基于體外溶出度與體內(nèi)生物利用度的西羅莫司增溶技術(shù)研究

張雪婷，云 超，陳珍珍，陶 春，宋洪濤 （. 福建醫(yī)科大學(xué)?？偱R床醫(yī)學(xué)院 / 第九〇〇醫(yī)院藥學(xué)科，福建福州，350025；2. 福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州，35008）

西羅莫司（sirolimus，SRL），又稱雷帕霉素，是第三代免疫抑制劑，在臨床上常用于抑制肝、腎等器官移植后的免疫排斥反應(yīng)。SRL 屬于生物藥劑學(xué)分類Ⅱ類藥物，在水中的溶解度極低，而滲透性良好[1-4]。SRL 藥理活性高，但因水溶性差，且易被腸壁和肝中的CYP3A4 同工酶廣泛代謝，致使其口服生物利用度較低。這是臨床應(yīng)用SRL 的重要缺陷之一。目前，已上市的SRL 制劑主要是納米結(jié)晶片，生物利用度約為17%[5-7]。

通過適當(dāng)?shù)闹苿┘夹g(shù)提高SRL 在胃腸道中的溶解度，可提高其口服生物利用度。在前期研究中，課題組分別獨立進(jìn)行了含SRL 的自微乳（selfmicroemulsifying drug delivery system，SMEDDS）、固體分散體（solid dispersion，SD）和納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體（nanostructured lipid carriers，NLC）的構(gòu)建，均顯著改善了SRL 的體外溶出。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上，新增環(huán)糊精衍生物對SRL 的增溶研究，結(jié)合體外溶出度和體內(nèi)生物利用度，綜合分析和評價各增溶制劑的優(yōu)勢和缺陷，從而為解決口服難溶性藥物的研究提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Starter 2C 型pH 計(上海奧豪斯儀器公司)；RCZ-6BZ 型藥物溶出儀(上海黃海藥檢儀器公司)；真空冷凍干燥箱(北京博醫(yī)康試驗儀器公司)；NS1001L2K 高壓勻質(zhì)機(意大利NiroSoavi 公司)；UV-2800AH 型紫外可見分光光度儀(上海優(yōu)尼科儀器有限公司)；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國ABSCIEX 有限公司)。

1.2 試劑

SRL 對照品(含量99.9%)、SRL 原料藥(含量99.6%)，購自福建科瑞藥業(yè)有限公司；子囊霉素對照品(上海齊奧化工科技有限公司)，Rapamune?(美國惠氏制藥)。聚乙二醇6000(PEG 6000）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP K30）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer 188)、聚氧乙烯35 蓖麻油(Cremophor EL）、聚氧乙烯氫化蓖麻油(Cremophor RH40）均購自德國BASF 公司； 油酸聚乙二醇甘油酯(Labrafil M1944CS)、二乙二醇單乙基醚(Transcutol P)、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(Labrasol)、棕櫚酸硬脂酸甘油酯(Precirol ATO5)、月桂酸聚乙二醇甘油酯(Gelucire 44/14)均購自法國GATTEFOSSE 公司；HP-β-CD、DM-β-CD、SBE-β-CD(山東濱州智源生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 SRL 含量測定方法

采用高效液相色譜儀（HPLC）測定樣品中的SRL 含量[8]。色譜柱為Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-甲醇-水（45∶34∶21），流速為1 ml/min，檢測波長為278 nm，柱溫為50 ℃，進(jìn)樣量為20 μl。配制濃度為2、4、8、12、16、20 μg/ml 的SRL 對照品溶液，得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=54.712X+1.221，r=0.999 9，表明在2～20 μg/ml 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。另外，精密度、回收率符合要求。

2.2 SRL 增溶方法

2.2.1 SRL-SMEDDS 的制備

參考前期研究[9]，稱取1 g SRL 原料藥，加入19 g 的助乳化劑Transcutol HP，超聲至全部溶解后，加入22 g 油相Labrafil M1944CS 及39 g 乳化劑Cremophor EL，渦旋混勻，得到淡黃色澄清溶液，即SRL-SMEDDS。

2.2.2 SRL-NLC 的制備

參考前期研究[10-11]，取Gelucire44/14 和Crodamol GTCC 在75 ℃水浴中完全熔融后，加入SRL 原料藥攪拌均勻成澄明油相，再將同溫度吐溫-80 的水溶液迅速倒入油相，以300 r/min 攪拌30 min 制備初乳，再經(jīng)高壓勻質(zhì)機90 MPa 乳勻5 次，即得SRL-NLC 分散液，其中SRL 為0.21%，Gelucire44/14:Crodamol GTCC（1∶2.1），脂質(zhì)總量為10%，吐溫-80 為7.33%。隨后，將SRL-NLC（42.6%）加入微晶纖維素和聚乙烯吡咯烷酮（50%，4∶1）中，研磨混合并放置過夜以充分吸附，加入甘露醇（凍干保護(hù)劑，3%），經(jīng)冷凍干燥過夜后，所得固體粉末中加入低取代羥丙基纖維素（崩解劑，4%）和二氧化硅（助流劑，0.4%）即得固化納米脂質(zhì)體。

2.2.3 SRL-SD 的制備

采用溶劑-熔融法制備SRL-SD。稱取載體材料，于80 ℃水浴加熱熔融，滴入SRL 乙醇溶液，充分混勻，待乙醇揮發(fā)完全后，迅速將其傾倒于冰浴條件下的不銹鋼板上成薄膜，固化，再于-18 ℃放置4 h后，將固體分散體從不銹鋼板上刮下，置真空干燥器中干燥，待脆化后研細(xì)，過80 目篩，即得SRL-SD。以載體種類、藥物-載體比例為考察因素，以0.4%SDS 中的溶出度為指標(biāo)，對SRL-SD 進(jìn)行單因素分析。

2.2.4 SRL-IC 的制備

稱取適量β-環(huán)糊精衍生物溶于去離子水中，緩慢滴加SRL 乙醇溶液，在一定溫度下磁力攪拌至澄清透明，減壓揮發(fā)4 h，使乙醇揮發(fā)完全，再置于4 ℃冰箱冷藏12 h，降低SRL 的溶解度，從而使游離的SRL 發(fā)生結(jié)晶。經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾除去結(jié)晶，濾液冷凍干燥24 h，所得固體研磨細(xì)化，過80 目篩，即得SRL-IC。

稱取一定量的SRL-IC 置10 ml 容量瓶中，加入50%甲醇水溶液，超聲至全部溶解后，定容至刻度，并采用HPLC 測定SRL 含量，根據(jù)公式：包封率（%）=[（SRL 投入量-SRL 測定量）/ SRL 投入量]×100%，進(jìn)行計算。以環(huán)糊精衍生物的種類、濃度、溫度、乙醇體積和投藥量為考察因素，以包封率為指標(biāo)，對SRL-IC 進(jìn)行單因素分析。

2.3 體外溶出試驗

參考《中國藥典》2015 年版四部通則0931 項下溶出度與釋放度測定法，考察SRL 原料藥、市售片（Rapamune?）、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、SRLIC 及SRL-SD 的溶出曲線。除市售片外，其余樣品均裝入硬膠囊中，每個膠囊含1 mg SRL。采用槳法，攪拌速度為100 r/min，溶出介質(zhì)體積為250 ml，分別以0.4% SDS、水、pH 1.2 鹽酸溶液、pH 4.5 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液、pH 7.4 磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)。將兩顆膠囊或藥片置于沉降籃中，投入溶出介質(zhì)，在10、30、45、60、90、120 min，吸取2 ml 介質(zhì)，并補充等溫等體積的介質(zhì)，采用HPLC 測定樣品中的藥物含量，繪制溶出曲線。

2.4 體內(nèi)藥代動力學(xué)試驗

選用比格犬為實驗動物，采用6 周期6 交叉實驗設(shè)計，進(jìn)行SRL 原料藥、市售片（Rapamune?）、SRL-SMEDDS、SRL-NLC、SRL-IC 及SRL-SD 的藥代動力學(xué)試驗。給藥劑量為1 mg SRL，實驗動物試驗開始前12 h 禁食不禁水，給藥4 h 后自由飲水，2 次給藥間隔2 周以上的清洗期。于給藥前，0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、24、36、48 及72 h 分別經(jīng)前肢小靜脈采血2 ml，置于含肝素和EDTA 的抗凝管中，-20 ℃保存?zhèn)溆?。血樣處理與測定方法參照課題組前期研究[12]。

3 結(jié)果

3.1 SRL-SD 的制備

3.1.1 載體種類

如圖1A 所示，不同載體材料制備的SRLSD 的溶出曲線顯示了明顯的差異，溶出速率為PEG6000＞F68＞PVP K30＞HPMC606＞HPMC-ASMF。同時，各載體材料的溶出度均不理想（≤50%），因此進(jìn)一步考察采用二元載體制備SRLSD。

選擇PEG6000 聯(lián)合F68 制備二元載體固體分散體[13]，兩者比例為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3。隨PEG6000/F68 比例的增大，則SRL 溶出度呈增大趨勢，在PEG6000/F68 為2∶1 時的溶出度達(dá)到最大（圖1B）。

3.1.2 藥物-載體比例

在PEG6000/F68=2∶1 的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察藥物-載體比例對SRL-SD 溶出的影響。藥物-PEG6000/F68 載 體 比 例 為1∶2∶1、1∶4∶2 及1∶6∶3 所制的SRL-SD 的溶出曲線相似，沒有明顯差別，2 h 的溶出度都接近100%（圖1C）。因此優(yōu)選載藥量最大，即藥物- PEG6000/F68 載體比例為1∶2∶1。

3.2 SRL-IC 的制備

3.2.1 β-環(huán)糊精衍生物種類

在其他條件相同的情況下，HP-β-CD、SBE-β-CD 和DM-β-CD 對SRL 的包封率分別為（11.21±3.35）%、（8.24±3.11）%和（31.86±3.26）%，見圖2A。因此，優(yōu)選DM-β-CD 制備SRL-IC。

3.2.2 溫度

采用DM-β-CD 制備SRL-IC，考察不同溫度對包封率的影響。結(jié)果顯示（圖2B），溫度越低，包封率越高，10 ℃條件下制備的SRL-IC 的包封率顯著高于30 ℃和50 ℃（P＜0.01），為（58.61±4.16）%。因此，優(yōu)選10 ℃制備SRL-IC。

3.2.3 環(huán)糊精衍生物濃度

DM-β-CD 的濃度由200 mg/ml 增大至300 mg/ml，SRL 的包封率由（52.12±4.17）%增大至（58.61±4.11）%（P＜0.05，圖2C）。進(jìn)一步增大DM-β-CD 的濃度至600 mg/ml，包封率沒有明顯變化（P＞0.05）。因此，優(yōu)選DM-β-CD 的濃度為300 mg/ml 制備SRL-IC。

3.2.4 乙醇體積

乙醇體積由0.5 ml 增大至2 ml，包封率呈增大趨勢（圖2D）。因此，優(yōu)選乙醇體積為0.5 ml 制備SRL-IC。

3.2.5 投藥量

SRL 的投藥量6 mg 增大至8 mg，包封率顯著降低，6 mg SRL 的包封率為（95.21±1.10）%，見圖2E。因此，優(yōu)選SRL 的投藥量為6 mg。

3.3 體外溶出度

考察SRL-SD、SRL-IC、SRL-SMEDDS 及SRLNLC 在不同介質(zhì)中的溶出曲線。如圖3 所示，在0.4% SDS 中，各制劑在2 h 的溶出度均超過80%，尤其是SMEDDS 和NLC 的溶出度接近100%。

在pH 6.8 和水中，SRL-SD 的溶出速率減小，2 h的溶出度分別為（65.00±4.90）%和（76.70±1.95）%。在pH 4.5 和pH 7.4 的介質(zhì)中，SRL-SD 的溶出在1 h達(dá)到最大值，分別為（53.20±4.34）%和（55.20±4.34）%，隨后溶出度逐漸降低。在pH 1.2 的介質(zhì)中，未檢測到SRL。

在水、pH 4.5、pH 6.8 和pH 7.4 中，SRL-IC 在40 min 內(nèi)的溶出速率有所減小，但2 h 的累積溶出沒有明顯變化，均在80%以上。在pH 1.2 的介質(zhì)中，SRL-IC 的溶出度在30 min 達(dá)到最大值，為（49.84±7.21）%，隨后溶出度逐漸降低。

SRL-SMEDDS 和SRL-NLC 顯示了與SRL-SD相似的溶出趨勢，即在水和pH 6.8 中的溶出度低于0.4% SDS，但大于80%。在pH 4.5 和pH 7.4 的介質(zhì)中，溶出達(dá)到峰值（約80%）后逐漸降低。

3.4 比格犬體內(nèi)藥動學(xué)試驗

SRL 血藥濃度-時間曲線見圖4，經(jīng)DAS 3.2.6 軟件處理后，具體參數(shù)見表 1。

以原料藥為參比制劑，SRL-SD、SRL-IC、SRLSMEDDS、SRL-NLC、Rapamune?的相對生物利用度分別為332.8%、522.9%、1 228.6%、1 537.1%、1 574.3%，表明各增溶方法都顯著提高了SRL 的生物利用度。

以市售納米晶片Rapamune?為參比制劑，SRLSD、SRL-IC、SRL-NLC、SRL-SMEDDS 的相對生物利用度分別為18.7%、33.2%、78.0%、97.6%，可見在各增溶方法中，SMEDDS 對SRL 體內(nèi)吸收的作用最顯著，與市售制劑相當(dāng)。

4 討論

表1 非房室模型體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)（ ±s）

表1 非房室模型體內(nèi)藥動學(xué)參數(shù)（ ±s）

參數(shù) SRL SRL-SD SRL-IC SRL- NLC SRL-SMEDDS Rapamune?AUC0→72(μg·h/ml) 0.70±0.13 2.06±0.79 3.66±2.64 8.60±2.03 10.76±1.57 11.02±2.73 AUC0→t(μg·h/ml) 0.73±0.15 2.07±0.81 3.78±2.84 8.67±1.95 11.15±2.11 11.75±3.13 t1/2 (t/h) 16.53±1.50 14.50±2.15 20.64±5.45 8.97±6.87 12.97±5.67 14.54±5.67 tmax(t/h) 1.04±0.25 1.25±0.28 1.04±0.25 1.13±0.31 1.50±0.38 1.83±0.26 cmax (ng/ml) 0.16±0.05 0.36±0.05 0.53±0.13 0.90±0.09 1.23±0.07 1.28±0.13

本研究同時制備和比較了SRL 的4 種增溶制劑，均顯示了良好的體外溶出度。同時，各制劑都提高了SRL 的生物利用度，但體內(nèi)吸收程度有較明顯的差異。

首先，SRL 本身的性質(zhì)是影響體內(nèi)吸收的重要因素。在理化性質(zhì)方面，SRL 在電解質(zhì)溶液中可發(fā)生開環(huán)水解，特別是在強酸和堿性條件下，降解速率顯著增加[14]。在生理因素方面，SRL 是腸道內(nèi)CYP3A4 酶和P 糖蛋白的底物，對腸道吸收有較大影響[15]。

其次，制劑本身的特點對體內(nèi)吸收有重要影響。SMEDDS 和NLC 均可形成納米級的脂質(zhì)微粒，在胃腸道消化后可形成乳糜膠束[16-17]均減輕了胃腸液的pH 對SRL 的降解作用，因此SMEDDS和NLC 對脂質(zhì)微粒中的SRL 有一定的保護(hù)作用。相比之下，SD 中的SRL 快速釋放后，載體材料失去了對藥物的隔離保護(hù)作用，導(dǎo)致SRL 在極短的時間內(nèi)發(fā)生降解。另外，環(huán)糊精的空腔可以容納藥物分子[18]，不僅提高了SRL 的溶解度，而且降低了H+和OH-對SRL 的作用概率，減緩了SRL 的降解。本研究的體外溶出試驗也證實了不同增溶制劑中SRL 穩(wěn)定性的差異。

同時，SMEDDS 的輔料Labrafil M1944 CS 和Cremophor EL[9,19-21]和NLC 中的脂質(zhì)及其代謝產(chǎn)物能夠抑制CYP3A4 酶的代謝和P 糖蛋白外排，消化后形成的乳糜膠束還可通過淋巴途徑吸收[22]，從而提高了生物利用度[10-11]。

另外，由于SRL 分子量較大，分子結(jié)構(gòu)可能僅有部分插入環(huán)糊精的空腔中。因此，盡管環(huán)糊精提高了SRL 的溶出度，但包合物的穩(wěn)定性較差，進(jìn)入胃腸道后，藥物可被胃腸液中的成分替換[23]，導(dǎo)致SRL 加速降解或發(fā)生重結(jié)晶，進(jìn)而生物利用度下降。