晾制濕度對雪茄煙葉碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及品質(zhì)的影響

盧紹浩，張嘉雯，趙喆，鐘秋，王俊，宋朝鵬，鄒宇航，張華述，趙銘欽

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南 鄭州 450002；

2 四川省煙草公司德陽市公司，四川 德陽 618400

雪茄是由煙葉卷制的一種特殊煙草制品，具有香氣醇厚豐滿，吃味香苦透甜，滿足感強的特點[1]。煙草調(diào)制作為煙葉生產(chǎn)工藝中的一個重要環(huán)節(jié)，合理的調(diào)制手段能在一定程度上彌補田間生長所帶來的不足[2]。煙葉在調(diào)制期間發(fā)生的一系列酶促反應(yīng)對溫濕度條件十分敏感，適宜的溫濕度能夠改善煙葉的內(nèi)在成分、外觀質(zhì)量和內(nèi)在品質(zhì)[3]。

碳氮代謝作為煙草生命活動中兩大初生代謝過程，主要包括碳水化合物與含氮化合物分解、轉(zhuǎn)化、消耗及積累，二者間協(xié)調(diào)程度對煙葉的內(nèi)在品質(zhì)具有重要影響[4]。調(diào)制過程中碳水化合物和含氮化合物發(fā)生顯著變化，其中以淀粉和蛋白質(zhì)變化最為明顯。在煙草調(diào)制階段淀粉含量由調(diào)制初期的29.3%降至5.52%，而蛋白質(zhì)含量降解約75%，且淀粉和蛋白質(zhì)的降解均與調(diào)制過程中的濕度緊密相關(guān)[5-6]。調(diào)制后煙葉殘留的淀粉不利于煙葉品質(zhì)和色澤的形成，而調(diào)制后蛋白質(zhì)含量過高，燃吸時將會產(chǎn)生燒焦的羽毛味并產(chǎn)生辛辣感[7-8]。合理調(diào)控晾制過程中環(huán)境濕度對促進雪茄煙葉內(nèi)碳水化合物和含氮化合物的轉(zhuǎn)化及內(nèi)在品質(zhì)的提高具有重要意義。賀帆等[9]研究表明，密集烘烤低溫中濕環(huán)境下煙葉中氮代謝相關(guān)酶能保持較高活性，有利于煙葉內(nèi)含氮化合物的轉(zhuǎn)化。王懷珠等[10]發(fā)現(xiàn)，低溫低濕變黃，慢升溫定色有利于保持較高碳代謝相關(guān)酶活性，調(diào)制后煙葉淀粉含量較低且各化學(xué)成分較協(xié)調(diào)。國內(nèi)外學(xué)者就不同烘烤條件對烤煙碳水化合物和含氮化合物的影響進行了大量研究[11-12]，而對雪茄煙葉晾制過程濕度變化對煙葉品質(zhì)的影響報道甚少。本試驗通過研究晾制過程中不同濕度下雪茄煙葉碳氮代謝變化規(guī)律及相關(guān)酶活性的變化，旨在為優(yōu)化雪茄煙葉調(diào)制技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗田土壤為水稻土，有機質(zhì)3.01 g·kg-1，堿解氮120 mg·kg-1，速效鉀89 mg·kg-1，速效磷38.1 mg·kg-1，pH 為5.8～7.0。試驗品種為德雪1 號。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2019 年在四川什邡市大泉坑村雪茄煙葉生產(chǎn)基地（東經(jīng)104°09′，北緯31°18′）進行。煙苗于4 月30 日移栽，行距120 cm，株距40 cm，按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)雪茄煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范統(tǒng)一管理，煙田施氮量為180 kg·hm-2（煙草專用復(fù)合肥），N：P2O5：K2O ＝1：0.5：3。采收時選取大田長勢基本一致、葉片成熟度相對一致的煙株，以中部葉（第10-12葉位）為試驗材料，將采收煙葉分別掛入高濕、中濕、低濕三種梯度的恒溫恒濕箱中進行晾制，各處理重復(fù)3 次，溫濕度設(shè)定見表1。分別在雪茄煙晾制的6 個時期（鮮煙S1、凋萎期S2、變黃期S3、變褐期S4、定色期S5、干筋期S6）取樣，每次選取各處理煙葉30 片分成三份，一份用于煙葉含水率的測定；一份用錫箔紙和紗布包裹后放于液氮中，用于相關(guān)酶活性的測定；一份去除主脈和葉尖殺青后，將其烘干磨碎過60 目篩，用于化學(xué)成分的測定。

表1 晾制過程溫濕度設(shè)定Tab. 1 Temperature and relative humidity during airing process

1.3 測定指標與方法

1.3.1 含水率測定方法

將整片煙葉葉尖1/3 處和葉基1/3 處去除，放入（100±1）℃的烘箱中，采用烘箱法[13]測定雪茄煙葉的含水率。

1.3.2 碳氮代謝關(guān)鍵酶活性及質(zhì)體色素含量

淀粉酶（amylase，AL）、中性轉(zhuǎn)化酶（neutral invertase，NI）、 硝 酸 還 原 酶（nitrate reductase，NR）谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）活性采用紫外分光光度法利用AL、NI、NR 及GS 活性測定試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定。葉綠素和類胡蘿卜素含量采用丙酮浸提比色法[14]測定。

1.3.3 化學(xué)成分含量測定方法

總糖、還原糖、淀粉、總氮、煙堿、蛋白質(zhì)含量采用流動分析法測定[15]。氨基酸含量采用紫外分光光度法利用氨基酸含量測定試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）測定。

1.3.4 物理特性及感官質(zhì)量評價

煙葉物理特性參照吉書文等[16]方法檢測。將不同濕度處理的煙葉卷制成單料煙，感官評吸鑒定聘請什邡雪茄廠顧問時向東教授為首的7 名評吸專家，依據(jù)《YC/T415—2011 煙草在制品感官評價方法》進行感官評吸鑒定[17]。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

采用Microsoft Excel 2007 進行數(shù)據(jù)整理及作圖，運用SPSS 21.0 進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 晾制過程不同濕度對雪茄煙葉含水率的影響

由表2 可知，隨著晾制的進行，不同處理雪茄煙葉失水速率均呈現(xiàn)“慢—快—慢”的下降趨勢，水分含量逐漸降低。晾制過程中，T1 處理所處的晾制環(huán)境濕度較大，含水率始終保持在較高水平，而T3 處理濕度較低，煙葉水分散失過快，含水率較低，表明了晾制濕度的高低對煙葉水分的散失有一定影響。在變黃期開始煙葉含水率迅速降低，其中以T3 降幅最高，T1 次之，T2 最低，分別為63.77%、51.11%和50.93%。表明雪茄煙葉在變色期水分快速散失。

表2 不同晾制濕度對雪茄煙葉含水率的影響Tab. 2 Effect of air curing humidity on moisture content of cigar tobacco leaves

2.2 晾制過程不同濕度對雪茄煙葉碳氮代謝相關(guān)酶活性的影響

由圖1 可知，煙葉中碳代謝相關(guān)酶NI 和AL 活性在晾制期間先升高后降低，而氮代謝相關(guān)酶NR和GS 活性一直呈下降趨勢。不同濕度處理酶活性在晾制前期無顯著差別，隨晾制的進行差異逐漸增大，均以T2 處理最高。在晾制過程中各處理NI 活性均呈先上升后急劇下降的變化趨勢（圖1A），在定色期達到最高值，此時隨濕度的降低煙葉內(nèi)NI 活性分別為1554.99 μg·min-1g-1、1900.08 μg·min-1g-1和1245.78 μg·min-1g-1，且各處理差異顯著；煙葉定色后（S5）NI 活性迅速降低，各處理差異不大。如圖1B 所示，不同處理煙葉AL 活性具有相同的變化趨勢，均呈單峰波動變化，在變褐期達到峰值，其中T1、T2 和T3 處理AL 活性分別比晾制初期升高了41.71%、94.84%和64.66%，之后活性逐漸下降；在干筋期之前T2 處理AL 活性均高于T1 和T3 處理，且與T1 處理達到顯著差異，之后處理間差異減小。這說明碳代謝相關(guān)酶活性在T2 處理下較高，能夠加強葉片內(nèi)碳水化合物代謝，促進淀粉等大分子物質(zhì)降解。

NR 和GS 是植物氮代謝的限速酶，對氮代謝的強弱起著關(guān)鍵作用。不同處理雪茄煙葉NR 活性具有相同的變化趨勢（圖1C），均呈下降趨勢。在晾制凋萎期活性劇烈降低，以T3 處理降解幅度最大，T1處理次之，T2 處理最低，降解幅度分別為62.48%、53.67%和43.77%，處理間差異達到顯著水平，之后各處理NR 活性趨于平緩且差異不大。與NR 活性相比，整個晾制期間，煙葉內(nèi)GS 活性始終高于NR 活性（圖1D），各處理GS 活性均呈下降趨勢，且降幅較平緩。變褐期之前T2 處理煙葉GS 活性顯著高于其他處理，之后至晾制結(jié)束各處理間無顯著差異。表明在晾制期間氮代謝能力逐漸降低，而中濕度處理有利于煙葉酶活性相對提高。

圖1 不同晾制濕度的雪茄煙葉NI(A)、AL(B)、NR(C)、GS(D)活性Fig. 1 Activities of NI(A), AL(B), NR(C) and GS(D) in cigar tobacco leaves with different air curing humidity

2.3 晾制過程不同濕度對雪茄煙葉碳水化合物含量的影響

如圖2A 所示，不同濕度處理處理雪茄煙葉調(diào)制過程中總糖含量變化趨勢一致，即呈逐漸下降趨勢，且降解幅度較均勻。晾制初期，各處理間總糖含量差異不大，隨著晾制的進行各處理總糖含量表現(xiàn)為T2＞T3＞T1，且差異顯著。干筋期時隨著濕度的降低總糖含量分別為0.66%（T1）、1.31%（T2）和0.96%（T3）。晾制期間還原糖含量與總糖含量變化基本一致，呈下降趨勢（圖2B），干筋期與晾制初期相比各處理下降幅度分別為77.11%（T1）、58.72%（T2）和68.13%（T3）。整個晾制過程中T2處理煙葉還原糖含量始終最高，在凋萎期和干筋期與其它處理差異顯著。表明晾制期間煙葉內(nèi)碳水化合物大量消耗，而中濕度處理的煙葉總糖和還原糖含量較高，能緩解碳水化合物的消耗，有利于提高調(diào)制后的煙葉品質(zhì)。由圖2C 可知，不同濕度條件下雪茄煙葉淀粉含量均呈下降趨勢，在凋萎期內(nèi)淀粉含量下降較快，之后趨于平緩，在相同時間內(nèi)T2 處理淀粉含量均顯著低于T1 和T3 處理。晾制結(jié)束（S6）時以T3 處理淀粉含量最高，T1 次之，T2 最低，分別為1.61%、1.29%和0.81%，這說明過高和過低的晾制濕度均不利于煙葉中淀粉的降解。

圖2 不同晾制濕度對總糖(A)、還原糖(B)及淀粉(C)含量的影響Fig. 2 Effect of air curing humidity on contents of total sugar(A), reducing sugar(B) and starch(C)

2.4 晾制過程不同濕度對雪茄煙葉含氮化合物含量的影響

不同濕度條件下雪茄煙葉總氮含量在晾制過程中呈遞減趨勢（圖3A），但變化幅度小。不同濕度條件下以T3 處理煙葉總氮含量降解最多，T2 處理煙葉總氮含量降解最少，整個晾制期間各處理總氮含量差異未達到顯著水平，說明不同晾制濕度對總氮含量變化影響較小。由圖3B 表明，晾制期間雪茄煙葉煙堿含量先升高后降低，各濕度處理煙葉均在變黃期達到峰值，此時T1、T2、T3 煙堿含量分別為4.88%、4.17%、3.61%，且處理間差異顯著，之后煙堿含量隨時間推移逐漸降低。晾制過程中3 個處理煙堿含量表現(xiàn)為T1＞T2＞T3，表明中濕度處理使煙葉中煙堿含量保持在較適宜的水平，有利于提高煙葉的感官品質(zhì)。

晾制過程中蛋白質(zhì)降解動態(tài)如圖3C 所示。晾制結(jié)束時（S6），自高到低各濕度處理蛋白質(zhì)含量降幅為18.00%～6.76%、18.00%～4.01%和18.00%～5.70%，分別降低了2.66 倍、4.49 倍和3.16 倍。晾制期間T2處理的煙葉蛋白質(zhì)含量顯著低于T1 和T3 處理。晾制過程中不同濕度條件下雪茄煙葉氨基酸含量呈單峰曲線變化（圖3D），T1、T2、T3 各濕度處理的峰值均在變黃期，分別為106.49 μmol·mg-1、180.21 μmol·mg-1、142.47 μmol·mg-1，且達到了顯著差異；相比于晾制初期各處理分別升高了1.81（T1）、3.07（T2）、2.42（T3）倍，之后含量逐漸降低。說明了T2 處理有利于蛋白質(zhì)的降解，并且促進了氨基酸的積累。

圖3 不同晾制濕度對總氮(A)、煙堿(B)、蛋白質(zhì)(C)和氨基酸(D)含量的影響Fig. 3 Effect of air curing humidity on contents of total nitrogen(A), nicotine(B), protein(C) and amino acid(D)

2.5 晾制過程不同濕度對雪茄煙葉質(zhì)體色素含量的影響

質(zhì)體色素是評價煙葉可用性以及品質(zhì)的重要指標之一，其降解產(chǎn)物與致香成分緊密相關(guān)。由表3 可知，隨著晾制時間的增加，各處理葉綠素和類胡蘿卜素含量均呈下降變化，其中類胡蘿卜素降幅遠小于葉綠素。各處理相比較，煙葉質(zhì)體色素含量降幅表現(xiàn)為：T3＞T2＞T1，且整個晾制過程中T1 與T3 均達到顯著差異水平，但T2 與T3 除個別時期外差異均不顯著，表明在晾制過程中適當(dāng)降低環(huán)境濕度有利于促進質(zhì)體色素充分降解，從而提高雪茄煙葉品質(zhì)。

表3 不同晾制濕度對質(zhì)體色素含量的影響Tab. 3 Effect of air curing humidity on plastid pigment content

2.6 不同濕度對晾制后雪茄煙葉物理特性及感官質(zhì)量的影響

從表4 可以看出，不同處理雪茄煙葉葉質(zhì)量重、葉厚、拉力以及平衡含水率均以T2 處理最大，而含梗率則以T2 處理最小，這可能是調(diào)制期間中濕度條件適宜，可防止煙葉中的物質(zhì)過度轉(zhuǎn)化，使煙葉的厚度及葉質(zhì)重均可保持在一個較高水平，以至于葉片含梗率相對較低。而高濕和低濕條件下葉片偏薄，這樣會影響到煙葉的彈性及抗拉強度。因此，中濕度條件下煙葉的工業(yè)使用價值較高。由表5 可知，隨著晾制濕度的增加，雪茄煙葉香氣質(zhì)、香氣量、刺激性、燃燒性及總分呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。表明適當(dāng)增加晾制期間環(huán)境濕度有利于提升煙葉感官質(zhì)量，主要表現(xiàn)在香氣量足、香氣質(zhì)好、刺激性小及燃燒性高。

表4 不同晾制濕度雪茄煙葉物理特性比較Tab. 4 Comparison of physical characteristics of cigar tobacco leaves with different air curing humidity

表5 不同晾制濕度雪茄煙葉感官質(zhì)量比較Tab. 5 Comparison of sensory quality of cigar tobacco leaves with different air curing humidity

3 討論

煙草調(diào)制的實質(zhì)是在人為給予特定的溫濕度條件下煙葉脫水干燥與生理生化反應(yīng)相統(tǒng)一的過程。在調(diào)制期間煙葉中蛋白質(zhì)、淀粉、多酚和色素等大分子物質(zhì)的降解是煙葉質(zhì)量風(fēng)格形成的關(guān)鍵[18]。與烤煙相比雪茄煙葉的晾制是煙葉自然凋亡的過程且環(huán)境條件溫和，因此環(huán)境中的濕度對雪茄煙的質(zhì)量形成具有極大影響。本試驗表明，雪茄煙晾制期間濕度條件對煙葉化學(xué)成分有較大影響。晾制后的雪茄煙葉中色素含量不僅影響煙葉的外觀質(zhì)量，還直接或間接地影響煙葉的內(nèi)在品質(zhì)[19]。試驗結(jié)果表明，雪茄煙葉質(zhì)體色素在晾制期間含量逐漸降低，T3 處理葉綠素和類胡蘿卜素含量降解幅度較大，說明在晾制過程中適當(dāng)降低環(huán)境濕度有利于促進質(zhì)體色素充分降解。煙葉糖含量是影響煙氣醇和度和吃味的主要因素，水溶性糖含量高的煙葉富有彈性且色澤鮮亮，但淀粉含量過高會影響煙葉的燃燒速度和香吃味，越低表明轉(zhuǎn)化為單糖越完全[20]。本試驗結(jié)果表明，在晾制過程中雪茄煙葉水溶性糖及淀粉含量均呈下降趨勢，說明晾制期間可溶性糖和淀粉作為呼吸作用的基礎(chǔ)物質(zhì)而被消耗。不同濕度比較，中濕度處理下煙葉總糖和還原糖含量較高，淀粉含量低，且與其它處理達到顯著水平。過高和過低的濕度均不利于晾制期間水溶性總糖的積累以及淀粉的轉(zhuǎn)化，從而對煙葉的香吃味和燃燒性有不良影響，這與柳昕等[21]在白肋煙上的研究結(jié)果相一致。可能是由于中濕度更有利于碳代謝的進行，淀粉酶以及轉(zhuǎn)化酶活性較高，從而促進淀粉等大分子向小分子化合物的轉(zhuǎn)化。

晾制后的雪茄煙葉作為直接卷制的雪茄原料，其煙堿含量對煙葉香味品質(zhì)、風(fēng)格程度和安全性有重要影響[22]。楊煥文等[23]研究表明，深色晾煙品種KY171 在晾制過程中煙堿含量先增加后降低。本試驗表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，晾制期間不同濕度雪茄煙葉煙堿含量呈先升高后降低的趨勢，均在變黃期達到峰值。這可能是由于呼吸作用導(dǎo)致干物質(zhì)損失使其相對含量增加，而后期由于煙堿的降解致使含量降低[24]。本試驗中隨環(huán)境濕度增加，煙葉中煙堿含量逐漸增加，這與李宗平等[25]在白肋煙上的研究不同。原因可能是煙草生物堿屬于植物次生代謝產(chǎn)物，是植物防御機制中的有效物質(zhì)，而本試驗煙葉所處在空間較小的密閉環(huán)境中，隨濕度的增加，煙葉易發(fā)生霉變，導(dǎo)致煙葉需保持較高的生物堿含量來抵御環(huán)境脅迫[26]。同時濕度對生物堿代謝相關(guān)酶活性有一定影響，對煙堿含量造成差異[27]。高濕度下煙堿含量高使得抽吸時刺激性增強，產(chǎn)生辛辣味，低濕度下煙堿含量低則吸食淡而無味。中濕度條件下煙堿和總氮含量處于適宜的水平，能夠給予吸食者以適當(dāng)?shù)纳韽姸群拖愠晕禰28]。氨基酸對調(diào)制后煙葉的色澤、香味和抽吸感覺有重要影響。王樹聲等[29]研究表明煙葉中氨基酸含量與香氣量和勁頭有正相關(guān)關(guān)系，與刺激性和雜氣呈負相關(guān)。李常軍[30]等研究發(fā)現(xiàn)，烤煙在烘烤過程中氨基酸含量在變黃期增加，到定色期含量降低。本試驗結(jié)果表明雪茄煙具有相似的規(guī)律，晾制前期蛋白質(zhì)含量急劇降低，而此時氨基酸含量逐漸升高，這是由于水解酶使蛋白質(zhì)降解成氨基酸，引起氨基酸含量的積累。后期蛋白質(zhì)含量變化趨于穩(wěn)定，而氨基酸含量則開始下降，這可能由于此時氨基酸自身發(fā)生降解，同時與糖發(fā)生非酶棕色化反應(yīng)，致使含量降低[31]。高林等[32]研究表明，白肋煙在中濕度晾制條件下各種酶活性較高，煙葉內(nèi)蛋白質(zhì)降解量較大。這與本試驗研究結(jié)果相一致，高濕或低濕條件下蛋白質(zhì)含量在晾制期間一直保持在較高的水平，而氨基酸含量較低，說明高濕或低濕環(huán)境會使煙葉霉爛或干燥過快而降低蛋白酶活性，不利于煙葉中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化，從而使氨基酸含量較低[32]。中濕度環(huán)境硝酸還原酶活性較高，更有利于蛋白質(zhì)的降解和氨基酸的形成。氨基酸含量較高時，在適宜的濕度條件下容易與糖類物質(zhì)發(fā)生非酶促棕色化反應(yīng)，進而提高煙葉香氣物質(zhì)的含量[21]。

AL 和NI 均是碳代謝中的關(guān)鍵酶類，其活性可作為衡量碳代謝強度的重要指標，可將煙葉生育期積累的淀粉、蔗糖等大分子催化水解為小分子化合物，同時NI 也參與細胞脅迫響應(yīng)[33]，對煙草品質(zhì)起著重要作用。本研究中，隨著晾制的進行，環(huán)境溫度逐漸增加，AL 和NI 活性提高，碳代謝強度增加，碳的固定和轉(zhuǎn)化代謝提高；之后隨著煙葉的緩慢死亡，酶活性逐漸喪失。NR和GS是氮代謝過程中十分重要的酶，其作為植物氮素同化水平的重要生理指標，用于氨基酸、蛋白質(zhì)等含氮化合物的合成[34-35]。本試驗結(jié)果表明，高濕度和低濕度處理均使碳氮代謝關(guān)鍵酶活性一直處于較低的水平，這是因為高濕度環(huán)境煙葉含水率較高，且隨著晾制的進行溫度升高，易導(dǎo)致煙葉霉變，而低濕度處理煙葉失水速率較快，因此兩種條件下煙葉內(nèi)活性氧大量增加，煙葉內(nèi)酶系統(tǒng)紊亂，使煙葉碳氮代謝相關(guān)酶活性較低[36]。因此，晾制期間中濕度環(huán)境使酶活性相對較高，有利于提高煙葉碳氮代謝的能力，保持碳水化合物以及含氮化合物的充分轉(zhuǎn)化，最終促使煙葉各化學(xué)成分協(xié)調(diào)，進而提高煙葉的內(nèi)在品質(zhì)。

4 結(jié)論

在晾制過程中，不同濕度雪茄煙葉AL 和NI 活性先升高后降低，而NR 和GS 活性逐漸降低；煙葉含水率、質(zhì)體色素、碳水化合物、總氮、蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢，煙堿和氨基酸含量呈先升高后降低的變化。處理間比較，中濕度條件下即濕度控制在凋萎期80%～85%、變黃期75%～80%、變褐期70%～75%、定色期65%～70%、干筋期45%～50%范圍內(nèi)，碳氮代謝酶活性以及水溶性糖和氨基酸含量最高，淀粉和蛋白質(zhì)含量最低，從而有助于煙葉內(nèi)碳水化合物及含氮化合物的轉(zhuǎn)化，且總體物理特性較好，感官質(zhì)量更優(yōu)越，提高了調(diào)制后煙葉質(zhì)量。本文研究了不同晾制濕度條件下雪茄煙葉碳氮代謝相關(guān)酶活性及化學(xué)成分的動態(tài)規(guī)律，為優(yōu)化雪茄煙葉晾制工藝提供理論依據(jù)。