將DNA損傷修復(fù)實驗引入細胞生物學(xué)實驗教學(xué)初試

雷曹琦，謝志雄，李小燕

（武漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072）

實驗教學(xué)是細胞生物學(xué)課程體系的重要組成部分，是對細胞生物學(xué)理論課程的重要支撐，有助于學(xué)生掌握理論基礎(chǔ)知識，訓(xùn)練探索科學(xué)的方法，激發(fā)學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)手腦并用能力及實事求是的科學(xué)作風(fēng)和嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)態(tài)度。因此，不斷改進實驗教學(xué)方法和教學(xué)內(nèi)容，是相關(guān)課程實驗教學(xué)教師應(yīng)長期關(guān)注和探討的課題。

進入21世紀(jì)以來，生命科學(xué)取得了巨大進步和迅速發(fā)展，已經(jīng)成為自然科學(xué)的前沿學(xué)科。大量研究成果的出現(xiàn)及相關(guān)知識和信息的井噴式增長，不斷地革新著我們對生命的理解和認(rèn)識[1-4]。這些不斷出現(xiàn)的新成果和新知識，不僅為生物學(xué)教學(xué)工作注入源源不斷的素材，也是對教學(xué)工作者的挑戰(zhàn)，只有及時更新和完善教學(xué)內(nèi)容和教學(xué)方法，才能使教學(xué)工作跟上生命科學(xué)發(fā)展的步伐[5-7]。

為了跟蹤生命科學(xué)研究前沿，將當(dāng)前生命科學(xué)研究熱點引入課堂，將大大提升學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性。筆者在細胞生物學(xué)實驗教學(xué)內(nèi)容中引入“DNA損傷修復(fù)實驗”，取得了良好的教學(xué)成果。

1 將科學(xué)研究熱點與一流教學(xué)平臺結(jié)合

DNA損傷修復(fù)是細胞內(nèi)DNA分子在受到外源或內(nèi)源損傷后，在多種蛋白共同作用下自我修復(fù)從而恢復(fù)結(jié)構(gòu)的過程。DNA損傷修復(fù)研究對研究基因組不穩(wěn)定性及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義，其中關(guān)鍵信號分子的靶向小分子藥物研究，對于腫瘤治療具有極其重要的臨床意義。例如，在臨床中運用PARP1抑制劑來抑制PARP1介導(dǎo)的DNA修復(fù)，對于腫瘤尤其是BRCA1/2基因突變引起的腫瘤，具有極好的治療效果，已在臨床上廣泛使用[8-9]。由于DNA損傷修復(fù)研究在腫瘤研究和腫瘤治療過程中具有重要作用，已成為各國重點投入的熱點研究學(xué)科。2015年度諾貝爾化學(xué)獎授予托馬斯·林道爾（Tomas Lindahl）、保羅·莫德里奇（Paul Modrich）和阿奇茲·桑卡（Aziz Sancar），就是表彰他們在 DNA修復(fù)機制方面的研究貢獻。將DNA損傷修復(fù)研究引入細胞生物學(xué)實驗教學(xué)，能夠使學(xué)生切身體會和感受生命科學(xué)研究的前沿科學(xué)問題，激發(fā)他們探究生命奧秘的信心。

我校生物學(xué)實驗教學(xué)中心是我國首批建設(shè)的國家級實驗教學(xué)示范中心，擁有一流的實驗教學(xué)設(shè)備和實驗教學(xué)隊伍。在多年的教學(xué)過程中，中心改變了實驗教學(xué)依附于理論課教學(xué)的模式，全面整合教學(xué)內(nèi)容，強化基本實驗技能訓(xùn)練，以能力培養(yǎng)為主線，重點培養(yǎng)學(xué)生的科學(xué)研究能力和科學(xué)思維能力，以及良好的科學(xué)研究素養(yǎng)。中心目前已建成多個綜合型實驗教學(xué)實驗室，實驗設(shè)備先進、功能齊全，除了完成基本教學(xué)任務(wù)外，已經(jīng)具備供學(xué)生進行系統(tǒng)性科學(xué)實驗探索的能力，是本項實驗教學(xué)改革工作的堅實保障。

2 教學(xué)改革目標(biāo)

（1）培養(yǎng)學(xué)生提出問題和解決問題的能力。鑒于本項實驗教學(xué)所提出的問題是開放性的，在課程前期主要是讓學(xué)生按照教師提出的實驗方法學(xué)習(xí) DNA損傷修復(fù)研究的主要手段。在學(xué)生理解相關(guān)的基本原理并掌握主要研究方法之后，重點引導(dǎo)學(xué)生自己尋找課題，解決關(guān)于 DNA損傷修復(fù)方面的科學(xué)問題。這一學(xué)習(xí)過程有助于培養(yǎng)學(xué)生提出科學(xué)問題并用所學(xué)知識加以解決的能力。

（2）在教學(xué)中添加研究元素。原有的細胞生物學(xué)實驗教學(xué)主要是使學(xué)生了解和掌握一些經(jīng)典的實驗技術(shù)和手段，每個實驗都相對獨立。本項實驗教學(xué)則使學(xué)生在掌握 DNA損傷修復(fù)經(jīng)典研究技術(shù)的基礎(chǔ)上，能夠解決一個自己感興趣的科學(xué)問題。使學(xué)生由被動接受知識變?yōu)橹鲃咏鉀Q問題，提高學(xué)生的學(xué)習(xí)主動性和積極性。

（3）引入細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)教學(xué)內(nèi)容。目前，細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究是生命科學(xué)研究的熱點，而原有實驗教學(xué)基本不包括細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的實驗。本項實驗教學(xué)將使學(xué)生直觀感受細胞在受到損傷信號后所發(fā)生的變化，并檢測DNA修復(fù)蛋白在DNA損傷位點的遷移及所形成的foci結(jié)構(gòu)。

3 實驗設(shè)計

3.1 實驗原理

DNA損傷修復(fù)是指生物細胞內(nèi)的DNA分子受到內(nèi)源或者外源損傷后結(jié)構(gòu)的恢復(fù)現(xiàn)象，是機體細胞內(nèi)的多種酶和信號分子共同作用的結(jié)果。當(dāng) DNA發(fā)生損傷時，組蛋白H2Ax的Ser139位點會被磷酸化修飾，并且會將DNA修復(fù)蛋白招募到細胞核內(nèi)DNA的損傷位點，從而對DNA損傷進行修復(fù)。DNA損傷有多種形式，其中最為嚴(yán)重的一種是 DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break, DSB）。DSB發(fā)生后，細胞需要快速采取措施停止或推遲細胞分裂，為 DNA修復(fù)提供足夠時間。真核細胞主要通過兩種途徑修復(fù)DSB：同源重組（homologues recombination，HR）和非同源末端鏈接（nonhomologues end joining，NHEJ）。其中，修復(fù)蛋白53BP1能夠在DNA損傷發(fā)生后被快速招募到DNA損傷位點，從而介導(dǎo)NHEJ修復(fù)過程。DNA損傷誘導(dǎo)53BP1的招募，可以通過熒光顯微鏡進行觀察，從而檢測DNA損傷修復(fù)過程的發(fā)生[10-12]。

3.2 實驗材料準(zhǔn)備

HeLa細胞，2 cm細胞培養(yǎng)皿，1.5 cm細胞爬片，DMEM培養(yǎng)基，PBS，青霉素和鏈霉素，DAPI染料，熒光顯微鏡，載玻片，喜樹堿（CPT），抗體，抗癌類藥物或者小分子化合物。所需實驗材料由學(xué)生決定，實驗教學(xué)中心幫助解決。

3.3 實驗步驟

（1）準(zhǔn)備細胞（HeLa cell），每個小組 2位同學(xué)，準(zhǔn)備3皿細胞（提前一天種細胞爬片，由教師負(fù)責(zé)）；

（2）DNA損傷修復(fù)實驗原理和研究前沿介紹（在普通實驗室完成）；

（3）在細胞無菌操作室將 CPT或各自準(zhǔn)備的化合物按照各組自行設(shè)計的方案加入細胞中；

（4）將細胞培養(yǎng)皿交給教師，放置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h；（5）細胞培養(yǎng)皿用1 mL的PBS洗3次，2 min/次；（6）將0.3mL、4%的甲醛（用磷酸鹽緩沖液PBS配置而成），室溫孵育10 min；

（7）用1 mL的PBS洗3次，2 min/次；

（8）用0.1%的Triton X-100（用PBS配置而成）在室溫孵育5 min，300 μL/片（注意滴加在蓋玻片上，下同）；

（9）用1 mL的PBS洗3次，2 min/次；

（10）用馬血清（用細胞培養(yǎng)緩沖液PBST配置而成）在室溫孵育15 min，300 μL/片；

（11）一抗抗體1∶500稀釋（用PBST配置而成），200 μL/片，室溫孵育 1 h；

（12）用1 mL的PBS洗3次，2 min/次；

（13）二抗抗體1∶100稀釋（用PBST配置而成），200 μL/片，室溫孵育40 min（此步驟及以后步驟均需要遮光處理）；

（14）用1 mL的PBST洗3次，1 min/次；

（15）將 50% DAPI 溶液（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole)+ 50% 抗熒光淬滅封片劑）25 μL滴于潔凈載玻片，反扣；

（16）在熒光顯微鏡下觀察。

3.4 結(jié)果與分析

圖1為CPT誘導(dǎo)細胞DNA損傷修復(fù)的觀察，其中上、下兩組分別為對照組和加入CPT的實驗組，左側(cè)為53BP1熒光顯色圖，右側(cè)為DAPI核酸染色圖。如圖1所示，CPT處理HeLa細胞2 h后，能夠在熒光顯微鏡下觀察到53BP1 foci的形成，說明CPT對誘導(dǎo)細胞 DNA損傷的形成具有很強的作用。在沒有通過 CPT處理的 HeLa細胞中，部分細胞能夠檢測到53BP1 foci的形成，說明在正常的細胞中，有源發(fā)性的DNA損傷發(fā)生。實驗還檢測了其他藥物或化合物，發(fā)現(xiàn)很多化合物都不能促進 DNA損傷修復(fù)的發(fā)生。實驗還發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)抗腫瘤藥物都能引起細胞的凋亡或死亡，這些藥物的副作用和藥物作用特異性引起學(xué)生關(guān)注，激發(fā)了他們進一步探究的興趣。

圖1 CPT誘導(dǎo)細胞DNA損傷修復(fù)的觀察

在本項實驗中，學(xué)生基本上都能順利完成所有實驗，取得了比較好的實驗效果。但也有學(xué)生由于所加藥物毒性太大，或藥物濃度過高，導(dǎo)致細胞大量死亡，而無法獲得較好的實驗效果。今后將增加細胞藥物耐受性檢測，使學(xué)生能夠在適當(dāng)?shù)乃幬餄舛认逻M行實驗，從而獲得更好的教學(xué)效果。引入 DNA修復(fù)實驗，不僅讓學(xué)生接觸了學(xué)科前沿，而且使學(xué)生又一次得到無菌操作技術(shù)、免疫熒光技術(shù)訓(xùn)練，有助于學(xué)生更好地掌握細胞生物學(xué)基礎(chǔ)實驗技術(shù)，為未來讀研或快速開展科研打好基礎(chǔ)。

4 結(jié)語

本次教學(xué)改革旨在鍛煉學(xué)生自己提出問題、設(shè)計實驗方案，并用經(jīng)典的實驗手段解決問題及對實驗結(jié)果進行分析的能力，實現(xiàn)課堂教學(xué)與大學(xué)生創(chuàng)新科研訓(xùn)練培養(yǎng)一體化。同時，將最前沿的研究熱點和科學(xué)問題帶入課堂，能夠使學(xué)生了解和設(shè)計相關(guān)研究項目，極大地提高了學(xué)生的課堂參與度與學(xué)習(xí)興趣，獲取了良好的教學(xué)效果。