海綿共附生菌Streptomyces sp. LHW2432 的次級代謝產(chǎn)物研究

張 柳，沈瑤瑤，洪麗莉，李 蕾，周永軍，林厚文 （上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200127）

放線菌是天然藥用活性分子的重要源頭[1]。然而，近年陸生放線菌來源化合物的重復(fù)發(fā)現(xiàn)率日趨增高，海洋來源放線菌因其特殊的生長環(huán)境和豐富的次生代謝產(chǎn)物越發(fā)引起關(guān)注[1-2]。

海綿作為代表性的海洋底棲共生生物體，是產(chǎn)生功能分子的重要源頭[3]。而越來越多的證據(jù)表明共附生微生物是海綿化學(xué)多樣性的重要來源[4-6]。因此，開展海綿共附生微生物化學(xué)成分的研究，尋找新穎的、具有活性功能的小分子化合物顯得十分必要。

課題組從海綿共附生放線菌Streptomycessp.LHW2432 發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了2 個生物堿類化合物1和2，以及3 個吡喃酮類化合物3～5（圖1）。其中，1 為新型天然產(chǎn)物，具有抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和恥垢分支桿菌的微弱活性，并可作為合成神經(jīng)細胞保護劑三環(huán)咔唑類生物堿的關(guān)鍵前體[7]。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

1.1.1 實驗儀器和試劑

Agilent 600 MHz 核磁共振儀（Agilent）；Xevo G2-XS QTOF 質(zhì)譜儀（Waters）；Acquity UPLC 高效液相色譜儀（Waters）；Interchim PuriFlash 450 中壓色譜儀（Interchim）；ODS（YMC，C18，21.2 mm ×250 mm，5 μm）；XBridge C18半制備型液相色譜柱（ Waters, XBridge Prep C18， 10 mm × 250 mm，5 μm）；C18制備型液相色譜柱（Phenomenex，Luna C18，21.2 mm × 250 mm，5 μm）；N-1000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎）；SK5200H 型超聲儀（上海科導(dǎo)）；振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚）；培養(yǎng)箱（上海博遠）。色譜級溶劑（Merk）；分析純試劑（上?；瘜W(xué)試劑公司）；氘代試劑（Cambridge Isotope Laboratories）。

1.1.2 培養(yǎng)基

TSBY 培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆肉湯（30 g/L）、酵母提取物（5 g/L）、蔗糖（100 g/L）、消泡劑（1 ml/L）；SFM 培養(yǎng)基：低溫黃豆餅粉（20 g/L）、瓊脂（20 g/L）、甘露醇（20 g/L），pH 7.2～7.4；MH 培養(yǎng)基（Solarbio?）：MH 肉湯（22 g/L）；PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯（200 g/L）、瓊脂（20 g/L）、葡萄糖（20 g/L）。

1.2 菌株來源及鑒定

鏈霉菌LHW2432 分離自南海海綿（紅色指狀，種屬未鑒定，本實驗室編號1524），經(jīng)16S rRNA 基因序列（1 376 bp）比對，與Streptomyces purpurascens相似度達99.42%，鑒定為鏈霉菌。

指示菌蕈狀芽胞桿菌（Bacillus mycoides）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistantStaphylococcus aureusCICC10201）、恥垢分支桿菌（Mycobacterium smegmatismc2155）、大腸桿菌（Escherichia coli）和白色念珠菌（Candida albicans）均取自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院仁濟醫(yī)院藥學(xué)部海洋藥物研究中心菌種庫。

1.3 發(fā)酵與萃取

將LHW2432 接種于SFM 平板，30 ℃培養(yǎng)5 d，挑取單菌落接種于裝有10 ml TSBY 培養(yǎng)基的100 ml三角瓶中（加有不銹鋼彈簧），30 ℃，220 r/min培養(yǎng)3 d，作為一級種子液；一級種子液以1∶20（V/V）接種于裝有150 ml TSBY 培養(yǎng)基的500 ml三角瓶中（加有不銹鋼彈簧），30 ℃，220 r/min 培養(yǎng)3 d，該發(fā)酵液作為二級種子液，繼續(xù)同樣條件的發(fā)酵，最終得到12 L 發(fā)酵液。用等體積乙酸乙酯萃取發(fā)酵液3 次，萃取液濃縮懸干后得到11.3 g 浸膏。

1.4 提取分離

通過正相硅膠柱色譜分離粗浸膏，二氯甲烷-甲醇洗脫梯度：150∶1、100∶1、80∶1、50∶1、25∶1、15∶1、5∶1、1∶1，共得到13 個餾分A～M。合并F 與G 餾分（1.91 g 干重）后經(jīng)中壓ODS色譜柱繼續(xù)分離[乙腈-水（0.1%甲酸）：5%～95%梯度洗脫，6 h，15 ml/min]，得到16 個餾分FG1～FG16。

化合物1（3.1 mg）和4（7.7 mg）由FG12（42.3 mg干重）餾分經(jīng)制備型HPLC 分離獲得，洗脫條件為：9 ml/min，53%甲醇-水（0.1%甲酸）。

化合物3（9.0 mg）和5（2.1 mg）由FG10（37.4 mg干重）餾分經(jīng)制備型HPLC 分離獲得。FG10 經(jīng)洗脫[9 ml/min，42%甲醇-水（0.1%甲酸）]得到化合物3 和組分FG10-5（7.5 mg 干重）；組分FG10-5 進一步洗脫得到化合物5，洗脫條件為：3 ml/min，30%乙腈-水（0.1%甲酸）。

化合物2（121 mg）分離自餾分J。J 餾分（4.357 g 干重）經(jīng)凝膠柱色譜[流動相：二氯甲烷-甲醇（1∶1）]砍斷得到5 個亞餾分J1～J5。選取J4（1.112 g 干重）再經(jīng)中壓ODS 柱色譜[甲醇-水（0.1%甲酸）：10%～95%梯度洗脫，2 h，15 ml/min]分離獲得化合物2。

1.5 抗菌活性測試方法

1.5.1 平板涂布法

如表1 所示，將200 μl～2 ml 過夜生長的5 種指示菌的菌液加入水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（MHA）或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中（約50 ℃）稀釋，搖勻后倒入培養(yǎng)皿中。待凝固后，滴加溶解于3 μl DMSO 溶液的樣品（約10 μg），設(shè)置一個陽性對照和一個DMSO 陰性對照，平板于相應(yīng)條件培養(yǎng)12 h 后觀察抑菌圈（表1）。

表1 5 種指示菌平板培養(yǎng)條件及遴選的陽性對照藥

1.5.2 微量稀釋法

使用肉湯稀釋法進行96 孔板實驗[8]。樣品和陽性對照藥分別設(shè)置3 個平行組，先將過夜培養(yǎng)的指示菌用MH 肉湯培養(yǎng)基進行1 000 倍稀釋后加入96 孔板，每孔50 μl。第1 列至第10 列樣品濃度依次為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μg/ml。加樣后37 ℃培養(yǎng)18 h，通過分光光度計（A600）檢測菌液澄清度。最后，根據(jù)實驗結(jié)果調(diào)整測試藥物濃度梯度，重復(fù)實驗。

2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：紅棕色固體。ESI-MSm/z270.1133[M+H]+（calcd for C16H16NO3，270.112 5），提示其相對分子質(zhì)量為269，推測該化合物結(jié)構(gòu)中含有一個N 原子，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 確定其分子式為C16H15NO3，計算其不飽和度為8。1H-NMR 在低場區(qū)顯示出4 個芳烴質(zhì)子信號δH7.85 (1H，m)、7.51(1H，m)、7.23 (2H，dd，J= 6.0，3.1 Hz)，高場區(qū)顯示2 個甲基質(zhì)子信號δH1.92 (3H，s)和1.25 (3H，d，J= 6.1 Hz)，1 個亞甲基質(zhì)子信號δH2.77 (2H，m)，1 個連氧次甲基質(zhì)子信號δH3.96 (1H，dt，J= 8.0，6.1 Hz)；13C-NMR 和DEPT 譜，在 低 場 區(qū) 顯 示 出2 個羰基碳信號 (δC172.8，183.6)、4 個芳基次甲基碳信號 (δC113.4，120.2，123.9，124.1)，6 個芳基或雙鍵季碳信號 (δC110.9，125.7，134.8，137.1，139.8，146.5)，在高場區(qū)顯示出2 個甲基碳信號 (δC12.2，23.8)、1 個亞甲基碳信號 (δC37.8) 和1 個連氧次甲基碳信號 (δC65.9)；將波譜信號進行歸屬，1H-NMR(600 MHz，DMSO-d6)：δ7.85 (m，H-5)，7.51 (m，H-8)，7.23 (dd，J= 6.0，3.1 Hz，H-6，7)，3.96 (dt，J=8.0，6.1 Hz，H-11)，2.76 (m，H-10)，1.92 (s，H-13)，1.25 (d，J= 6.1 Hz，H-12)。13C NMR (151 MHz，DMSO-d6)：δ183.6 (C-3)，172.8 (C-4)，146.5 (C-9a)，139.8 (C-1)，137.1 (C-8a)，134.8 (C-2)，125.7 (C-4b)，124.1 (C-7)，123.9 (C-6)，120.2 (C-5)，113.4 (C-8)，110.9 (C-4a)，65.9 (C-11)，37.8 (C-10)，23.8 (C-12)，12.2 (C-13)?；衔飻?shù)據(jù)與文獻[9-10]報道一致，結(jié)構(gòu)鑒定為咔唑-3，4-鄰醌生物堿descycloavandulyllavanduquinocin。

化合物2：白色無定型粉末。ESI-MSm/z180.1022 [M+H]+（calcd for C10H14NO2，180.101 9），相對分子質(zhì)量為179，說明該化合物可能含有一個N 原子，結(jié)合13C-NMR 確定其分子式為C10H13NO2，計算不飽和度為5。1H-NMR 中包含4 個芳烴質(zhì)子信 號δH6.97 (2H，m)、6.67 (2H，m)，結(jié) 合13CNMR 中的6 個雙鍵碳信號，推斷該化合物中含有一個對位二取代的苯環(huán)，其中一個碳信號 (δC155.6) 化學(xué)位移值向低場偏移，說明是一個連氧取代的芳基碳原子；歸屬該化合物的波譜信號，1HNMR (600 MHz，DMSO-d6)：δ9.20 (brs，1′-OH)，7.87(t，J= 5.5 Hz，1-NH)，6.97 (m，H-3′，H-5′)，6.67 (m，H-2′，H-6′)，3.17 (m，H-8′)，2.56 (dd，J= 8.4，6.6 Hz，H-7′)，1.77 (s，H-2)；13C NMR (151 MHz，DMSOd6)：δ169.1 (C-1)，155.6 (C-1′)，129.6 (C-4′)，129.5(C-1′，C-5′)，115.1 (C-2′，C-6′)，40.6 (C-8′)，34.5 (C-7′)，22.7 (C-2)。與文獻數(shù)據(jù)[11-12]比對，該化合物被鑒定為N-乙酰酪胺（N-acetyltyramine）。

化合物3：淡黃色固體。ESI-MSm/z183.1028[M+H]+（calcd for C10H15O3，183.101 6），提示其相對分子質(zhì)量為182，結(jié)合1H 和13C-NMR 數(shù)據(jù)推測其分子式為C10H14O3，不飽和度為4。1H-NMR 的低場區(qū)顯示出一個雙鍵質(zhì)子信號δH5.95 (1H，s)，高場區(qū)顯示3 個甲基質(zhì)子信號δH0.81 (3H，t，J=7.4 Hz)、1.10 (3H，d，J= 6.9 Hz) 和1.73 (3H，s)，1 對亞甲基質(zhì)子信號δH1.54 (1H，m)、1.44 (1H，m)，1 個 次 甲 基 質(zhì) 子 信 號δH2.43 (1H，m)；13CNMR 和DEPT 譜顯示共有10 個碳信號，包括4 個雙鍵或羰基季碳信號，1 個sp2雜化的雙鍵次甲基碳信號，1 個sp3雜化的次甲基碳信號，1 個sp3雜化的亞甲基碳信號，3 個甲基碳信號。如下為化合物的波譜信號歸屬，1H-NMR (600 MHz，DMSOd6)：δ5.95 (s，H-5)，2.43 (m，H-7)，1.73 (s，H-11)，1.54 (m，H-8a)，1.44 (m，H-8b)，1.10 (d，J= 6.9 Hz，H-10)，0.81 (t，J= 7.4 Hz，H-9)。13C NMR (151 MHz，DMSO-d6)：δ165.8 (C-2)，165.5 (C-4)，165.2(C-6)，98.9 (C-5)，96.2 (C-3)，38.7 (C-7)，26.9 (C-8)，17.7 (C-10)，11.3 (C-9)，8.5 (C-11)。結(jié)合比對文獻[13]核磁譜圖數(shù)據(jù)，該化合物鑒定為phomapyrone C。

化合物4：棕色固體。ESI-MSm/z197.1181[M+H]+（calcd for C11H17O3，197.1172），提示其相對分子質(zhì)量為196，結(jié)合1H 和13C-NMR 數(shù)據(jù)推測其分子式為C11H16O3，不飽和度為4。比較化合物4 和3 的核磁數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)4 的1H-NMR 低場區(qū)存在一個雙鍵質(zhì)子信號δH5.95 (1H，s)，13C-NMR 低場區(qū)存在4 個 雙 鍵 或 羰 基 季 碳 信 號 (δC165.8，165.2，164.7，102.5)、1 個雙鍵次甲基碳信號 (δC98.8)，這些核磁數(shù)據(jù)與化合物3 的吡喃-2-酮單元的數(shù)據(jù)基本一致，提示其存在一個相同的骨架結(jié)構(gòu)?；衔? 和3 的結(jié)構(gòu)不同之處在于，化合物4 的1H 和13C -NMR 數(shù)據(jù)中多一個亞甲基信號 (δH2.26，δC16.2)。其信號具體歸屬如下：1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)：δ5.93 (s，H-5)，2.42 (m，H-7)，2.26 (q，J= 7.4 Hz，H-11)，1.55 (m，H-8a)，1.44 (m，H-8b)，1.10 (d，J= 6.9 Hz，H-10)，0.94 (t，J= 7.4 Hz，H-12)，0.81 (t，J= 7.4 Hz，H-9)。13C NMR (151 MHz，DMSO-d6)：δ165.8 (C-2)，165.2 (C-4)，164.7 (C-6)，102.5 (C-3)，98.8 (C-5)，38.7 (C-7)，26.8 (C-8)，17.6(C-10)，16.2 (C-11)，12.6 (C-12)，11.4 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]基本一致，故被鑒定為germicidin A。

化合物5：棕色固體。ESI-MS 顯示[M+ H]+分子離子峰m/z183.1021(calcd for C10H15O3，183.101 6)，確定其相對分子質(zhì)量為182，結(jié)合1H 和13CNMR 數(shù)據(jù)確定其分子式為C10H14O3，不飽和度為4。該化合物氫譜存在一個雙鍵質(zhì)子δH5.95 (1H，s) 信號，碳譜存在4 個季碳信號 (δC165.8，165.2，164.7，102.5)、1 個雙鍵次甲基碳信號 (δC98.8)，提示其含有和化合物3 一樣的吡喃-2-酮骨架結(jié)構(gòu)。化合物5 和3 的分子量相同，是同分異構(gòu)體，但其1H 和13C -NMR 數(shù)據(jù)中存在特征性的偕甲基信號[δH0.88 (H-9，H-10)，δC21.9 (C-9，C-10)]。具體的信號歸屬如下：1H-NMR (600 MHz，DMSO-d6)：δ5.92 (s，H-5)，2.25 (d，J= 7.2 Hz，H-7)，1.90 (m，H-8)，1.72 (s，H-11)，0.88 (d，J= 6.6 Hz，H-9，H-10)。13C NMR (151 MHz，DMSO-d6)：δ165.3 (C-2)，165.2(C-4)，161.2 (C-6)，101.1 (C-5)，95.9 (C-3)，41.7 (C-7)，26.3 (C-8)，21.9 (C-9)，21.9 (C-9)，8.5 (C-11)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]基本一致，故被鑒定為germicidin I。

3 抗菌活性測試結(jié)果

3.1 活性初篩

平板涂布結(jié)果顯示：化合物1 僅對MRSA 和恥垢分支桿菌出現(xiàn)中等大小抑菌圈，陽性藥物對相應(yīng)指示菌均產(chǎn)生顯著大小抑菌圈，其他化合物未使5 種指示菌產(chǎn)生明顯抑菌圈。

3.2 檢測化合物1 的MIC 值

根據(jù)初篩結(jié)果，以MRSA 和恥垢分支桿菌為指示菌，采用微量稀釋法，最終確定化合物1 對MRSA 和恥垢分支桿菌的MIC 值分別為100 和64 μg/ml。

4 討論

生物堿是一類含氮的天然藥用分子，抗癌藥紫杉醇、止痛藥嗎啡和抗瘧疾的奎寧類藥物均屬此類[16]。文獻報道，具有脂肪族側(cè)鏈的三環(huán)咔唑生物堿可通過自由基清除作用保護神經(jīng)細胞[9,17-18]，例如lavanduquinocin，neocarazostatins 和carquinostatins[7,19-20]。

課題組以一株中國南海海綿共附生鏈霉菌Streptomycessp. LHW2432 為研究對象，發(fā)現(xiàn)了2 個生物堿類化合物1 和2，以及3 個吡喃酮類化合物3～5（圖1）?；衔? 此前發(fā)現(xiàn)于真菌和放線菌中[21-22]，具有自由基清除功能[23]。有報道化合物3～5 在鏈霉菌形態(tài)分化中具有抑制產(chǎn)孢的功能[24]?；衔? 為三環(huán)咔唑生物堿類新天然產(chǎn)物，課題組發(fā)現(xiàn)其具有抑制MRSA 和恥垢分支桿菌的微弱活性。此外，化合物1 可作為化學(xué)合成藥用活性三環(huán)咔唑類生物堿的重要前體[9]，本研究首次發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生化合物1 的宿主菌，為通過發(fā)酵手段廉價獲取該中間體分子提供了可能。