實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)對痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的診斷價(jià)值*

柴國祥，李興芳，韓斌孝，王磊，楊永紅，章國平，牛晨霞

（1.蘭州市肺科醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046；2.甘肅省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所，甘肅 蘭州 730050；3.甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

肺結(jié)核 （pulmonary tuberculosis，PTB） 是由結(jié)核分枝桿菌 （mycobacterium tuberculosis，MTB） 引起的經(jīng)由呼吸道傳播的傳染病，目前仍然是全球危害最為嚴(yán)重的慢性傳染病，尤其是對發(fā)展中國家。我國一直以來都是PTB的高負(fù)擔(dān)國，2018年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的報(bào)告顯示，中國結(jié)核病新發(fā)患者約為88.9萬例[1]。因此建立快速準(zhǔn)確檢測結(jié)核病的方法尤為重要。傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法是目前檢驗(yàn)結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，雖然有不同程度的改良，但是檢驗(yàn)周期過長，操作復(fù)雜[2]。噬菌體擴(kuò)增技術(shù)和液體培養(yǎng)技術(shù)，雖然都能夠快速檢測，但操作要求高，技術(shù)復(fù)雜，推廣仍有困難[3-4]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，基于MTB DNA或RNA的快速檢測技術(shù)越來越得到重視，先后出現(xiàn)了以傳統(tǒng)PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的TB-DNA檢測及以半巢式熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的自動(dòng)化核酸擴(kuò)增檢測技術(shù) （Xpert MTB/RIF）。但是兩者的缺陷也很明顯，TB-DNA技術(shù)假陽性高，臨床診斷不準(zhǔn)確[5-6]；Xpert MTB/RIF 價(jià)格昂貴，不適用于基層醫(yī)院推廣[7]。

實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測 （simultaneous amplification and testing，SAT） 技術(shù)具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：①專有的核酸恒溫放大實(shí)時(shí)熒光檢測體系；②更高的擴(kuò)增效率 （30 min內(nèi)擴(kuò)增10億倍），確保更高的檢測敏感性；③活菌檢測技術(shù)。由于RNA 在自然環(huán)境中快速降解，在死亡的病原體中幾乎檢測不到RNA，該方法有效地解決PCR技術(shù)檢測MTB DNA時(shí)導(dǎo)致的假陽性問題[8]。

本研究采用SAT法對疑似結(jié)核病患者痰液進(jìn)行檢測，并與其他檢測方法比較，評價(jià)SAT法對MTB的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月—2018年12月蘭州市肺科醫(yī)院收治的PTB患者和同期接受檢查的無證據(jù)顯示為PTB患者182例為研究對象。經(jīng)臨床確診為活動(dòng)性PTB 115例作為觀察組。其中，男性63例，女性52例；男∶女=1.2∶1.0，平均年齡 （41.6±11.7） 歲。非活動(dòng)性PTB 67例作為對照組。其中，男性42例，女性25例；男∶女=1.7∶1.0，平均年齡 （44.1±15.3） 歲。兩組性別構(gòu)成比、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者家屬簽署知情同意書。

1.2 儀器與設(shè)備

MTB 核酸檢測試劑盒 （RNA 恒溫?cái)U(kuò)增） （上海仁度生物技術(shù)有限公司），MTB rpoB基因和突變檢測試劑盒 （實(shí)時(shí)熒光PCR法） （美國Cepheid公司），MTB核酸檢測試劑盒 （PCR熒光探針法） （湖南圣湘生物科技有限公司），7300 Real-time PCR System （美國ABI公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 痰標(biāo)本堿處理將收集的痰標(biāo)本加入等體積的N-乙酰-L-半胱胺酸-氫氧化鈉 （NALC-NaOH） 溶液進(jìn)行處理，標(biāo)本離心后，用PBS 洗滌1次，分為5份，分別用于集菌涂片法、羅氏培養(yǎng)法、PCR熒光探針法、Xpert MTB/RIF法及SAT法檢測。

1.3.2 MTB檢測根據(jù)《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》[2]進(jìn)行羅氏培養(yǎng)，以及抗酸染色。集菌涂片法、羅氏培養(yǎng)法、PCR熒光探針法及Xpert MTB/RIF法參考相應(yīng)的試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。SAT法：將待檢標(biāo)本置于離心機(jī)中13 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入50 ml 裂解緩沖液后重懸，放入超聲清洗器超聲處理15 min，超聲功率為300 W。設(shè)置陽性對照為活的H37Ra 菌株，陰性對照為無菌水并與待檢標(biāo)本同步檢測。其他步驟參考試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用PEMS 3.0 統(tǒng)計(jì)軟件，以羅氏培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算SAT法敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和約登指數(shù)。計(jì)數(shù)資料以例 （%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以受試者工作特征 （receiver operator characteristic，ROC） 曲線評價(jià)Xpert MTB/RIF法和SAT法檢測對MTB的診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 不同檢測方法檢出MTB 結(jié)果比較

不同方法檢測MTB的結(jié)果見表1。集菌涂片法與羅氏培養(yǎng)法比較，檢出率低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=4.966，P=0.026） ；PCR熒光探針法與羅氏培養(yǎng)法比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=0.285，P=0.594） ；Xpert MTB/RIF法與羅氏培養(yǎng)法比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=0.072，P=0.789） ；SAT法與羅氏培養(yǎng)法比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （χ2=0.018，P=0.893）。

表1 兩組PTB患者經(jīng)不同檢測方法檢出痰液中MTB 情況例 （%）

2.2 PCR熒光探針法、Xpert MTB/RIF法和SAT法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值及約登指數(shù)比較

以羅氏培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，PCR熒光探針法的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、約登指數(shù)分別為：65.96% （95% CI：51.89%，80.02%），70.59% （95% CI：59.48%，81.70%），60.78% （95% CI：46.92%，74.65%），75.00% （95% CI：64.10%，85.90%）和0.37；Xpert MTB/RIF法以上指標(biāo)為：91.49% （95% CI：83.21%，99.77%），91.18% （95% CI：84.26%，98.09%），87.76% （95% CI：78.24%，97.27%），93.94% （95% CI：88.03%，99.85%）和0.83；SAT法以上指標(biāo)為：95.74% （95% CI：89.75%，101.74%），98.53% （95% CI：95.59%，101.46%），97.83% （95% CI：93.45%，102.20%），97.10% （95% CI：93.04%，101.16%）和0.94。見表2。

2.3 Xpert MTB/RIF法和SAT法檢測MTB的可靠性評價(jià)

以羅氏培養(yǎng)法為參照，Xpert MTB/RIF法和SAT法的AUC分別為0.925 （95% CI：0.869，0.981）和0.936 （95% CI：0.883，0.990）。SAT法的AUC 略高于Xpert MTB/RIF法。見圖1。

表2 3種檢測方法對115例PTB患者篩檢結(jié)果例

圖1 Xpert MTB/RIF法和SAT法檢測MTB的ROC曲線

3 討論

本研究以羅氏培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，對幾種不同的檢測MTB 方法進(jìn)行比較。與羅氏培養(yǎng)法的檢出率比較，集菌涂片法檢出率較低，該結(jié)果與成松等[9]的研究結(jié)果基本一致。PCR熒光探針法是建立在PCR技術(shù)上的一種快速檢測MTB技術(shù)，是以DNA為檢測靶標(biāo)，由于DNA 在自然環(huán)境中半衰期較長，不容易降解，容易產(chǎn)生污染，導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)。本研究中，PCR熒光探針法檢出率高于羅氏培養(yǎng)法，但是陽性預(yù)測值較低，僅為60.78%，假陽性率較高。Xpert MTB/RIF法是由美國Cepheid公司開發(fā)一種結(jié)核病診斷技術(shù)，由于靶點(diǎn)是利福平突變序列，因此可以檢測耐藥性，并且實(shí)現(xiàn)診斷過程的自動(dòng)化，操作簡便，檢驗(yàn)周期短。本研究中，Xpert MTB/RIF法檢出率與羅氏培養(yǎng)法比較無差異，檢驗(yàn)效能指標(biāo)敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、約登指數(shù)略低于張燦強(qiáng)等[10]的報(bào)道，但趨勢基本一致，可能受到樣本數(shù)量，實(shí)驗(yàn)操作等因素的影響。Xpert MTB/RIF法各項(xiàng)檢驗(yàn)效能指標(biāo)均優(yōu)于PCR熒光探針法。SAT法是一種新型核酸檢測技術(shù)，該技術(shù)采用M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA 多聚酶進(jìn)行核酸擴(kuò)增，相對于其他核酸擴(kuò)增技術(shù)，反應(yīng)抑制物更少，有效減少假陰性結(jié)果；采用實(shí)時(shí)熒光閉管檢測，使污染得到有效控制，即使污染產(chǎn)生，由于擴(kuò)增產(chǎn)物為RNA，環(huán)境中極易降解，從而大幅度提高檢測結(jié)果的可靠性。其最大的優(yōu)點(diǎn)在于直接以MTB特異性RNA為擴(kuò)增靶標(biāo)，以擴(kuò)增產(chǎn)物RNA為檢測靶標(biāo)，由于RNA 僅在活菌中存在，MTB 死亡后RNA 降解，所以該方法可以作為活動(dòng)性PTB及治療效果的監(jiān)測[11]。本研究中，SAT法的檢出率略低于羅氏培養(yǎng)法，該結(jié)果與FAN 等[12]在2018年的報(bào)道基本一致。其陽性預(yù)測值高于Xpert MTB/RIF法，提示以RNA為模板的Set-TB 法有效降低假陽性率，其他檢驗(yàn)效能指標(biāo)與Xpert MTB/RIF法接近。SAT法各項(xiàng)檢驗(yàn)效能指標(biāo)均優(yōu)于PCR熒光探針法。ROC曲線結(jié)果顯示，2種檢測方法的AUC 較大，均＞0.9，表明兩者對MTB的檢測準(zhǔn)確性較高，具有較高的診斷價(jià)值，并且SAT法的AUC 大于Xpert MTB/RIF法。

綜上所述，SAT法對痰標(biāo)本中MTB的敏感性、特異性和準(zhǔn)確度較高，具有較高的診斷價(jià)值，并能有效降低假陽性率，提高檢測效率，操作簡單，檢測周期短，可以作為臨床診斷參考。