電針對(duì)APP/PS1小鼠皮質(zhì)區(qū)磷脂酰肌醇-3激酶/糖原合成酶激酶-3α通路相關(guān)蛋白表達(dá)和老年斑沉積的影響

伍艷君 ，鄔開(kāi)會(huì)，劉茜，王依瀅，邱國(guó)平，徐進(jìn)，盛華均，朱淑娟

1.重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶醫(yī)科大學(xué)人體解剖學(xué)教研室，重慶市 400016；2.重慶市南川區(qū)人民醫(yī)院，重慶市408400

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是最常見(jiàn)的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，慢性進(jìn)行性加重，主要病理特點(diǎn)包括由β 淀粉樣蛋白肽(Amyloid beta peptide,Aβ)沉積形成的細(xì)胞外老年斑、過(guò)度磷酸化的Tau 蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)，以及大量神經(jīng)元丟失[1]。淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說(shuō)認(rèn)為，Aβ 沉積是多因素發(fā)病機(jī)制中的初始事件，可引發(fā)一系列導(dǎo)致癡呆的事件[2?3]。AD 的發(fā)生發(fā)展也與大腦葡萄糖利用和能量代謝損傷有關(guān)[4?6]。因AD 有胰島素生成減少和胰島素受體抵抗現(xiàn)象，也被稱為“3 型糖尿病”[7?9]。在胰島素抵抗機(jī)制中，磷脂酰肌醇?3 激酶(phosphatidylinositol?3 kinase,PI3K)、糖原合成酶激酶?3α(glycogen synthe?sis kinase?3α,GSK3α)作為PI3K/GSK3α 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要蛋白，與Aβ的代謝關(guān)系密切[10?11]。

本研究以AD 模型APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為對(duì)象，觀察電針對(duì)APP/PS1 小鼠皮質(zhì)內(nèi)老年斑和PI3K/GSK3α相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，探討電針對(duì)小鼠皮質(zhì)內(nèi)胰島素信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康同窩3 月齡等體質(zhì)量雄性野生型C57 小鼠6只為對(duì)照組；同月齡等體質(zhì)量健康雄性APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和電針組，每組各6 只，體質(zhì)量24～28 g。小鼠購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2014?004。

小鼠飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級(jí)動(dòng)物房，飼養(yǎng)溫度(22±2)℃，相對(duì)濕度40%～60%，光照和黑暗周期各12 h，自由飲食。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周左右，剪取鼠尾3～5 mm，堿裂解法提取小鼠DNA，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增，檢測(cè)APPswe和PSΔE9基因表達(dá)。瓊脂糖凝膠電泳，拍照并分析結(jié)果，具有APP、PS1 雙陽(yáng)性條帶的樣本來(lái)源于APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，兩條帶均為陰性的樣本來(lái)自野生型C57小鼠。

本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

4G8一抗(SIG?39220?200)：美國(guó)COVANCE公司。GSK3α 一 抗(ab131344)：美國(guó)ABCAM公司。pS21?GSK3α 一 抗(9316S)：美國(guó)CELL SIGNALING 公司。P85α 一抗(AF5112)、P110α 一抗(AF5112)：美國(guó)AFFINITY 公司。GAPDH 一抗(10494?1?AP)：重慶鼎國(guó)生物科技有限責(zé)任公司。HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 抗體(L153A)：重慶萊博斯生物科技有限公司。電針儀：汕頭市醫(yī)用設(shè)備有限公司。電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和凝膠成像儀：美國(guó)伯樂(lè)公司。石蠟切片機(jī)：德國(guó)萊卡公司。PCR 儀：美國(guó)賽默飛公司。無(wú)菌針灸針：北京中研太和醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

鑒定后，電針組0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉，一次性針灸針(直徑0.18 mm、長(zhǎng)25 mm)針刺小鼠百會(huì)(向前斜刺2 mm)和兩側(cè)腎俞(向內(nèi)斜刺4 mm)，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》動(dòng)物穴位圖譜。電針儀一對(duì)正負(fù)極分別接百會(huì)和一側(cè)腎俞，另一對(duì)正負(fù)極接另一側(cè)腎俞和同側(cè)用紗布浸濕的皮膚，電針頻率2 Hz，電流2 mA,每次15 min，每天1 次，7 d 為1個(gè)療程，共計(jì)2個(gè)療程，療程期間休息1 d。電針時(shí)間和操作人員固定。

對(duì)照組和模型組在相同的時(shí)間抓取和麻醉，不針刺。

1.4 標(biāo)本采集

干預(yù)結(jié)束后，小鼠0.3%戊巴比妥鈉30 mg/kg 腹腔注射麻醉，0.9%氯化鈉溶液心尖快速灌注約40 ml。斷頭，完整取出鼠腦，剝離腦組織。一側(cè)皮質(zhì)-80 ℃冰箱凍存，用于Western blotting 檢測(cè)；另一側(cè)4%多聚甲醛固定，石蠟切片，用于免疫組化染色。

1.5 免疫組化染色

鏡下選取組織切片，二甲苯Ⅰ中65 ℃烤箱內(nèi)脫蠟1 h，二甲苯Ⅱ中常溫脫蠟3 min。100%、95%、80%和75%梯度酒精水化各5 min；0.01 mol/L PBS 水洗3次，每次5 min。滴加3%過(guò)氧化物酶，37 ℃水浴孵育15 min。0.01 mol/L PBS 水洗3 次，每次5 min；95 ℃水浴修復(fù)，自然冷卻到室溫。0.01 mol/L PBS 水洗3次，每次5 min，滴加88%甲酸常溫孵育10 min(僅染老年斑需要)。0.01 mol/L PBS 水洗3 次，每次5 min，滴加5% BSA，37 ℃水浴封閉。滴加老年斑(4G8,1∶250)、P85α(1∶200)、P110α(1∶50)、GSK3α(1∶50)和pS21?GSK3α (1∶100)一抗，4 ℃冰箱中過(guò)夜。37 ℃水浴復(fù)溫40 min。0.01 mol/L PBS 水洗4 次，每次5 min；滴加二抗，37 ℃水浴孵育30 min。0.01 mol/L PBS 水洗4 次，每次5 min；滴加SABC 信號(hào)放大劑，37 ℃水浴孵育。0.01 mol/L PBS 水洗4 次，每次5 min。DAB 染色，蘇木素染核(僅染老年斑需要)，鏡下觀察結(jié)果。70%～100%梯度酒精脫水，二甲苯I、Ⅱ透明，各5 min。中性樹(shù)脂封片，常溫晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察皮質(zhì)內(nèi)老年斑、P85α、P110α、GSK3α 和pS21?GSK3α 的分布，并拍照，保持光照強(qiáng)度及放大倍數(shù)一致。隨機(jī)取6 個(gè)區(qū)域，Image J 8.0 圖像分析系統(tǒng)測(cè)量平均積分光密度。

1.6 Western blotting

提取蛋白，加入蛋白裂解液研磨，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，共2次，吸取上清，BCA 法測(cè)蛋白濃度。取總蛋白50 μg 上樣，8% SDS?聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，250 mA 恒流電轉(zhuǎn)至PVDF 膜；5%脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入P85α (1∶1000)、P110α (1∶1000)、GSK3α (1∶1000)和pS21?GSK3α (1∶1000)一抗，4 ℃冰箱敷育過(guò)夜。PBST 洗膜3 次，每次10 min；滴加相應(yīng)二抗(1∶10000)，37 ℃恒溫?fù)u床孵育1 h，PBST 洗膜4 次，每次15 min；ECL 顯色，凝膠成像系統(tǒng)觀察。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算分析蛋白條帶相對(duì)光密度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Image J 8.0、Graphpad Prism 5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，各實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)6 次。計(jì)量資料以()表示，多組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色

對(duì)照組皮質(zhì)區(qū)無(wú)4G8 陽(yáng)性斑塊，模型組和電針組小鼠皮質(zhì)區(qū)均可見(jiàn)4G8 陽(yáng)性斑塊。與模型組相比，電針組4G8 陽(yáng)性斑塊顯著減少(P＜0.001)。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組皮質(zhì)區(qū)老年斑(免疫組化染色，×200)

GSK3α和pS21?GSK3α主要在神經(jīng)元胞質(zhì)表達(dá)。模型組GSK3α 蛋白水平較對(duì)照組和電針組均顯著升高(P＜0.001)；pS21?GSK3α 蛋白水平較對(duì)照組和電針組降低(P＜0.001)。見(jiàn)圖2、圖3、表1。

P85α 和P110α 均存在于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)。模型組P85α 和P110α較對(duì)照組和電針組均明顯降低(P＜0.01)。見(jiàn)圖4、圖5、表1。

2.2 Western blotting

模型組pS21?GSK3α 蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組和電針組(P＜0.01)，GSK3α蛋白表達(dá)高于對(duì)照組和電針組(P＜0.05)；P85α 和P110α 蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組和電針組(P＜0.01)。見(jiàn)圖6、表2。

圖2 各組皮質(zhì)區(qū)GSK3α表達(dá)(免疫組化染色，×200)

圖3 各組皮質(zhì)區(qū)pS21-GSK3α表達(dá)(免疫組化染色，×200)

圖4 各組皮質(zhì)區(qū)P85α表達(dá)(免疫組化染色，×200)

圖5 各組皮質(zhì)區(qū)P110α表達(dá)(免疫組化染色，×200)

表1 免疫組化染色各組皮質(zhì)區(qū)老年斑、GSK3α、pS21-GSK3α、P110α和P85α蛋白水平(IOD/AREA)

表2 Western blotting檢測(cè)各組GSK3α、pS21-GSK3α、P110α、P85α蛋白表達(dá)水平(/GAPDH)

3 討論

腦內(nèi)胰島素既可由外周胰島β 細(xì)胞、胃抑制多肽細(xì)胞等分泌，穿過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也可由腦內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元合成。胰島素與胰島素受體結(jié)合后，激活胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在神經(jīng)調(diào)節(jié)、神經(jīng)內(nèi)分泌和代謝，以及學(xué)習(xí)記憶等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。胰島素受體在大腦皮層、海馬、嗅球、下丘腦等部位廣泛分布，特別是在神經(jīng)元和突觸后[12]。胰島素信號(hào)通路破壞會(huì)使神經(jīng)元出現(xiàn)代謝損傷，與認(rèn)知功能下降關(guān)聯(lián)，逐漸發(fā)展為AD[13]。胰島素信號(hào)通路對(duì)胰島素不敏感時(shí)，出現(xiàn)代償性的高胰島素血癥，即胰島素抵抗。胰島素缺乏或胰島素抵抗與異常的能量代謝密切相關(guān)[4,14?15]。研究表明[16]，腦內(nèi)出現(xiàn)胰島素抵抗是AD 發(fā)生的前兆，胰島素信號(hào)通路紊亂可能參與其發(fā)生機(jī)制，并最終與Aβ 相互影響，形成惡性循環(huán)。APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠在2 月齡時(shí)即可表現(xiàn)出葡萄糖耐量降低，早于AD病理學(xué)和認(rèn)知下降[17?18]。推測(cè)胰島素信號(hào)通路受損可能加速AD病理進(jìn)程[19?20]。

圖6 各組pS21-GSK3α、GSK3α、P110α和P85α蛋白表達(dá)(Western blotting)

PI3K?Akt 信號(hào)通路是胰島素信號(hào)的經(jīng)典通路。PI3K 有4 種亞型，即1A、1B、2 和3。對(duì)胰島素跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)起作用的是1A，它由P85(調(diào)節(jié)亞基)和P110 (催化亞基)兩個(gè)亞基組成。P85 主要與胰島素受體底物結(jié)合，P110通過(guò)磷酸化細(xì)胞膜上的磷脂酰肌醇(phospha?tidylinositol,PI)，使胞內(nèi)合成PIP、PIP2或PIP3，扮演胰島素跨膜信號(hào)傳導(dǎo)第二信使的角色，募集絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine?threonine kinase,Akt，又稱PKB)到細(xì)胞膜并磷酸化，激活并調(diào)節(jié)下游分子。P85 對(duì)P110 的穩(wěn)定、聚集以及對(duì)1A 型PI3K 的激活尤為必需。P85α 作為1A 型PI3K 表達(dá)最多的亞基，是PI3K?Akt 通路激活的始動(dòng)環(huán)節(jié)。AD 患者尸檢發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)P85α 和P110α 水平降低，阻斷胰島素信號(hào)通路，與胰島素抵抗一致[21]。

受損的PI3K?Akt信號(hào)通路失去正常調(diào)節(jié)能力，導(dǎo)致下游激酶分子GSK3 活性失調(diào)。GSK3 有GSK3α 和GSK3β 兩個(gè)亞型，其中GSK3α 與Aβ 的關(guān)系更為密切[22]。在Tg2576 小鼠中，GSK3α 活性增強(qiáng)，上調(diào)γ 分泌酶活性，促進(jìn)Aβ生成，加速老年斑沉積[23]。

針灸是中醫(yī)治療“癡呆”的重要手段，能有效改善AD 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一些病理生理機(jī)制，如抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和興奮性氨基酸的釋放、提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子含量等[24?26]。

研究發(fā)現(xiàn)[27]，針刺治療可有效改善胰島素抵抗，但作用機(jī)制未明。本研究顯示，電針可升高APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)內(nèi)P85α、P110α 和pS21?GSK3α 等蛋白的表達(dá)水平，降低過(guò)度增加的GSK3α蛋白表達(dá)，并減少皮質(zhì)內(nèi)老年斑。我們先前的研究發(fā)現(xiàn)[28]，相同的電針刺激能夠提高APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)、記憶和空間探索能力，并調(diào)節(jié)皮質(zhì)區(qū)β?分泌酶1 (β?se?creting enzyme,BACE1)、胰島素降解酶(insulin?de?grading enzyme,IDE)等的表達(dá)。綜合分析認(rèn)為，電針可通過(guò)調(diào)節(jié)P85α、P110α及下游pS21?GSK3α、GSK3α、BACE1 和IDE 等蛋白的表達(dá)水平，影響Aβ形成，從而改善腦內(nèi)胰島素抵抗、老年斑沉積和認(rèn)知減退。

另外，本研究顯示，GSK3α和pS21?GSK3α蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)，模型組GSK3α 表達(dá)增多而pS21?GSK3α 表達(dá)減少。有研究顯示[29]，激活GSK3 能增強(qiáng)Tau 蛋白磷酸化，而胰島素能通過(guò)PI3K?Akt 信號(hào)通路抑制GSK3，降低Tau 蛋白磷酸化。本研究未涉及電針對(duì)Tau 蛋白磷酸化水平的影響，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，電針能針對(duì)AD 病理生理機(jī)制，發(fā)揮多方位調(diào)節(jié)作用。研究電針多方位調(diào)節(jié)作用的扳機(jī)點(diǎn)，將是以后的重要研究方向之一。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。