84消毒溶液對生物實驗室廢棄細胞殺滅作用

吉新華，沈西華，鄒 泓

（石河子大學 醫(yī)學院病理學系，第一附屬醫(yī)院病理科，新疆 石河子 832000）

細胞實驗是現(xiàn)代生物實驗中一個重要組成部分，培養(yǎng)條件要求比較苛刻，在進行細胞實驗時面臨的 2個常見問題是細胞滅活和細胞污染。目前，國內大多數(shù)實驗室對于細胞實驗中廢棄細胞的處理大都是直接排放進下水道，容易造成環(huán)境污染，對周圍人群的健康造成潛在威脅，且國內未見用于活細胞滅活的市售制劑以及相關實驗和方法的報道。其次大部分實驗室的消毒仍然使用75%酒精、新潔爾滅、甲醛熏蒸等，尤其是超凈臺的消毒方法大多為擦拭75%酒精后用紫外線照射30 min。但是由于某些細胞的生命力較強，仍然存在消毒不徹底導致實驗細胞的交叉污染，引起細胞的變異并影響實驗結果[1]，因此有必要探討新型生物實驗室廢棄細胞滅活方法，進而改良目前細胞實驗室消毒流程。84消毒液主要用于各種物體表面和環(huán)境等的消毒[2]，是一種含氯消毒劑，其作用機制是通過細胞壁對細菌芽胞、甲乙肝病毒等多種病毒[3]、副溶血性弧菌[4]、結核分枝桿菌[5]進行殺滅作用。本實驗擬通過細胞增殖研究梯度濃度的 84溶液對不同腫瘤細胞的殺傷作用，提出一種新型、廉價有效的生物實驗室廢棄細胞的滅活方法，并針對現(xiàn)有細胞實驗室消毒方法進行改良，更好地減少生物實驗室的污染。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和耗材

1640（GIBCO中國）、DMEM（GIBCO中國）、胰蛋白酶含0.25% EDTA消化液（北京索萊寶公司）；PBS（上海生工公司）；胎牛血清（以色列Bidnd公司），15 mL 離心管（美國 Corning公司）；1 000、200、10 uL槍頭（麥斯諾品牌）；96孔板（江蘇海貍）；CCK8試劑（日本同仁）；25 cm2培養(yǎng)瓶；無粉乳膠手套（Biosharp公司）；青霉素鏈霉素的混合液（北京索萊寶公司）；1.5、2、5 mL EP管（南通海之星實驗器材公司）。

1.1.2 主要儀器設備

Cu-420型電熱恒溫水箱（上海一恒科技有限公司），371型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司），SW-CJ-1F型超凈工作臺（中國上海博訊公司），1 mL、200 uL、10 uL 移液器（德國 Eppendorf公司），TDL-50B型離心機（上海安亭科學儀器廠），LX-100手掌型離心機（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司），xMark酶標儀（美國BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

待細胞復蘇后從37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中取出待處理的細胞，放置在熒光倒置顯微鏡下觀察，當細胞生長成致密單層，融合度基本達到80%～90%且狀態(tài)良好時，用胰蛋白酶將細胞消化之后，進行鋪板及其他后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗

將融合度基本達到80%～90%且狀態(tài)良好的786-0細胞株，用胰蛋白酶將細胞消化之后進行鋪板。鋪96孔板分為10組，每組鋪5個復孔以去掉最大值和最小值，每個復孔鋪1×104個細胞。然后將細胞放于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將各組的細胞的培養(yǎng)基換成含有梯度濃度的84消毒液的水溶液（表1）后，放入培養(yǎng)箱反應1和5 min后在每個復孔加入10 uL的CCK-8反應1 h后再檢測其增殖情況。且后期通過在腎癌細胞系(ACHN)、食管癌細胞（109、9706）、滑膜肉瘤細胞（SW982）、橫紋肌肉瘤癌細胞株（RD）、卵巢癌細胞株（A2980）中進行CCK-8實驗以此確定不同 84消毒劑殺滅細胞的最佳濃度以驗證之前的實驗結果。

1.2.3 細胞成像

在786-0細胞株融合度基本達到80%～90%且狀態(tài)良好時，將細胞用胰蛋白酶消化之后進行鋪板。鋪12孔板分為10組，每組鋪1個復孔，每個復孔鋪2×105個細胞。然后將細胞放于37 ℃、含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察各組細胞的形態(tài)及拍照。待拍完照之后，將各組細胞的培養(yǎng)基換成含有梯度濃度的84消毒液的水溶液（表1），放入培養(yǎng)箱反應1 min后再觀察各實驗組細胞的形態(tài)并拍照。

表1 滅活液中84原液與水的配比

1.2.4 應用

SPSS2.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，P＜0.05時有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖實驗

與對照組相比，隨著 84水溶液濃度的增加對細胞的抑制率逐漸增加直到平臺期，且由抑制曲線可以看出反應1 min時，84水溶液濃度為100 mg/L時處于平臺期，對細胞抑制率最高；反應5 min時，84水溶液濃度為60 mg/L時細胞處于平臺期（圖1），對細胞的抑制效率最高（P＜ 0.05）。

2.2 細胞成像

反應1 min后，84消毒液處理組與對照組相比，細胞密度變小，形態(tài)發(fā)生改變，隨著84消毒劑濃度的遞增，細胞數(shù)量及形態(tài)發(fā)生更為明顯的變化，直至84消毒劑濃度為 100 mg/L的處理組里面細胞的形態(tài)發(fā)生完全崩解（圖2）；反應5 min后，84消毒液處理組與對照組相比，細胞密度變小，形態(tài)發(fā)生改變，隨著84消毒劑濃度的遞增，細胞數(shù)量及形態(tài)發(fā)生更為明顯的變化，直至84消毒劑濃度為60 mg/L的處理組里面細胞的形態(tài)發(fā)生完全崩解（圖3）。

2.3 84消毒劑對其他腫瘤細胞的影響

通過腎癌細胞(ACHN)、食管癌細胞（109、9706）、滑膜肉瘤細胞（SW982）、橫紋肌肉瘤癌細胞株（RD）、卵巢癌細胞株（A2980）在 1 min反應時間內，確定84消毒劑的水溶液最佳殺滅細胞濃度為100 mg/L，P＜ 0.05（圖 4）。

2.4 實驗結果

實驗結果顯示，作用1 min后，84消毒液對腫瘤細胞殺傷力最佳濃度為100 mg/L；作用5 min后，84消毒液對腫瘤細胞殺傷力最佳濃度為 60 mg/L。為了更迅速、更有效達到殺滅細胞的目的，本文推薦濃度為100 mg/L 84消毒液短時間用于細胞室超凈臺的消毒和廢棄細胞處理，即消毒劑84消毒劑：水為1∶499，反應1 min。此方法可以作為一種細胞室消毒方法，特別是超凈臺與細胞培養(yǎng)箱的消毒（消毒超凈臺順序可為100 mg/L的84消毒劑、75%酒精和紫外照射 30 min）和廢棄細胞的處理，應用于日常實驗。

圖1 腎透明細胞癌細胞株786-0加入梯度濃度的84消毒劑在反應1、5 min后的抑制率，其中A、B分別顯示的是加入梯度有效氯含量的84消毒溶液后反應1、5 min后的抑制率

圖2 梯度濃度的84消毒液作用1 min后對腎透明細胞癌細胞株（786-0）細胞形態(tài)的影響（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）分別是加入有效氯為 0、20、40、60、80、100 mg/L 的 84 消毒溶液之前的細胞形態(tài)；（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）分別是加入有效氯為0、20、40、60、80、100 mg/L的84消毒溶液之后的細胞形態(tài)

圖3 腎透明細胞癌細胞株（786-0）反應5 min前后細胞形態(tài)變化。其中（A）、（B）、（C）、（D）、（E）、（F）分別是加入有效氯為 0、20、40、60、80、100 mg/L 的 84 消毒溶液之前的細胞形態(tài)；（a）、（b）、（c）、（d）、（e）、（f）分別是加入有效氯為0、20、40、60、80、100 mg/L的84消毒溶液之后的細胞形態(tài)

圖4 梯度有效氯濃度的84消毒溶液反應1 min對不同腫瘤細胞的影響

3 結論

現(xiàn)代醫(yī)學實驗室管理存在的主要問題是沒有采用正確的方法處理廢棄物，實驗結束后直接將廢棄物倒入下水道[6]。對于這些細胞實驗過程中產生的生物活性材料及其代謝物，比如培養(yǎng)的細胞、微生物及其培養(yǎng)物等[7]，如不加以妥善處置，必然對環(huán)境和人類健康產生很大危害[8]。

本實驗確定了平時最常見的消毒劑（84消毒劑）在1 min內最佳的殺滅細胞的濃度為100 mg/L，來殺滅細胞實驗在操作過程中遺留在細胞間尤其是超凈臺和無菌室的細胞，從而減少細胞間的交叉污染，同時還可以用來殺滅實驗產生的廢棄細胞以減少生物污染，是一種細胞滅活、減少細胞交叉污染的辦法。