白花地膽草和匙羹藤粗提物生物活性初步研究

鐘婷婷，史丹妮，錢小香，黃丹慜，郭霞

（海南省林業(yè)科學(xué)研究院（海南省紅樹林研究院），海南?？?571100）

白花地膽草（Elephantopus tomentosus L.）別名牛舌草（海南），屬菊科地膽草屬草本植物。分布在中國西南和華南地區(qū)，尤其是在海南、廣東等地[1]。白花地膽草具有清熱解毒和消炎利尿等作用，用于治療腹瀉、腹痛、濕瘡等；也可治療感冒、肝炎、扁桃體炎等，能去火、傷暑、涼血、利濕消腫等[2-3]。白花地膽草次生代謝物包括倍半萜內(nèi)酯、三萜、酚類、黃酮、甾醇等?；钚苑矫鎿?jù)報道，白花地膽草除抗腫瘤活性[4]，還對大腸桿菌、枯草芽抱桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯影響[5]。

匙羹藤（Gymnemda sylvestre（Retz.）Schult.）又稱羊角藤、金剛藤，系蘿摩科匙羹藤屬植物[6]。分布在印度、越南及中國云南、廣東、臺灣等地區(qū)。全株可入藥，具有收斂、健胃、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、清熱等作用，其葉性平、味苦，具祛風(fēng)止痛、生肌消腫之功效[7]。主要次生代謝物有皂苷類、萜類、黃酮、多肽、果膠、生物堿等[8-9]。匙羹藤提取物對金黃色葡萄菌、大腸桿菌、變形桿菌以及綠膿桿菌等多種細(xì)菌具有抑菌作用[10-12]。

在農(nóng)用活性方面，未見這兩種藥用植物的報道。為此，開展白花地膽草、匙羹藤粗提物的病蟲活性測試，目的是挖掘具有殺蟲和抑菌的活性物質(zhì)，以便用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試植物：白花地膽草和匙羹藤采自儋州市和慶鎮(zhèn)拱教村周邊。

供試?yán)ハx：斜紋夜蛾（Spodoptera litura F.）從木瓜樹上采集斜紋夜蛾卵塊，置于室內(nèi)生化培養(yǎng)箱控溫25℃±2℃孵化，用野生蓖麻葉飼養(yǎng)，待斜紋夜蛾繁殖第2 代時，分別挑選大小一致的3 齡幼蟲供試；萵苣指管蚜蟲（Dactynotus formosanus Takahashi）采自農(nóng)家菜園萵苣上的蚜蟲。

供試菌種：香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、水稻紋枯病菌（Thanatephorus cucumeris）、椰子灰斑病菌（Pestalotia palmarum）香蕉枯萎病菌（Fusarium axysporum）、 芒 果 蒂 腐 病 菌（BatryodiplodiaTheobromae）。以上病原菌由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 白花地膽草、匙羹藤粗提物的制備

將采集的白花地膽草和匙羹藤置于室內(nèi)，陰干，粉碎，過40 目篩。然后用甲醇浸提3 次，每次浸提的時間分別為3d、2d、1d。合并濾液，減壓濃縮，得白花地膽草浸膏和匙羹藤浸膏，置于4℃下備用。

1.2.2 白花地膽草、匙羹藤粗提物的殺蟲活性測定

采用浸漬法[8]測定白花地膽草粗提物和匙羹藤粗提物對斜紋夜蛾3 齡幼蟲的觸殺活性。分別稱取0.1g 白花地膽草粗提物和匙羹藤粗提物，放入燒杯中；用少量丙酮將其濃度配制成質(zhì)量濃度為10mg/mL 的溶液，以印楝素稀釋1500 倍（10mg/mL）為藥劑對照，清水為空白對照。選取20 頭3 齡斜紋夜蛾幼蟲，放于紗網(wǎng)中，浸入藥液泡5s；取出后用吸水紙吸取多余藥液，放于培養(yǎng)皿中，用新鮮的蓖麻葉正常飼養(yǎng)。每處理3 次重復(fù)。分別于12h、24h、48h、72h 記錄斜紋夜蛾3 齡幼蟲的死亡情況，按下列公式計算試蟲死亡率。

采用相同方法測定白花地膽草和匙羹藤粗提物對萵苣指管蚜蟲的觸殺活性。于12h、24h、48h 記錄萵苣指管蚜蟲的死亡情況，按下列公式計算試蟲死亡率或校正死亡率。

死亡率（%）=（試蟲總數(shù)-藥后活蟲數(shù)）/試蟲總數(shù)×100

校正死亡率（%）=（處理組死亡率-對照組死亡率）/（1-對照組死亡率）×100

1.2.3 白花地膽草、匙羹藤粗提物的抑菌活性測定

采用生長速率法測定粗提物的抑菌活性。用少量丙酮和無菌水將白花地膽草和匙羹藤粗提物配制成100mg/mL 的母液。移取2mL 母液加入到融化的18mL 無菌PDA 培養(yǎng)基中，搖勻、迅速分裝于3 個6cm培養(yǎng)皿內(nèi)，冷卻備用，此時，母液被稀釋10 倍，有效濃度為10mg/mL。以苦參堿稀釋800 倍為藥劑對照，以少量丙酮和無菌水作為空白對照。用5mm 打孔器取靶標(biāo)菌的菌餅，倒置接入到培養(yǎng)基上，28℃±2℃培養(yǎng)2d～5d，十字交叉法測量菌落直徑，按下列公式統(tǒng)計抑菌率。

菌落直徑（mm）=菌落平均直徑-5.0

菌絲生長抑制率（%）=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）／對照組菌落直徑×100

1.2.4 白花地膽草粗提物對供試病原菌的毒力測定

將100mg/mL 白花地膽草粗提物母液梯度稀釋，配 置 成 質(zhì) 量 濃 度 為50mg/mL、25mg/mL、10mg/mL、5mg/mL 的溶液，移取2mL 母液加入到融化的18mL無菌PDA 培養(yǎng)基中，濃度倍稀釋10 倍后，最終濃度為10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL。采用生長速率法測試同上。

1.3 統(tǒng)計分析

獲得數(shù)據(jù)采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行分析，比較各結(jié)果的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 白花地膽草、匙羹藤粗提物對斜紋夜蛾的觸殺活性結(jié)果

采用浸漬法測定粗提物對斜紋夜蛾3 齡幼蟲的觸殺活性，結(jié)果如下：

由表1 可知，在10mg/mL 質(zhì)量濃度下，不同時間段，白花地膽草和匙羹藤粗提物對斜紋夜蛾3 齡幼蟲的殺蟲活性不理想，其死亡率跟對照組的死亡率差異不顯著，跟印楝素的死亡率相比差異極其顯著。印楝素為公認(rèn)植物源殺蟲劑，具有顯著的殺蟲活性，這2 種粗提物的活性明顯低于印楝素。

表1 不同時間粗提物對斜紋夜蛾的觸殺活性（%）Tab.1 Contact activity of crude extracts at different time to Spodoptera litura (%)

2.2 白花地膽草、匙羹藤粗提物對萵苣指管蚜蟲的觸殺活性結(jié)果

采用浸漬法測定粗提物對萵苣指管蚜蟲的觸殺活性，不同時間段統(tǒng)計結(jié)果見表2：

表2 不同時間粗提物對萵苣指管蚜蟲的觸殺活性（%）Tab.2 Contact activity of crude extracts at different time to Dactynotus formosanus（%）

由表2 可知，在10mg/mL 質(zhì)量濃度下，白花地膽草和匙羹藤粗提物均對萵苣指管蚜蟲表現(xiàn)出較好的觸殺活性。隨著時間的延長，萵苣指管蚜蟲的死亡率逐漸升高，受藥48h 后，白花地膽草粗提物處理萵苣指管蚜蟲死亡率達(dá)到70.0%；匙羹藤粗提物處理萵苣指管蚜蟲死亡率達(dá)到62.50%。不同提取物之間比較發(fā)現(xiàn)，白花地膽草與匙羹藤的觸殺力差異不顯著，但二者與印楝素藥劑對照相比，差異顯著，且觸殺力低于標(biāo)準(zhǔn)藥劑。

2.3 白花地膽草、匙羹藤粗提物抑菌活性測定結(jié)果

為進(jìn)一步了解粗提物的抑菌活性，測試了2 種粗提物對5 種病原靶標(biāo)菌的抑菌活性，結(jié)果見表3。

在10mg/mL 質(zhì)量濃度下，白花地膽草粗提物對供試菌種的抑菌活性顯著，對供試菌種的抑制率均在50.00%以上，其中對香蕉炭疽菌的抑制率最高，達(dá)到75.33%。對各供試菌種的抑制率從高到低依次是香蕉炭疽菌＞芒果蒂腐菌＞水稻紋枯菌＞椰子灰斑菌＞香蕉枯萎菌。且該粗提物抑菌效果明顯高于對照，差異極顯著；匙羹藤粗提物對供試菌種也有較好的抑制作用，抑菌率均高于對照藥劑，但明顯低于白花地膽草粗提物。

2.4 白花地膽草粗提物的毒力

從表3 得知，白花地膽草對靶標(biāo)菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性，為了進(jìn)一步測試該粗提物對靶標(biāo)菌的毒 力，在 質(zhì) 量 濃 度10mg/mL、5mg/mL、2.5mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL 下，白花地膽草對供試菌種的毒力結(jié)果見表4。根據(jù)毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)較好，說明方程具有一定可信度。方程斜率為正數(shù)，表明隨著濃度增加，白花地膽草粗提物對供試菌種的抑制率也逐漸增強(qiáng)。對香蕉炭疽菌、水稻紋枯菌、椰子灰斑菌、芒果蒂腐菌、香蕉枯萎菌的EC50分別是：1.3437mg/mL、4.1812mg/mL、8.2398mg/mL、9.4578mg/mL、16.7976mg/mL。表明，香蕉炭疽菌對白花地膽草粗提物最敏感，該結(jié)果與表3 結(jié)果一致，同時表明，該粗提物在香蕉炭疽菌的防治中可能有較好的應(yīng)用前景。

表4 白花地膽草對5 種病原菌的毒力測定結(jié)果Tab.4 Determination results of the virulence of Elephantopus tomentosus L.to 5 pathogens

3 討論

初步研究了白花地膽草和匙羹藤粗提物對斜紋夜蛾和萵苣指管蚜蟲的殺蟲活性以及對供試菌種的抑制活性。對斜紋夜蛾3 齡幼蟲觸殺活性不理想，對萵苣指管蚜蟲具有較好的觸殺活性。對靶標(biāo)菌有較好的抑菌效果，特別是對香蕉炭疽病菌抑菌活性顯著。

由于僅測試了對斜紋夜蛾和萵苣指管蚜蟲的觸殺活性，該粗提物是否具有拒食活性或者驅(qū)避活性，目前還未證實(shí)。未測試濃度效應(yīng)對萵苣指管蚜蟲的殺蟲活性。未涉及各濃度對供試菌種的菌絲形態(tài)、孢子形態(tài)、產(chǎn)孢量的影響。粗提物中有許多次生代謝物，究竟是哪種物質(zhì)發(fā)揮抑菌活性，目前還不清楚，下一步將利用香蕉炭疽病菌為測試靶標(biāo)，采用活性追蹤方法，分離白花地膽草中的抑菌活性物質(zhì)，為研究開發(fā)植物源殺菌劑做鋪墊。