鎮(zhèn)痛、抗氧化作用；木犀草素-7-O-D-葡糖苷和蒙花苷屬于黃酮類化合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抑菌抗病毒等作用。對單味藥材進行分析，廣藿香中含有廣藿香酮；菊花、廣藿香、白茅根和薄荷均含有綠原酸；菊花中含有3，5-O-二咖啡?？鼘幩?；菊花和薄荷中含有蒙花苷。中藥復方制劑成分復雜，在保證達到檢測要求的條件下，綜合考慮選擇綠原酸、木犀草素-7-Oβ-D-葡糖苷、3，5-O-二咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ?、廣藿香酮作為液相色譜法檢測的指標性成分[17-21]。

表2 防暑清熱飲加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

表3 3 批防暑清熱飲含量測定結(jié)果（n=3, μg/ml）

本實驗分別考察了甲醇-0.1%磷酸、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸4 個洗脫溶劑系統(tǒng)作為流動相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.2%磷酸作為流動相色譜峰時，峰形和分離效果較好，梯度洗脫比等度洗脫分離更好。由于本品為水溶性溶液，被測活性成分極性相對較大，故使流動相起始和結(jié)束比例保持一致，即乙腈-0.2%磷酸（12∶88），以確保所測成分在正確的保留時間出峰。

在190～400 nm 范圍內(nèi)進行全波長掃描，廣藿香酮、3，5-O-二咖啡?？鼘幩帷⒚苫ㄜ?、綠原酸和木犀草素-7-O-β-D-葡糖苷最大吸收波長分別為308、327、330、325 和348 nm，綜合考慮選擇327 nm作為檢測波長。

本實驗供試品溶液制備簡便，由于本品為液體制劑，用水稀釋后直接進樣，在該色譜條件下無干擾，故考慮稀釋后直接進樣。

本實驗建立的含量測定方法簡便、準確、靈敏，可作為防暑清熱飲的質(zhì)控方法，因不同批次有效成分含量相差較大，考慮可能是藥材受產(chǎn)地或采收季節(jié)的影響，也可能是該制劑提取工藝穩(wěn)定性的問題，還需進一步考察，后續(xù)需要經(jīng)過多批次測定以確定質(zhì)控標準。