HPLC法測定牛黃解毒片中大黃素的含量

雷 楊，韓 宇，殷 丹*

（1.通化市食品藥品檢驗所，吉林 通化 134000；2.吉林市食品藥品檢驗所，吉林 吉林 132000）

1 儀器、試劑

紫外-可見分光光度計；高效液相色譜儀為A g i lent1200、Agilent1200SL和Ultimate3000；大黃素對照品來自中國藥品生物制品檢定所，甲醇為色譜純，其余相關(guān)試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 色譜條件

色譜柱：C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）；檢測波長：254 nm。

2.2 對照組

參照《中國藥典》[1]2015年版一部中大黃項下，稱定適量大黃素對照品加甲醇制成濃度為80 μg/mL的對照品溶液。

2.3 牛黃解毒片供試品

參照《中國藥典》2015年版一部中大黃項下，稱定牛黃解毒片供試品研成的粉末2.0 g，加50 mL甲醇。加熱回流60 min，冷卻后定容并進行震蕩，并予以過濾兩次，留取續(xù)濾液。量取5 mL濾液，加入10 mL鹽酸（濃度8%），超聲處理120s，再加三氯甲烷10 mL，再次進行加熱回流60 min。待其冷卻后采用分液漏斗進行分層。留取三氯甲烷層，剩下的溶液再以同法進行萃取2次。將得到的三氯甲烷層進行合并，合并后進行減壓蒸餾，以回收三氯甲烷溶劑。將回收完畢的溶液殘渣加入10 mL甲醇，定容搖勻。最后經(jīng)過濾兩次，得到的續(xù)濾液就是供試品溶液。

2.4 相色譜儀峰

取2.2的對照品溶液和2.3供試品溶液各5 uL注入液相色譜儀峰形好，能達到很好分離。

2.5 耐用性試驗

我們分別以不同儀器不同品牌色譜柱、柱溫和流速的變化來考察方法的耐用性。

色譜柱采用三個品牌：①Agilent，ZORBAX，SBC18（4.6×250 mm，5 μm）、②Welch UltimateAQ-C18（同規(guī)格）、③Diamonsil C18（同規(guī)格）在三個品牌的液相色譜儀進行了測定，顯示供試品色譜圖主峰分離良好，說明方法具有較好的耐用性，理論板數(shù)暫定為不得低于3000。

3 系統(tǒng)適用性試驗

3.1 提取方法考察

為得到的更好的提取效果，本文對牛黃解毒片加熱回流和超聲震蕩分別處理60 min的結(jié)果進行了考察，結(jié)果顯示前者的提取效果更佳，主峰面積更大，雜質(zhì)峰較少。因此確定其為供試品提取方法。

3.2 檢測波長的確定

取大黃素對照品溶液，在250 nm～300 nm的吸收情況進行測定，顯示其在254.3 nm時吸收峰最強，故而取254 nm。

3.3 流動相的確定

經(jīng)對比考察85：15的甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液兩種的測定效果，結(jié)果以甲醇-0.1%磷酸溶液（85：15）為流動相時的效果較好，干擾性小，色譜峰保留時間適宜。

4 方法學驗證

4.1 線性

結(jié)果顯示大黃素在0.11597～1.12547 mg，線性關(guān)系達到標準。

4.2 精密度

取同一供試品，依正文方法獨立測定6份，數(shù)據(jù)顯示本法重復良好。見表1。

表1 重復性試驗結(jié)果（%）

4.4 準確度試驗：

取同一供樣品6份1 g，分別加入大黃素對照品適量，按正文方法進行測定，計算回收率。結(jié)果中表明，本方法中大黃素的回收率平均值為99.7%（RSD=0.3%）該方法適合于供樣品中大黃素的含量測定。見表2。

表2 加樣回收試驗結(jié)果（%）

樣品中含量測定

4.5 穩(wěn)定性考察：

取10 μL供試品溶液，在放置0，4，10，14，16，24 h進樣，計算峰面積的RSD值。結(jié)果表明其在24h內(nèi)穩(wěn)定。

5 討 論

大黃是牛黃解毒片的主要成分之一。做好大黃的質(zhì)量控制，對于保障牛黃解毒片的功效有重要意義。我們建立了HPLC法測定牛黃解毒片中大黃素含量的方法，經(jīng)對提樣方法、流動相及檢測波長都進行了考察比較，按正文條件進行測定，提取完全，干擾小，含量高，方法相對簡便。