釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物對(duì)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞β-防御素-1表達(dá)的影響

魏 方，趙霏霏，楊銀鳳*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

防御素是一類富含半胱氨酸的兩親性帶正電荷的內(nèi)源性小分子多肽，是先天免疫系統(tǒng)的效應(yīng)分子，具有有效的抗細(xì)菌、真菌和病毒等微生物活性[1]，并廣泛存在于植物、昆蟲和脊椎動(dòng)物等生物界中。脊椎動(dòng)物身體內(nèi)的防御素基于其結(jié)構(gòu)和二硫鍵連接方式不同可以進(jìn)一步分為α-防御素、β-防御素和θ-防御素3種類型[2]。其中，β-防御素已被廣泛研究，其由上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞群產(chǎn)生，具有廣譜的抗菌功效，可作用于革蘭陽性菌和革蘭陰性菌以及真菌和包膜病毒，進(jìn)一步調(diào)節(jié)微生物和宿主之間的串?dāng)_和維持黏膜系統(tǒng)健康及動(dòng)態(tài)平衡[1-3]。因此，利用防御素生物學(xué)特性代替抗生素治療微生物感染將成為一種新的治療方法。

酵母相關(guān)產(chǎn)物存在于我們?nèi)粘Ｉ畹姆椒矫婷媲曳N類繁多。其除了作為食品添加劑和護(hù)膚成分被應(yīng)用于食品和化妝品方面，還作為飼料添加劑被應(yīng)用于養(yǎng)殖動(dòng)物飼料中，對(duì)動(dòng)物健康和生產(chǎn)起積極作用。2013年農(nóng)業(yè)部將釀酒酵母培養(yǎng)物、釀酒酵母提取物和釀酒酵母細(xì)胞壁3種釀酒酵母相關(guān)產(chǎn)物從《飼料添加劑品種目錄》轉(zhuǎn)入《飼料原料目錄》，可見其在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中占有重要位置。釀酒酵母培養(yǎng)物是以釀酒酵母為菌種，經(jīng)固體發(fā)酵、濃縮、干燥等處理后獲得的天然發(fā)酵產(chǎn)品，其主要有效成分為釀酒酵母細(xì)胞胞外代謝產(chǎn)物，含有甘露聚糖、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、核苷酸和肽等多種物質(zhì)，具有免疫調(diào)節(jié)功能。釀酒酵母提取物是以釀酒酵母為菌種，經(jīng)液體發(fā)酵后獲得菌體，再經(jīng)自溶或機(jī)械破碎等處理方法使菌體破碎后，分離獲得可溶性組分并濃縮干燥所得產(chǎn)品，其主要成分為釀酒酵母細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)。關(guān)于釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物的研究主要是其被試驗(yàn)動(dòng)物攝入后對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)、健康和胃腸道菌群及形態(tài)等方面的影響，而有關(guān)其與防御素表達(dá)的關(guān)系研究報(bào)道卻是很少見到。近年來，相關(guān)研究表明，飼喂酵母培養(yǎng)物對(duì)哺乳期犢牛和斷奶仔豬的生長性能、腸道健康和機(jī)體免疫均有促進(jìn)作用[4-5]。劉明等[6]在研究酵母提取物對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腹瀉發(fā)生率和腸道形態(tài)影響中發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，添加酵母提取物組斷奶仔豬在飼養(yǎng)后半階段日增重顯著增加，并在試驗(yàn)第1，2，4周腹瀉發(fā)生率顯著降低，且腸絨毛生長也得以促進(jìn)。胡勝蘭[7]在類似研究中發(fā)現(xiàn)，短期日糧添加富含核苷酸的酵母提取物雖然對(duì)斷奶仔豬生長性能無顯著性影響，但腎質(zhì)量顯著提高，且改善了腸道益生菌增殖并抑制致病菌生長；甚至能夠在非潔凈環(huán)境中上調(diào)炎性細(xì)胞因子進(jìn)而提高斷奶仔豬腸道免疫應(yīng)答。本課題組研究團(tuán)隊(duì)之前進(jìn)行了釀酒酵母菌、釀酒酵母菌細(xì)胞壁及其組分甘露聚糖和β-葡聚糖對(duì)SBD-1表達(dá)影響的研究，發(fā)現(xiàn)它們均可不同程度誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)[8-11]。然而，關(guān)于釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物對(duì)SBD-1表達(dá)影響的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。

本試驗(yàn)采用qPCR技術(shù)檢測釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物在不同質(zhì)量濃度、不同時(shí)間段刺激ORECs后，SBD-1 mRNA的表達(dá)變化。為從益生菌胞外代謝產(chǎn)物和胞內(nèi)物質(zhì)與上皮細(xì)胞防御素表達(dá)關(guān)系的角度研究防御素發(fā)揮免疫作用的途徑和機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料綿羊瘤胃組織塊取自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市北亞屠宰場屠宰的健康綿羊。取幾塊瘤胃組織塊用提前準(zhǔn)備好的滅菌生理鹽水洗去內(nèi)容物后，放入滅菌生理鹽水中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行下一步操作。

1.2 綿羊瘤胃上皮細(xì)胞(ORECs)原代培養(yǎng)從瘤胃組織上剝離黏膜層，將黏膜層轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)用含青、鏈霉素的PBS緩沖液清洗數(shù)遍，直到溶液澄清為止。然后利用胰蛋白酶連續(xù)消化法，在37℃條件下，連續(xù)消化黏膜層6次，消化時(shí)間依次為30，20，15，10，8，5 min，每次消化完成后，倒置顯微鏡下觀察消化液，使用200目篩子過濾收集含有較多圓而亮細(xì)胞的消化液并用含20%胎牛血清的DMEM/F12終止消化。最后一次消化液收集完成后，1 600 r/min離心8 min棄去上清液，用PBS緩沖液重懸細(xì)胞沉淀，離心棄去上清后，用完全培養(yǎng)基混勻細(xì)胞并裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 d后更換培養(yǎng)基，之后每隔2 d更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)單層細(xì)胞匯合生長大約鋪滿瓶底80%以上時(shí)，即可將細(xì)胞消化傳代擴(kuò)大培養(yǎng)用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物溶液配制

1.3.1釀酒酵母培養(yǎng)物溶液配制 釀酒酵母培養(yǎng)物溶液由達(dá)農(nóng)威益康XP(達(dá)農(nóng)威生物發(fā)酵工程技術(shù)(深圳)有限公司)提供，為淺橙色粗粉溶于PBS溶液制成。稱取0.6 g達(dá)農(nóng)威益康XP放入30 mL PBS溶液中，渦旋將其充分混合并在搖床上室溫溫育1 h，使大部分粉末溶解。然后，2 400 r/min離心10 min除去剩余的固體，收集上清液，在超凈工作臺(tái)中使用0.22 μm過濾器無菌過濾上清液，得到20 g/L 釀酒酵母培養(yǎng)物溶液備用。

1.3.2釀酒酵母提取物溶液配制 釀酒酵母提取物溶液由YEAST EXTRACT(OXOID公司產(chǎn)品，為淺橙色粉末)溶于PBS溶液制成。配制方法同1.3.1。

1.4 釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物刺激ORECs的試驗(yàn)設(shè)計(jì)每孔加入200 mg/L釀酒酵母培養(yǎng)物的DMEM/F12培養(yǎng)基刺激ORECs 作為刺激組，同時(shí)用DMEM/F12培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，放置于37℃溫箱刺激2 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，再重新加入DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6，12，18，24，30 h后分別提取各組ORECs總RNA。然后利用qPCR技術(shù)檢測SBD-1 mRNA 的表達(dá)量，以篩選出釀酒酵母培養(yǎng)物誘導(dǎo)ORECs SBD-1 mRNA 表達(dá)的最佳時(shí)間；每孔加入不同質(zhì)量濃度(0，100，200，300，400 mg/L)釀酒酵母培養(yǎng)物的DMEM/F12培養(yǎng)基刺激ORECs，置于37℃溫箱刺激2 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，再重新加入DMEM/F12培養(yǎng)基，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)最佳時(shí)間后提取各組ORECs總RNA。然后利用qPCR技術(shù)檢測SBD-1 mRNA 的表達(dá)量，以篩選出釀酒酵母培養(yǎng)物誘導(dǎo)ORECs SBD-1 mRNA 表達(dá)的最佳質(zhì)量濃度。釀酒酵母提取物對(duì)ORECs的刺激試驗(yàn)設(shè)計(jì)同釀酒酵母培養(yǎng)物。

1.5 MTT法檢測釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物對(duì)ORECs的毒性作用消化收集生長狀態(tài)良好的ORECs，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度以每孔2×104個(gè)接種于96孔板，以含不同質(zhì)量濃度(0，100，200，300，400 mg/L)釀酒酵母培養(yǎng)物的DMEM/F12培養(yǎng)基刺激ORECs 2 h后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)30 h；棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，每孔加入10 μL MTT溶液(5 g/L)和100 μL DMEM/F12培養(yǎng)基， 37℃、5% CO2培養(yǎng)4 h后，終止培養(yǎng)；使用DMSO溶解，使用多功能酶標(biāo)儀(SynergyTMH4，Biotek)在490 nm處檢測各孔的密度。釀酒酵母提取物對(duì)ORECs毒性作用的檢測同釀酒酵母培養(yǎng)物。

1.6 細(xì)胞RNA提取和反轉(zhuǎn)錄根據(jù)RNA提取試劑盒(Axygen公司產(chǎn)品)說明書操作，提取ORECs總RNA，使用多功能酶標(biāo)儀檢測所提RNA在260，280 nm波長下的吸光度(D值)，并分析其純度和濃度。然后將所提RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa，RR047A)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)內(nèi)參基因β-actin和目的基因SBD-1各自的基因特異性引物的設(shè)計(jì)與合成均由上海生工生物有限公司完成(表1)。以cDNA為模板，參照張曼等[10]qPCR試驗(yàn)方法檢測目的基因SBD-1相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)反應(yīng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析分別使用SPSS軟件和GraPhPad Prism 5軟件對(duì)試驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖片制作。試驗(yàn)結(jié)果均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。其中P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著。

表1 引物序列及擴(kuò)增片段大小

2 結(jié)果

2.1 ORECs原代培養(yǎng)及傳代培養(yǎng)ORECs生長狀態(tài)如圖1所示，原代細(xì)胞培養(yǎng)4 d后顯微鏡下觀察，可見或大或小的貼壁細(xì)胞團(tuán)均勻分布(圖1 A)；培養(yǎng)8 d后觀察到上皮細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈現(xiàn)鵝卵石鋪路狀單層匯合貼滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底，此時(shí)可使用胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)(圖1 B)。細(xì)胞傳代培養(yǎng)2 d時(shí)顯微鏡下觀察(圖1 C)，上皮細(xì)胞單層匯合生長連成片狀，細(xì)胞間仍有空隙可供細(xì)胞繼續(xù)生長，與原代上皮細(xì)胞生長相比，傳代細(xì)胞生長速度加快；傳代培養(yǎng)4 d后(圖1 D)，上皮細(xì)胞緊湊排列、密集生長，幾乎鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底。

圖1 ORECs原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)(100×) A.原代培養(yǎng)4 d的ORECs；B.原代培養(yǎng)8 d的ORECs；C.傳代培養(yǎng)2 d的ORECs；D.傳代培養(yǎng)4 d的ORECs

2.2 釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物對(duì)ORECs的毒性作用本試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)質(zhì)量濃度梯度(0，100，200，300，400 mg/L)的釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物分別刺激ORECs 2 h，誘導(dǎo)培養(yǎng)30 h后，再利用MTT法檢測各孔中上皮細(xì)胞存活率，以確定釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物對(duì)ORECs毒性的影響，結(jié)果如圖2所示。不同質(zhì)量濃度釀酒酵母提取物和培養(yǎng)物刺激上皮細(xì)胞后，細(xì)胞存活率同對(duì)照相比無顯著性差異(圖2)，表明100，200，300，400 mg/L質(zhì)量濃度釀酒酵母提取物和培養(yǎng)物對(duì)上皮細(xì)胞無毒性。

2.3 β-actin和SBD-1基因qPCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3.1β-actin和SBD-1基因qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異性檢測 以所提RNA反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模板，使用上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成的目的基因SBD-1和內(nèi)參基因β-actin引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)。其擴(kuò)增曲線如圖3 A，B所示，可見擴(kuò)增效果良好。溶解曲線如圖3 C，D所示，觀察發(fā)現(xiàn)目的基因SBD-1和內(nèi)參基因β-actin溶解曲線分別在84℃和88.5℃處出現(xiàn)單一溶解峰，均未有雜峰出現(xiàn)，且單一溶解峰所處的Tm值同合成引物預(yù)期產(chǎn)物Tm值相同，表明qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物為單一且具有特異性的產(chǎn)物。

圖2 釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物對(duì)ORECs活性影響 A.不同質(zhì)量濃度釀酒酵母提取物對(duì)ORECs活性影響；B.不同質(zhì)量濃度釀酒酵母培養(yǎng)物對(duì)ORECs活性影響

圖3 β-actin和SBD-1基因qPCR擴(kuò)增曲線及溶解曲線 A.SBD-1基因qPCR擴(kuò)增曲線;B.β-actin基因qPCR擴(kuò)增曲線;C.SBD-1基因qPCR溶解曲線;D.β-actin基因qPCR溶解曲線

2.3.2β-actin和SBD-1基因qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定 利用1%瓊脂糖凝膠電泳法分析鑒定β-actin和SBD-1基因qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，分別在約208 bp和133 bp處可見特異性單一條帶且無二聚體出現(xiàn)，特異性單一條帶大小同設(shè)計(jì)引物的理論片段大小一致,證明qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物確實(shí)為β-actin和SBD-1基因的擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.4 釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物刺激ORECs誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)

2.4.1釀酒酵母培養(yǎng)物刺激ORECs 對(duì)SBD-1 mRNA表達(dá)的影響 為了確定釀酒酵母培養(yǎng)物對(duì)ORECs SBD-1 mRNA表達(dá)的影響，本試驗(yàn)首先用200 mg/L釀酒酵母培養(yǎng)物刺激ORECs 2 h后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)ORECs 6，12，18，24，30 h，同時(shí)設(shè)置未刺激組為空白對(duì)照。觀察到除了誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h組SBD-1 mRNA表達(dá)與未刺激組無顯著性差異以外(P>0.05)，其他組SBD-1 mRNA表達(dá)均極顯著高于未刺激組(P<0.01)，且誘導(dǎo)培養(yǎng)ORECs 6 h時(shí)SBD-1 mRNA的表達(dá)量達(dá)到最大(圖5 A)。然后用不同質(zhì)量濃度(0，100，200，300，400 mg/L)的釀酒酵母培養(yǎng)物刺激ORECs 2 h，誘導(dǎo)培養(yǎng) 6 h，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度釀酒酵母培養(yǎng)物刺激細(xì)胞均能誘導(dǎo)SBD-1 mRNA表達(dá)且顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，其中400 mg/L質(zhì)量濃度釀酒酵母培養(yǎng)物刺激組SBD-1 mRNA表達(dá)量最大，200 mg/L質(zhì)量濃度釀酒酵母培養(yǎng)物刺激組SBD-1 mRNA表達(dá)量次之(圖5 B)。由此可知，400 mg/L質(zhì)量濃度釀酒酵母培養(yǎng)物刺激誘導(dǎo)ORECs 6 h后，SBD-1 mRNA表達(dá)量達(dá)到最大。

圖4 β-actin(A)和SBD-1(B)基因qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳 M.DL2000 DNA Marker;A1～A4.β-actin 基因qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物;B1～B4.SBD-1基因qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.4.2釀酒酵母提取物刺激ORECs 對(duì)SBD-1 mRNA表達(dá)的影響 為了確定釀酒酵母提取物對(duì)ORECs SBD-1 mRNA表達(dá)的影響，本試驗(yàn)首先用200 mg/L釀酒酵母提取物刺激ORECs 2 h后繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)ORECs 6，12，18，24，30 h，同時(shí)設(shè)置未刺激組為空白對(duì)照。結(jié)果如圖5C所示，與未刺激組相比，誘導(dǎo)培養(yǎng)6,24,30 h組SBD-1 mRNA表達(dá)量均極顯著升高(P<0.01)，且誘導(dǎo)培養(yǎng)ORECs 6 h時(shí)SBD-1 mRNA的表達(dá)量達(dá)到最高(圖5 C)。接著用不同質(zhì)量濃度(0，100，200，300，400 mg/L)的釀酒酵母提取物刺激ORECs 2 h，誘導(dǎo)培養(yǎng) 6 h，發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度酵母提取物刺激細(xì)胞均能誘導(dǎo)SBD-1 mRNA表達(dá)，但僅200 mg/L質(zhì)量濃度釀酒酵母提取物刺激組SBD-1 mRNA表達(dá)量極顯著高于對(duì)照組(P<0.01，圖5 D)。由此可知，200 mg/L質(zhì)量濃度釀酒酵母提取物刺激誘導(dǎo)ORECs 6 h后，SBD-1 mRNA表達(dá)量達(dá)到最高。

2.5 最佳誘導(dǎo)條件下釀酒酵母提取物和培養(yǎng)物誘導(dǎo)ORECs SBD-1表達(dá)的比較結(jié)合本試驗(yàn)研究結(jié)果綜合考慮，釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物兩者均能夠誘導(dǎo)ORECs SBD-1 mRNA表達(dá)，且有各自不同的最佳誘導(dǎo)時(shí)間和質(zhì)量濃度。到底具體哪種物質(zhì)誘導(dǎo)ORECs SBD-1 mRNA表達(dá)效果最好？這個(gè)問題引起作者的好奇心。所以本課題組針對(duì)這一問題做了相關(guān)試驗(yàn)研究，分別用2種物質(zhì)在各自的最佳刺激質(zhì)量濃度和時(shí)間條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)ORECs,然后提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)qPCR擴(kuò)增反應(yīng)，結(jié)果見圖6。與對(duì)照組相比，釀酒酵母培養(yǎng)物刺激組SBD-1 mRNA表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，而釀酒酵母提取物刺激組SBD-1 mRNA表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，表明釀酒酵母提取物誘導(dǎo)效果優(yōu)于釀酒酵母培養(yǎng)物。

3 討論

近年來，隨著動(dòng)物集約化養(yǎng)殖和舍飼養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降，群體感染疾病風(fēng)險(xiǎn)增加?？股仉m然能夠預(yù)防疾病和促進(jìn)動(dòng)物生長，但由于其在動(dòng)物體內(nèi)殘留和耐藥菌產(chǎn)生等缺點(diǎn)，迫切需要尋找抗生素替代品。防御素作為小型陽離子兩性親和肽，是機(jī)體自身分泌的一類抗微生物肽，也是機(jī)體先天免疫系統(tǒng)的功能效應(yīng)物質(zhì)，能夠趨化免疫細(xì)胞，參與免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[12]，同時(shí)還具有抗細(xì)菌、抗真菌和抗病毒活性，是被公認(rèn)的抗生素有效替代品之一。最近幾年，關(guān)于誘導(dǎo)調(diào)控動(dòng)物胃腸道黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)β-防御素表達(dá)的研究引起了研究人員的極大興趣。相關(guān)研究表明，益生菌與體外培養(yǎng)的胃腸道上皮細(xì)胞共培養(yǎng)數(shù)小時(shí)后，能夠有效誘導(dǎo)防御素表達(dá)，并且部分益生菌菌種與防御素表達(dá)水平之間存在濃度-時(shí)間依賴關(guān)系[13-16]。此外，中草藥提取分子、維生素D、短鏈脂肪酸和膽汁酸等也被發(fā)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生防御素有積極作用，從而改善機(jī)體胃腸道免疫和預(yù)防疾病感染[1，17-19]。因此，益生菌和中草藥提取物等物質(zhì)可作為誘導(dǎo)劑有效誘導(dǎo)宿主體內(nèi)防御素表達(dá)。利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)防御素表達(dá)這一方法很有可能在不久將來成為一種新的治療方法，以替代抗生素治療感染和微生態(tài)失調(diào)引發(fā)的疾病。

圖5 釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物對(duì)ORECs SBD-1 mRNA表達(dá)的影響(**.P<0.01) A.釀酒酵母培養(yǎng)物處理ORECs不同時(shí)間對(duì)SBD-1 mRNA表達(dá)影響；B.不同質(zhì)量濃度釀酒酵母培養(yǎng)物處理ORECs對(duì)SBD-1 mRNA表達(dá)影響；C.釀酒酵母提取物處理ORECs不同時(shí)間對(duì)SBD-1 mRNA表達(dá)影響；D.不同質(zhì)量濃度釀酒酵母提取物處理ORECs對(duì)SBD-1 mRNA表達(dá)影響

圖6 釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物誘導(dǎo)ORECs SBD-1 mRNA表達(dá)的比較 *.P<0.05；**.P<0.01

釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物分別是釀酒酵母細(xì)胞胞外代謝產(chǎn)物和胞內(nèi)提取物，有不少體內(nèi)試驗(yàn)研究報(bào)道，酵母培養(yǎng)物和酵母提取物被哺乳動(dòng)物、禽類和蝦攝入后，能夠改善攝入者生長性能，促進(jìn)胃腸道對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，并增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫和降低死亡率[20-23]。張洪勤等[24]使用地塞米松建立免疫損傷小鼠模型，并用酵母提取物治療后發(fā)現(xiàn)，小鼠胸腺細(xì)胞凋亡被抑制。在體外細(xì)胞試驗(yàn)中，JENSEN等[25]的研究結(jié)果表明酵母培養(yǎng)物(益康XP)能夠活化NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞，并誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞上的CD80和CD86表達(dá)。然而，有關(guān)酵母培養(yǎng)物和酵母提取物與防御素表達(dá)的關(guān)系卻少見報(bào)道。為了解釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物質(zhì)量濃度和誘導(dǎo)時(shí)間與防御素表達(dá)之間的關(guān)系。本試驗(yàn)以體外培養(yǎng)的ORECs為研究對(duì)象，即可有效避免活體胃腸道內(nèi)復(fù)雜環(huán)境對(duì)試驗(yàn)的影響，又能夠節(jié)約試驗(yàn)成本。并使用qPCR方法從基因?qū)用鎸?duì)SBD-1 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物均能夠誘導(dǎo)SBD-1 mRNA表達(dá)，表達(dá)量與刺激物及其質(zhì)量濃度、誘導(dǎo)時(shí)間有關(guān)。當(dāng)釀酒酵母培養(yǎng)物質(zhì)量濃度為400 mg/L、釀酒酵母提取物質(zhì)量濃度為200 mg/L 分別誘導(dǎo)細(xì)胞6 h時(shí)SBD-1 mRNA表達(dá)量達(dá)到最高。這一結(jié)果表明，釀酒酵母培養(yǎng)物和提取物能夠作為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞內(nèi)防御素表達(dá)。但其具體作用機(jī)制和作用成分仍不確定，有待進(jìn)一步研究分析。

本試驗(yàn)通過體外細(xì)胞試驗(yàn)證明釀酒酵母培養(yǎng)物提取物均能夠誘導(dǎo)SBD-1 mRNA表達(dá)，且當(dāng)釀酒酵母培養(yǎng)物質(zhì)量濃度為400 mg/L、釀酒酵母提取物質(zhì)量濃度為200 mg/L分別誘導(dǎo)細(xì)胞6 h時(shí)SBD-1 mRNA表達(dá)量達(dá)到最高。其中，釀酒酵母提取物誘導(dǎo)效果優(yōu)于釀酒酵母培養(yǎng)物。