電噴霧-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行質(zhì)譜法分析津新烏鯽中的一種二肽

楊建新 金華 朱振秀 俞麗 高永平 金萬(wàn)昆 田穎剛

摘?要：津新烏鯽（Carassiusauratus var.Jinxin Black）是具有較高營(yíng)養(yǎng)和食用價(jià)值的鯽魚新品種，為分析其肌肉中的小肽及其結(jié)構(gòu)，建立了電噴霧-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行質(zhì)譜分析津新烏鯽中的一種二肽Tyr-Ser的方法，優(yōu)化了津新烏鯽提取物的色譜分離條件。采用Agilent Zorbax Rx-C8柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（V∶V=2∶98），0.8 mL/min等度洗脫，采用ESI-QTOF對(duì)其中一種二肽進(jìn)行鑒定，證實(shí)二肽為Tyr-Ser。

關(guān)鍵詞：津新烏鯽（Carassiusauratus var.Jinxin Black）;高效液相;電噴霧質(zhì)譜;二肽

在現(xiàn)代科學(xué)研究中，質(zhì)譜分析技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用和發(fā)展，在蛋白質(zhì)組學(xué)和多肽的研究中，質(zhì)譜分析已成為鑒定蛋白質(zhì)和多肽類的重要手段[1]。目前在分析中常用的有基質(zhì)輔助解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜法（MALDI-TOF）、電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（ESI-MS/MS）和離子阱質(zhì)譜法（IT-MS）[2]。ESI-QTOF是在電噴霧質(zhì)譜儀的基礎(chǔ)上，采用雙重四級(jí)桿與飛行時(shí)間質(zhì)量分析器串聯(lián)，具有較好的分辨率和靈敏度[3]。ESI-TOF-MS不僅可以在離子傳輸區(qū)域進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，還可以在源后衰變時(shí)提供分子的結(jié)構(gòu)信息。因此，TOF-MS與ESI-MS聯(lián)用技術(shù)在生物大分子研究中具有廣闊的前景。TOF-MS技術(shù)在蛋白質(zhì)及其多肽的研究中具有可鑒定蛋白質(zhì)功能﹑研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用﹑比較蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異﹑研究蛋白磷酸化和糖基化等功能[4-6]。

津新烏鯽（Carassiusauratus var.Jinxin Black）是天津市換新水產(chǎn)良種場(chǎng)以白化紅鯽（Carassius auratus，white type）和墨龍鯉（Cyprinus carpio var. Molong）為原始育種親本，通過(guò)雜交育種技術(shù)育成的國(guó)內(nèi)首個(gè)集觀賞與食用為一體的全黑體色鯽魚新品種（登記號(hào)：GS-02-002-2013）[7]。已有研究證明津新烏鯽魚體中含有較高含量的多不飽和脂肪酸;魚體中的氨基酸總量和必需氨基酸含量明顯高于鰱（Hypophthalmichthys molitrix）、草魚（Ctenopharyngodon idella）、鯉（Cyprinus carpio）和鯽（Carassius auratus auratu）等常見(jiàn)養(yǎng)殖魚類。這說(shuō)明津新烏鯽是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)和食用價(jià)值的優(yōu)良養(yǎng)殖品種[8]。本實(shí)驗(yàn)采用了液相分離和電噴霧-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行質(zhì)譜分析法，對(duì)津新烏鯽提取物中的小肽進(jìn)行了分析鑒定，方法簡(jiǎn)便、快速，所建立的方法對(duì)于津新烏鯽提取物的分析和結(jié)構(gòu)鑒定具有重要意義。

1?材料與方法

1.1?樣品制備

試驗(yàn)材料為津新烏鯽，取自天津市換新水產(chǎn)良種場(chǎng)，體重900～1 200 g。稱取津新烏鯽18尾，放血處死，去魚鱗、內(nèi)臟、魚頭，洗凈，用組織搗碎機(jī)絞碎，準(zhǔn)確稱取津新烏鯽的肉泥2 g，加入約6 mL的提取液（5%乙腈-95%甲酸溶液（0.1%甲酸）），置于離心管中于室溫下超聲萃取1 h（頻率：40 kHz，功率：50 W），10 000 r/min離心10 min，收取上清液。取3 mL上清液加入體積分?jǐn)?shù)2%三氟乙酸，10 000 r/min離心5 min。取上清液200 μL，用色譜級(jí)的超純水稀釋至約1.5 mL，稀釋后的液體用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，濾液置于4 ℃保存。實(shí)驗(yàn)做三組平行樣。

1.2?儀器與試劑

安捷倫1290系列高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司，南昌大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái)），6538UHD三重四級(jí)桿飛行質(zhì)譜儀（美國(guó)安捷倫公司，南昌大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室公共實(shí)驗(yàn)平臺(tái)），安捷倫色譜柱Agilent Zorbax Rx-C8（4.6 mm×250 mm，5 μm），Milli-Q超純水處理系統(tǒng)（美國(guó) MLlipore公司），XB電子分析天平（Precise瑞士），AnkeTGL-16C;離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），KQ3200E超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）。

乙腈（HPLC，美國(guó)新天地），三氟乙酸（HPLC，阿拉?。?，甲酸（AR，國(guó)藥），有機(jī)濾頭（0.22 μm）。水為HPLC級(jí)的超純水。

1.3?液相及質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Rx-C8（4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相：2%乙腈-98%甲酸溶液（甲酸0.1%），0.8 mL/mL等度洗脫，DAD進(jìn)行190～400 nm掃描。

質(zhì)譜分析條件：

離子源：ESI源;離子模式：正離子;干燥氣溫度：350 ℃;干燥氣流速：10 L/min;霧化氣壓力：40 psi;掃描范圍：m/z 50～1 000;毛細(xì)管出口電壓：80～150 V;錐孔電壓：50 V;二級(jí)MS碰撞能10～40 V。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Agilent Mass Hunter Workstation軟件處理。

1.4?分析方法

采用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相，對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)的乙腈進(jìn)行了篩選。分別采用20%乙腈-80%甲酸溶液、10%乙腈-90%甲酸溶液、5%乙腈-95%甲酸溶液、2%乙腈-98%甲酸溶液等進(jìn)行流動(dòng)相的選擇。

選擇合適的流動(dòng)相后，采用電噴霧-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行質(zhì)譜，首先用TOF-MS模式進(jìn)行全掃描分析，通過(guò)改變毛細(xì)管出口電壓80～150 V，得到二肽的[M+H]+或[M+2H]2+準(zhǔn)分子離子峰后，再利用正離子離子掃描模式對(duì)[M+H]+進(jìn)行MS/MS分析[9]。二級(jí)MS碰撞能10～35 V。

2?結(jié)果與討論

2.1?液相洗脫條件選擇、優(yōu)化結(jié)果

應(yīng)用RP-HPLC分離蛋白質(zhì)和肽，通常在流動(dòng)相中加入酸性抑制劑，以調(diào)節(jié)流動(dòng)性的pH值，改善峰的峰形和分離度。本實(shí)驗(yàn)加入0.1%甲酸，有利于分離，且在電噴霧質(zhì)譜中可以優(yōu)化電離。在0.1%甲酸的條件下進(jìn)行等度洗脫，比較了乙腈體積分?jǐn)?shù)分別為20%、10%、5%及2%的分離情況（見(jiàn)圖1）。結(jié)果表明，采用20%和10%乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，各個(gè)峰不能得到很好的分離（見(jiàn)圖1a、b），以5%乙腈作為流動(dòng)相時(shí)，各個(gè)峰基本實(shí)現(xiàn)分離，但是各個(gè)峰分布較為緊密，不利于電噴霧質(zhì)譜上對(duì)峰進(jìn)行鑒定與分析（見(jiàn)圖1c），而用2%乙腈洗脫時(shí)，各組分能實(shí)現(xiàn)很好的分離，且保留時(shí)間適中（見(jiàn)圖1d），可用于電噴霧質(zhì)譜上對(duì)各個(gè)峰進(jìn)行分析與歸屬。

2.2?色譜峰的歸屬結(jié)果

津新烏鯽樣品質(zhì)譜的總離子流圖及高效液相的色譜圖見(jiàn)圖2。利用電噴霧—串聯(lián)四級(jí)桿—飛行質(zhì)譜對(duì)液相分離的組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，在正離子模式下，由圖3可知二肽的準(zhǔn)分子離子峰為m/z 269.088 2，[M+H]+，即二肽的分子量M為268.080 4，m/z 291.069 9是[M+Na]+，m/z 559.150 3為[2M+Na]+，其中m/z 137.045 8為[Tyr-COOH+H]+，m/z 269.088 2與m/z 137.045 8之差132.042 4為Ser氨基脫氫連接肽鍵的部分加上一個(gè)H+。為進(jìn)一步確定結(jié)構(gòu)，再利用正離子離子掃描模式對(duì)[M+H]+進(jìn)行MS/MS分析。

通過(guò)調(diào)節(jié)二級(jí)MS碰撞能10～40 V，對(duì)m/z 269.087 7和m/z 137.045 8進(jìn)行分析，獲得一系列MS/MS圖，分析可知其中m/z 137.045為[Tyr-COOH+H]+，列舉其中圖4，其中m/z 94.039 7為[C6H5O+H]+，為二肽中Tyr部分中苯羥基斷裂后加H+，m/z 110.034 8為[C7H7+H2O+H]+，為Tyr中烷基苯加水加H+，m/z 119.036 3為[C8H8N+H]+，即為Tyr部分失去-COOH后脫一分子水后加H+，[Tyr-COOH-H2O+H]+。

對(duì)m/z 269.087 5進(jìn)行二級(jí)MS分析，列舉如圖5，分析可知m/z 60.044 9為[C2H5NO+H]+，即為二肽肽鍵中間斷裂，Ser部分再失去-COOH后加H+，即[Ser-COOH-H+H]+，m/z 94.041 5為 [C6H5O+H]+，m/z 137.045 8為[Tyr-COOH+H]+。對(duì)一系列由二級(jí)MS碰撞能10～40 V獲得的MS/MS片段見(jiàn)表1。

通過(guò)ESI-QTOF對(duì)津新烏鯽中的二肽分析為Tyr-Ser，分子式為C12H16O5N2，分子量為268.105 5，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖6。

2.3?討論

本研究中采用反相色譜法對(duì)津新烏鯽肌肉中的小肽進(jìn)行了分離，并采用ESI-QTOF質(zhì)譜對(duì)津新烏鯽中二肽進(jìn)行了一級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定及MS/MS分析，通過(guò)改變毛細(xì)管出口電壓，得到二肽準(zhǔn)分子離子峰后，再選擇適當(dāng)?shù)亩?jí)碰撞能量，利用正離子離子掃描模式對(duì)二肽進(jìn)行MS/MS分析，進(jìn)而確定了其結(jié)構(gòu)。目前，在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域研究中，質(zhì)譜已成為鑒定蛋白質(zhì)及多肽的最重要技術(shù)平臺(tái)之一。韓超等采用ESI-TOF/MS分析了太子參中的環(huán)肽類化合物，通過(guò)電噴霧-飛行時(shí)間質(zhì)譜獲得了化合物的準(zhǔn)確分子量信息，并對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定[10]。周紅華等應(yīng)用ESI-MS及源內(nèi)碰撞誘導(dǎo)解離技術(shù)對(duì)肽類藥物曲普瑞林及促黃體素釋放激素類似物進(jìn)行測(cè)定，確證了其氨基酸序列和分子量以及寡肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)[11]。陳瑤函等對(duì)質(zhì)譜軟電離技術(shù)在完整糖肽分析中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，通過(guò)MALDI-MS/MS和ESI-MS/MS對(duì)目標(biāo)糖蛋白進(jìn)行分析，獲得了糖肽的糖鏈結(jié)構(gòu)信息[12]。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電噴霧-飛行時(shí)間質(zhì)譜為多肽類化合物分子量及一級(jí)結(jié)構(gòu)的確證，提供一種高效準(zhǔn)確、靈敏快速的手段。

已有研究證明津新烏鯽中含有較高含量的多不飽和脂肪酸，并且津新烏鯽中的氨基酸總量和必需氨基酸含量明顯高于鰱、草魚、鯉和鯽等常見(jiàn)養(yǎng)殖魚類，證實(shí)津新烏鯽是一種具有較高食用價(jià)值和保健作用的優(yōu)良養(yǎng)殖品種，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景[8]。本次實(shí)驗(yàn)首次對(duì)津新烏鯽中的小肽進(jìn)行了液相分離和電噴霧-串聯(lián)四級(jí)桿-飛行質(zhì)譜分析，證實(shí)了小肽結(jié)構(gòu)為Tyr-Ser。韓國(guó)專利表明Tyr-Ser是一種具有美白功能的二肽，其分子量較小，對(duì)細(xì)胞的通透性較好，在化妝品產(chǎn)品中具有開(kāi)發(fā)前景[13]。本次研究將為津新烏鯽的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及商品開(kāi)發(fā)價(jià)值提供理論基礎(chǔ)。

致謝：本實(shí)驗(yàn)得到南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙溪雁、牛俊卿、廖春艷同學(xué)的大力幫助，特此致謝！

參考文獻(xiàn)：

[1] 張曉楠.質(zhì)譜在多肽氨基酸序列分析中的應(yīng)用[J].河北化工，2005（6）：69-70.

[2] Shevchenko A，Jensen O N，Podtelejnikov A V，et al.Linking genome and proteome by mass spectrometry：Large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels[J].Proc Natl Acad Sci，USA，1996a，93（25）：14440-14445.

[3] 王英武，王玲，顧景凱，等.電噴霧—串聯(lián)四級(jí)桿—飛行時(shí)間質(zhì)譜法分析寡肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)[J].分析化學(xué)，2003，31（6）：709-712.

[4] 王曉娜，許麗娜，彭金詠，等.現(xiàn)代生物質(zhì)譜技術(shù)在生物大分子分析研究中的應(yīng)用[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2008，25（2）：105-109.

[5] 杜曉寧，宋明鳴.多肽類物質(zhì)分析檢測(cè)方法的研究進(jìn)展[J].上?；?，2009，34（11）：6-11.

[6] 王小平，容蓉，田景振.多肽類藥物分析方法的研究進(jìn)展[J].食品與藥品，2009，11（9）：55-58.

[7] 金萬(wàn)昆，高永平，俞麗，等.紅鯽♀×烏龍?chǎng)aF2（4 n）♂回交F1的倍性及黑體色表現(xiàn)的觀察[J].淡水漁業(yè)，2012，42（2）：88-92.

[8] 金萬(wàn)昆，楊建新，杜婷，等.烏龍?chǎng)a的肌肉營(yíng)養(yǎng)成分、氨基酸含量及脂肪酸組成分析[J].河北漁業(yè)，2009，191（11）：12-14.

[9] 蔣菁莉，徐彥軍，婁飛，等.反相高效液相色譜—電噴霧質(zhì)譜法分析食源血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽[J].分析化學(xué)，2007，35（3）：427-430.

[10] 韓超，陳軍輝，劉劼，等.高效液相色譜/電噴霧飛行時(shí)間質(zhì)譜分析太子參中環(huán)肽類化合物[J].分析化學(xué)，2006，34（12）：1719-1722.

[11] 周紅華，馬仁玲，嚴(yán)立勇，等.電噴霧質(zhì)譜法（ESI-MS）分析兩種寡肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)[J].藥物分析雜志，2006，26（3）：374-376.

[12] 陳瑤函，晏國(guó)全，周新文，等.基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜和電噴霧電離質(zhì)譜在辣根過(guò)氧化物酶糖肽結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用[J].色譜，2010，28（2）：135-139.

[13] Park So-Hee，Lee Hyun-Kyung，Choi Hye-Ryung.Skin-whitening composition containing dipeptide[P].WO 2011126163，2011-10-13.

（收稿日期：2020-07-20;修回日期：2020-08-23）