紅色諾卡菌細(xì)胞壁骨架中化學(xué)成分的鑒別與單糖含量測(cè)定

萬(wàn) 眾，于 丹，王 菲，李 偉，張 海 （. 上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院泌尿外科，上海 00080；. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 5055；. 同濟(jì)大學(xué)附屬第一婦嬰保健院藥劑科，上海 004）

紅色諾卡菌（Nocardia rubra，Nr）是一種放線(xiàn)菌， 其 細(xì) 胞 壁 骨 架（Nocardia rubracell wall skeleton，Nr-CWS）具有免疫調(diào)節(jié)作用[1]。Nr-CWS作為一種治療藥物現(xiàn)已在國(guó)內(nèi)上市并在臨床使用。研究表明，Nr-CWS 在增強(qiáng)體內(nèi)巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞活性的同時(shí)，還能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生LAK 細(xì)胞，提高機(jī)體內(nèi)T 輔助性細(xì)胞和殺傷細(xì)胞活力、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞免疫活性，抑制腫瘤和增強(qiáng)免疫能力的功效[2-4]。但Nr-CWS 在發(fā)揮作用的同時(shí)，往往還伴隨一些副作用的發(fā)生。究其主要原因是由于紅色諾卡菌細(xì)胞壁是個(gè)細(xì)胞粗提物[5]，其中的成分復(fù)雜，具體哪種成分起相應(yīng)的藥理作用還不清楚，這極大地影響了其臨床使用及后續(xù)藥理作用機(jī)制的研究。本研究擬采用UHPLC-Q-TOF/MS 分析方法首先對(duì)Nr-CWS 提取物中化學(xué)成分進(jìn)行分離分析，鑒別其中的化學(xué)成分；并對(duì)其中的多糖成分進(jìn)行水解，然后對(duì)水解后的單糖進(jìn)行衍生化處理，與其他分析方法相比, UHPLC-MS/MS 具有較大的優(yōu)越性[6-8],其靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)、可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定單糖的含量。所以本研究采用UHPLC-MS/MS 方法對(duì)單糖衍生化產(chǎn)物進(jìn)行定量分析測(cè)定，這將為后期開(kāi)展Nr-CWS 活性成分篩選及藥理作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

安捷倫-1 290 Infinity 高效液相色譜系統(tǒng)-電噴霧離子源（安捷倫，Palo Alto, CA, USA）串聯(lián)安捷倫6 538 四級(jí)桿-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜（UHPLC-QTOF/MS），安捷倫-1 290 Infinity 高效液相色譜系統(tǒng)-電噴霧離子源（安捷倫，Palo Alto, CA, USA）串聯(lián)安捷倫6 460 三重四級(jí)桿質(zhì)譜（ UHPLCMS/MS），AMIDE 色譜柱（3.0 mm×100 mm，3.5 μm，Waters，USA），Waters Xbridge C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，Milli-Q50 SP 純水制備系統(tǒng)制備（Millipore Corporation, MA, USA），電熱干燥箱（上海恒科儀器有限公司，DHG-9145AZ）。

1.2 材料與試劑

Nr-CWS 提取物（遼寧格瑞士特生物科技有限公司，按照產(chǎn)品工藝提?。?；Sephadex G-100（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖（純度＞98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三氟乙酸(TFA)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；HPLC 色譜級(jí)甲醇、乙腈（默克公司，Darmstadt, Germany）；乙醇、甲酸（Fluka 公司，Buchs, Switzerland）。

2 方法與結(jié)果

2.1 Nr-CWS 提取物中化學(xué)成分分析與鑒別

2.1.1 UHPLC-Q-TOF/MS 成分分析與鑒別的條件

UHPLC-Q-TOF/MS 分 析 在 安 捷 倫 1 290 Infinity 液相色譜系統(tǒng)和安捷倫6 538 四極桿-高分辨飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent，USA)上進(jìn)行，色譜分離在Amide 色譜柱上進(jìn)行（3.0 mm×100 mm，3.5 μm，Waters，USA），柱溫40 ℃，流動(dòng)相A 為0.1 %甲酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈溶液，流速0.4 ml/min，流動(dòng)相采用梯度洗脫，洗脫條件為：0～1 min，5 %A；1～5 min，5 %～20 % A；5～20 min，20%～45 % A；20～30 min，45 % A，進(jìn)樣量為5 μl，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度保持在25 ℃。電噴霧離子源（ESI）采用正、負(fù)離子模型。Q-TOF/MS 質(zhì)譜參數(shù)如下：毛細(xì)管電壓，正離子模式下4 kV，負(fù)離子模式下3.5 kV；干燥器流速11 L/min；氣體溫度350 ℃；霧化器壓力45 psig；碎片電壓120 eV；Skimmer 電壓60 eV。質(zhì)譜的采集范圍m/z50～1 100，分析碰撞能量10～40 eV。

2.1.2 Nr-CWS 提取物樣品溶液的制備

取Nr-CWS 提取物溶于1 ml 純水中，充分渦旋溶解后制成Nr-CWS 提取物母液，取100 μl 于1.5 ml EP 管中，加入3 倍量的乙醇進(jìn)行蛋白沉淀。然后4 ℃下13 000 r/min 離心15 min，吸取200 μl上清液，于進(jìn)樣瓶中用于UHPLC-Q-TOF/MS 分析。

2.1.3 Nr-CWS 提取物中化學(xué)成分的分析與鑒別

采用UHPLC-Q-TOF/MS 分析方法對(duì)Nr-CWS提取物樣品溶液進(jìn)行快速地分離與分析，獲得正、負(fù)離子模式下的總離子流圖，通過(guò)與Metlin 數(shù)據(jù)庫(kù)中代謝物信息比對(duì)分析，可對(duì)Nr-CWS 提取物中化學(xué)成分進(jìn)行快速分析與鑒別，結(jié)果如圖1 和表1 所示。

2.2 Nr-CWS 提取物中單糖成分的含量測(cè)定

2.2.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

準(zhǔn)確稱(chēng)取D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖各10 mg，分別置10 ml 容量瓶，各加水定容，即得1 mg/ml濃度的各單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密取上述單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合后加重蒸水稀釋?zhuān)瞥?00 μg/ml的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 衍生化試劑的制備[9-12]

精密稱(chēng)取1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)1.0 g，置10 ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，制得0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液。

2.2.3 單糖衍生化前處理方法[13-14]

精密吸取單糖及混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液100 μl 置2 ml EP 管中，添加100 μl 氨水，再加入100 μl 0.5 mol/L的PMP 甲醇溶液，渦旋30～45 s，于70 ℃烘箱中加熱30 min，取出放冷至室溫。加入100 μl 乙酸，渦旋30 s 中和，加重蒸水至1 ml，再加500 μl 氯仿，渦旋30 s，混勻，棄去下層溶液，重復(fù)3 次，12 000 r/min離心10 min，水層經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取次濾液用于UHPLC-MS/MS 分析，見(jiàn)表2。

表1 Nr-CWS 中化學(xué)分析的UHPLC-Q-TOF/MS 數(shù)據(jù)信息

2.2.4 單糖衍生物的UHPLC-MS/MS 分析條件

UHPLC-MS/MS 分析采用安捷倫1 290 Infinity液相色譜系統(tǒng)和安捷倫6 460 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent，USA)。色譜分離在Waters Xbridge C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱溫40 ℃，流動(dòng)相A 為20 mmol/L 的乙酸銨水溶液（氨水調(diào)pH 8.0），流動(dòng)相B 為乙腈溶液，流速0.4 ml/min，流動(dòng)相采用梯度洗脫，洗脫條件為：0～2 min，15%～20% B； 2～4 min， 20%～25% B； 4～5 min，25%～95 % B，5～6 min，15 % B，樣品分析時(shí)間5 min，柱后平衡時(shí)間1 min。進(jìn)樣量為2 μl，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度保持25 ℃。三重四級(jí)桿質(zhì)譜條件為：電噴霧離子源（ESI）采用負(fù)離子，多級(jí)反應(yīng)選擇離子監(jiān)測(cè)模式：毛細(xì)管電壓3.5 kV；干燥器流速11 L/min；氣體溫度350 ℃；霧化器壓力40 psig；碎片電壓80 eV；Skimmer 電壓60 eV。

2.2.5 Nr-CWS 提取物中多糖的水解

精密吸取Nr-CWS 提取物溶液1 ml，加入2 mol/L的TFA 2.0 ml，放入110 ℃的真空干燥箱中，酸性條件下水解6 h，冷卻至室溫，4 ℃條件下離心干燥，揮發(fā)三氟乙酸，加重蒸水1 ml 復(fù)溶，用于衍生化處理。

2.2.6 Nr-CWS 提取物中單糖成分衍生化樣品的制備和UHPLC-MS/MS 的含量測(cè)定

精密吸取Nr-CWS 提取物的水解液100 μl，按照前述單糖衍生化方法進(jìn)行前處理后，精密吸取前處理后的樣品溶液2 μl 進(jìn)UHPLC-MS/MS 分析，混合標(biāo)準(zhǔn)品和Nr-CWS 樣品衍生化后的UHPLCMS/MS 色譜圖見(jiàn)圖2。

2.2.7 單糖分析的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和定量限、檢測(cè)限

精密吸取單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按前述單糖衍生化方法進(jìn)行前處理后，精密吸取前處理后的樣品溶液2 μl 用UHPLC-MS/MS 法分析，以各單糖峰面積與相應(yīng)濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，逐步稀釋后，按照信噪比S/N=10 和3，分別計(jì)算其定量限和檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.8 精密度試驗(yàn)

取經(jīng)水解和衍生化反應(yīng)后的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前述UHPLC-MS/MS 分析測(cè)定條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算其測(cè)定結(jié)果的RSD 為3.13%，結(jié)果表明該方法的精密度良好，符合分析測(cè)定的要求。

2.2.9 單糖衍生化樣品的穩(wěn)定性試驗(yàn)

Nr-CWS 提取物溶液經(jīng)水解和衍生化反應(yīng)后，室溫下放置，分別于0、5、l5、30、60、120 min 進(jìn)樣，進(jìn)行UHPLC-MS/MS 分析，測(cè)定其濃度，對(duì)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果6 次測(cè)定結(jié)果的RSD 為7.63%，表明樣品在2 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合分析測(cè)定的要求。

2.2.10 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，重復(fù)測(cè)定6 次，計(jì)算其測(cè)定結(jié)果RSD 為4.67%，表明該方法的重復(fù)性良好，符合分析測(cè)定的要求。

2.2.11 回收率試驗(yàn)

精密吸取已知含量的Nr-CWS 提取物加入接近等量的單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，經(jīng)水解和衍生化反應(yīng)后，進(jìn)行UHPLC-MS/MS 分析，計(jì)算其平均回收率為86.93%，RSD 為9.15%，符合分析測(cè)定的要求。

表3 單糖衍生物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及定量限和檢測(cè)限

2.2.12 單糖含量測(cè)定

精密吸取Nr-CWS 提取物樣品溶液6 份，經(jīng)水解衍生化后，按照前述UHPLC-MS/MS 分析條件對(duì)衍生化后的樣品進(jìn)行分離分析，測(cè)定其中單糖的含量，結(jié)果見(jiàn)表4，可以看出8 種單糖成分都能被檢出，其中阿拉伯糖和半乳糖的含量最高。

表4 Nr-CWS 提取物（1～6）中8 種單糖成分的含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

Nr-CWS 提取物中化學(xué)成分的分析鑒別，采用UHPLC-Q-TOF/MS 分析方法對(duì)Nr-CWS 提取物樣品溶液進(jìn)行快速地分離分析[15-16]，獲得正、負(fù)離子模式下的總離子流圖，通過(guò)與Metlin 數(shù)據(jù)庫(kù)中代謝物信息快速地比對(duì)分析，共鑒別出Nr-CWS 提取物中64 個(gè)化學(xué)成分，其中包含氨基酸、脂肪酸、單糖、胞壁酸、粘肽等成分，說(shuō)明Nr-CWS 提取物中含有很多的細(xì)胞代謝產(chǎn)物，且以氨基酸、脂肪酸和糖類(lèi)成分為主，這些成分就是Nr-CWS 提取物發(fā)揮作用的主要成分。

由于Nr-CWS 提取物中成分復(fù)雜，采用UHPLCQ-TOF/MS 方法直接對(duì)提取物進(jìn)行分析，僅能檢測(cè)到個(gè)別單糖成分，如木糖、半乳糖、葡萄糖等，說(shuō)明Nr-CWS 提取物中主要含有多糖成分，經(jīng)水解衍生化后[17-20]，采用UHPLC-MS/MS 方法進(jìn)行檢測(cè)，8 個(gè)單糖都能被檢測(cè)到，且阿拉伯糖和半乳糖的含量最高，說(shuō)明Nr-CWS 中的多糖主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，這將為進(jìn)一步的多糖成分分析鑒別奠定基礎(chǔ)。

對(duì)單糖進(jìn)行分析測(cè)定的方法有很多，我們通過(guò)比較衍生化和不衍生化方法的檢測(cè)限和定量限，發(fā)現(xiàn)單糖衍生化后，其定量限和檢測(cè)限更低，測(cè)定干擾更少，分析方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，其精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和回收率均符合分析測(cè)定的要求。

4 結(jié)論

本研究采用UHPLC-Q-TOF/MS 方法對(duì)Nr-CWS 提取物中化學(xué)成分進(jìn)行了快速地分離與分析，通過(guò)與Metlin 代謝物成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共鑒別出Nr-CWS 提取物中64 個(gè)化學(xué)成分，主要包括氨基酸、糖類(lèi)、脂肪酸等成分；對(duì)Nr-CWS 提取物中糖類(lèi)成分衍生化后，采用UHPLC-MS/MS 分析方法對(duì)Nr-CWS 提取物中8 種單糖成分進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明，Nr-CWS 中阿拉伯糖的含量最高，其次為半乳糖，說(shuō)明Nr-CWS 中發(fā)揮作用的主要多糖類(lèi)成分可能主要由這幾種單糖組成。通過(guò)本研究為后期開(kāi)展Nr-CWS 活性成分篩選及藥理作用機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。