SLE-UPLC-MS/MS檢測(cè)血液中溴敵隆和大隆*

時(shí)巧翠，李曉飛，謝偉宏

(1 浙江警察學(xué)院刑事科學(xué)技術(shù)系，浙江 杭州 310053；2 杭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江 杭州 310004)

我國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，滅鼠劑應(yīng)用廣泛。因?yàn)槎拘詮?qiáng)，極易引起中毒，毒鼠強(qiáng)、氟乙酰胺等急性滅鼠藥逐漸被禁止使用?，F(xiàn)在被廣泛使用的主要是抗凝血類的慢性殺鼠藥[1]。溴敵隆和大隆是目前使用較多的抗凝血?dú)⑹笏帯Ｓ捎阡鍞陈『痛舐”容^容易獲得，近年來(lái)人、家畜等誤食中毒以及被用來(lái)投毒的情況時(shí)有發(fā)生。因此，建立一種快速檢測(cè)血液中溴敵隆和大隆的方法，既能使中毒者獲得對(duì)癥治療又可以為公安機(jī)關(guān)立案?jìng)善萍霸V訟提供科學(xué)依據(jù)。

目前在法庭科學(xué)中廣泛應(yīng)用的前處理方法主要有固相萃取、液液萃取等。這些前處理方法雖然成本較低，但存在操作繁瑣費(fèi)時(shí)，常需要使用對(duì)人體和環(huán)境有毒害作用的有機(jī)溶劑且提取率較低。樣品前處理技術(shù)是能夠直接影響毒物檢出率的關(guān)鍵步驟[2]。Johnson于1997年提出一種新的樣品前處理技術(shù)，即介質(zhì)液液萃取(supported liquid extraction，SLE)技術(shù)[3]。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便，基質(zhì)干擾小，能大大縮短樣品的提取時(shí)間，提高樣品的回收率，并且在96孔板結(jié)構(gòu)的高通量體系中也可以使用。在藥物分析[4]，食品安全，環(huán)境檢測(cè)及法庭科學(xué)等很多方面都有應(yīng)用介質(zhì)液液萃取技術(shù)的相關(guān)報(bào)道[5-6]。

目前，一般采用氣相色譜法[7]、液相色譜法[8]、氣質(zhì)聯(lián)用法及液質(zhì)聯(lián)用法[9-10]等來(lái)檢測(cè)生物撿材中的溴敵隆和大隆。本研究建立了SLE-UPLC-MS/MS(介質(zhì)液液萃取-高效液相色譜-三重四級(jí)桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜)檢測(cè)血液中溴敵隆和大隆的方法。該方法能夠快速有效地對(duì)血液樣品中的溴敵隆和大隆進(jìn)行定性與定量分析且具有選擇性強(qiáng)、提取率高、 重現(xiàn)性好，檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀(Shimazu LC 20A/AB Sciex Qtrap 6500)；介質(zhì)液液萃取柱(Biotage ISOLUTE SLE 1 mL)。100 μg/mL的溴敵隆和大隆標(biāo)準(zhǔn)溶液，Accustandard公司。

緩沖溶液：pH為2的緩沖溶液由0.2 mol/L HCl溶液和0.2 mol/L KCl溶液按比例配制而成；用0.2 mol/L Na2HPO4溶液和0.2 mol/L NaH2PO4溶液按比例配制成pH為4和6的緩沖溶液；pH為7的緩沖溶液以飽和NaCl溶液代替。

甲酸、甲醇、乙腈均為色譜純。乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿均為分析純。

1.2 儀器工作條件

色譜條件：色譜柱為Kinetex C18(50 mm×3.0 mm，2.6 μm)；柱溫40 ℃；流速0.8 mL/min。流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈:甲醇=1:1(V:V)。梯度洗脫程序?yàn)椋築相初始為10%，0.5 min升到90%，保持到3 min，3.1 min降到10%，一直保持到6 min，進(jìn)樣量5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；分析物在負(fù)離子模式下進(jìn)行檢測(cè)；輔助加熱氣溫度為500 ℃；離子化電壓為-4500 V；壓力選擇Medium；噴霧氣壓力為50 psi；輔助加熱氣壓力為50 psi；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；氣簾氣壓力為20 psi；碰撞氣為N2。主要質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 溴敵隆和大隆的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for bromoadiolone and brodifacoum

1.3 血液樣品的處理方法

在空白血液中加入一定量的溴敵隆和大隆，在振蕩器上振動(dòng)30 s，使其混合均勻。用移液槍準(zhǔn)確移取0.5 mL血樣，加入到0.3 mL 緩沖溶液(pH=2)中，振蕩器上振動(dòng)30 s，混合混勻。將上述制備好的血液樣品加入到SLE柱中并施加一定的壓力，使樣品全部均勻分散在填料上。靜置2 min后，用流速為1 mL/min的洗脫液將其洗脫，并施加壓力將柱中殘余液體擠出。用氮?dú)鈱⑾疵撘捍蹈珊螅贸跏剂鲃?dòng)相溶解并定容至1 mL，在上述選定的儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

取濃度為100 ng/mL的溴敵隆與大隆標(biāo)準(zhǔn)溶液，ESI負(fù)離子模式下，采用微量蠕動(dòng)泵連續(xù)進(jìn)樣，一級(jí)質(zhì)譜全掃描，來(lái)確定二者的準(zhǔn)分子離子。溴敵隆與大隆的準(zhǔn)分子離子峰分別為525.2(m/z)和521.0(m/z)。以溴敵隆和大隆的準(zhǔn)分子離子峰為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，選豐度最高的兩個(gè)特征碎片離子作為定性定量離子。對(duì)特征離子對(duì)的去簇電(Declustering-potential，DP)、碰撞能量 (Collision energy，CE ) 碰撞室入口電壓(Entrance potential，EP)和出口電壓(Collision cell exit potential，CXP) 進(jìn)行優(yōu)化。相關(guān)主要質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

2.2 液相色譜條件的選擇

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中分別比較了體積比為1:1乙腈-甲醇溶液、0.1%甲酸-水、0.1%甲酸-甲醇、0.1%甲酸-乙腈、0.1%甲醇-乙腈、水-乙腈共6種流動(dòng)相對(duì)分析結(jié)果的影響。當(dāng)流動(dòng)相為0.1%甲酸-水溶液時(shí)，溴敵隆和大隆的峰形和分離效果都比較理想，因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇0.1%甲酸-水溶液和體積比為1:1乙腈-甲醇溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。溴敵隆和大隆的MRM圖質(zhì)譜圖分別如圖1和圖2所示。

圖1 溴敵隆和大隆的總離子流圖Fig.1 TIC of bromoadiolone and brodifacoum

圖2 溴敵隆和大隆的MRM圖Fig.2 MRM chromatogram of bromoadiolone and brodifacoum

2.3 介質(zhì)液液萃取(SLE)條件的優(yōu)化

在空白血液基質(zhì)中配制含有溴敵隆和大隆均為100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液并采用UPLC/MS/MS進(jìn)行檢測(cè)分析。

2.3.1 萃取體系pH值的選擇

傳統(tǒng)液液萃取方法提取血中溴敵隆和大隆，一般不需要添加緩沖溶液。在本實(shí)驗(yàn)中采用液液萃取柱，不添加緩沖溶液，僅根據(jù)溴敵隆和大隆的溶解性，分別采用乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷進(jìn)行提取，結(jié)果顯示溴敵隆和大隆的回收率均小于1%。若添加酸性緩沖溶液則能大幅度提高溴敵隆和大隆的回收率。

在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中固定平衡時(shí)間為2 min、溶劑使用4 mL×2乙酸乙酯，考察萃取體系的pH值分別為2、4、6、7條件下萃取效率變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)萃取體系的pH值為2時(shí)，溴敵隆和大隆回收率最高。這可能是因?yàn)殇鍞陈『痛舐【鶠槿跛嵝越Y(jié)構(gòu)的原因。因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇萃取體系的pH值為2。

2.3.2 萃取溶劑的選擇

固定萃取體系的pH值為2、平衡時(shí)間為2 min、溶劑使用量為4 mL×2，考察乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷以及二元混合溶劑乙酸乙酯+氯仿=1+1、乙酸乙酯+二氯甲烷=1+1幾種萃取溶劑的萃取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用乙酸乙酯作為萃取溶劑時(shí)溴敵隆和大隆的回收率均大于85%，回收效果較好。因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇乙酸乙酯作為溴敵隆和大隆的萃取溶劑。

2.3.3 萃取溶劑用量的選擇

固定pH條件為2、平衡時(shí)間為2 min、溶劑使用乙酸乙酯，當(dāng)萃取溶劑使用量分別為2 mL×2、3 mL×2、4 mL×2時(shí)，溴敵隆和大隆的回收率隨萃取溶劑用量的增加而增加。當(dāng)萃取溶劑使用量為5 mL×2時(shí)，溴敵隆和大隆的回收率反而有所降低。因此實(shí)驗(yàn)過(guò)程中選擇乙酸乙酯的用量為4 mL×2。

2.3.4 平衡時(shí)間的選擇

固定pH條件為2、使用4 mL×2乙酸乙酯作為萃取溶劑，當(dāng)樣品均勻分散在SLE柱填料上以后，考察靜置時(shí)間分別為2 min、5 min、10 min時(shí)溴敵隆和大隆的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)平衡時(shí)間為2 min時(shí)，溴敵隆的回收率最高，隨著平衡時(shí)間的增加溴敵隆的回收率開始下降。但大隆的回收率隨平衡時(shí)間的變化較小。因此選擇2 min為實(shí)驗(yàn)過(guò)程的平衡時(shí)間。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 工作曲線和方法檢出限

在空白血液基質(zhì)中配制含有溴敵隆和大隆均為5、10、25、50、100、200 ng/mL 6個(gè)濃度水平的添加血，按選定的色譜和質(zhì)譜條件進(jìn)行測(cè)定。以峰面積(y)對(duì)樣品中溴敵隆和大隆的質(zhì)量濃度(x, ng/mL)作圖，溴敵隆和大隆的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)如表2所示。采用的含有溴敵隆和大隆均為1 ng/mL的添加血，按上述試驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)分析，以豐度較低的子離子峰強(qiáng)度的信噪比(S/N)為3計(jì)算溴敵隆和大隆的檢出限(LOD)分別為0.1 ng/mL和0.092 ng/mL。

表2 溴敵隆和大隆的線性參數(shù)及檢出限Table 2 Linear equation, correlation coefficient, linear range and LOD of bromoadiolone and brodifacoum

2.4.2 方法的加標(biāo)回收率和精密度

表3 溴敵隆與大隆在空白血液中的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precision of bromoadiolone and brodifacoum in spiked blank blood

采用空白血樣加標(biāo)的方式進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，在線性范圍內(nèi)分別加入濃度為10，50，200 ng/mL的溴敵隆和5，50，200 ng/mL的大隆，按照以上所選定的實(shí)驗(yàn)方法平行測(cè)定6次，兩種目標(biāo)化合物的平均回收率78.7%～95.8%，RSD為3.3%～8.6%，具體數(shù)據(jù)如表3所示。

3 結(jié) 論

本研究利用SLE技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-三重四級(jí)桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜建立了血液中溴敵隆和大隆的檢測(cè)方法。利用該檢測(cè)方法對(duì)血液中的溴敵隆和大隆進(jìn)行了定性與定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法具有良好的靈敏度、精密度和重現(xiàn)性，能快速高效檢測(cè)血液中的溴敵隆和扎大隆，滿足偵查、訴訟及醫(yī)療急救的檢測(cè)要求。