IL-2/GM-CSF體外處理的外周血單個核細胞對再生障礙性貧血小鼠T淋巴細胞亞群及細胞因子的影響*

（廣州市第十二人民醫(yī)院 血液科，廣東 廣州 510620）

再生障礙性貧血（以下簡稱再障）是一種主要由T淋巴細胞免疫紊亂介導(dǎo)的獲得性骨髓造血功能衰竭癥，主要表現(xiàn)為全血細胞減少，可出現(xiàn)較嚴重的感染、貧血及出血。隨著免疫抑制劑治療及造血干細胞移植技術(shù)的發(fā)展，該病的預(yù)后得到大大改善。盡管如此，仍有部分患者對免疫抑制劑治療不耐受、無效[1-2]。本課題組前期應(yīng)用白細胞介素-2（Interleukin-2,IL-2）/粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）體外處理的自體外周血單個核細胞治療約200例再障患者，獲得約80%總有效率及30%完全緩解率，未發(fā)現(xiàn)嚴重不良反應(yīng)，為再障患者提供了開創(chuàng)性的可選擇的療法，但缺乏系統(tǒng)的機制探索[3-7]。T淋巴細胞功能亢進及多種與造血有關(guān)的正負調(diào)控細胞因子分泌異常在再障的發(fā)生、發(fā)展及臨床轉(zhuǎn)歸中起著重要作用。因此，本實驗通過觀察IL-2/GM-CSF體外處理的外周血單個核細胞對再障小鼠T淋巴細胞亞群比例及造血細胞因子水平的影響來探討再障細胞治療的機制，為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

清潔級雌性BALB/c小鼠（H-2d，Mlsb）42只，8～10周齡，體重16～18 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。其中6只不做任何處理的小鼠作為對照組；24只小鼠復(fù)制免疫介導(dǎo)模型后作為模型組和干預(yù)組，模型組12只小鼠輸注生理鹽水，干預(yù)組12只小鼠輸注細胞。剩余12只小鼠采集外周血單個核細胞。清潔級DBA/2小鼠（H-2d，Mlsa）3只，雌雄兼用，6～14周齡，體重16～20 g，作為胸腺、淋巴結(jié)細胞供體，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供。動物許可證號：SCXK（粵）2013-0002。

1.2 模型復(fù)制

依據(jù)參考文獻[8]和[9]，將3只DBA/2小鼠頸椎脫臼處死，常規(guī)消毒，無菌取出胸腺及頸部、頜下、腸系膜等處淋巴結(jié)，分別獲胸腺、淋巴結(jié)細胞懸液，細胞濃度為5×106個/ml，按胸腺細胞與淋巴結(jié)細胞1∶2 混合，獲得胸腺淋巴結(jié)細胞懸液。用臺盼藍鑒定細胞活性，活性細胞＞95%。雌性BALB/c小鼠經(jīng)5.5 Gy（1.1 Gy/min，5 min）60Co γ-射線全身照射，照射后4 h 內(nèi)經(jīng)尾靜脈注入DBA/2小鼠胸腺淋巴結(jié)細胞（1×106個/只）。小鼠照射后立即移入SPF級無菌層流室內(nèi)，飲用加入慶大霉素（40萬u/L）和二性霉素B（50 mg/L）的高壓滅菌水。

1.3 外周血單個核細胞分離、培養(yǎng)

參考課題組前期動物實驗方法[10]，將12只健康BALB/c小鼠頸椎脫臼處死，常規(guī)消毒，無菌心臟采血，分離單個核細胞。加入含10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司），添加小鼠IL-2（2 ng/ml）、GM-CSF（1 ng/ml）、鈣離子載體（100 ng/ml）（美國Sigma公司）等刺激因子，置于37℃、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。

1.4 細胞輸注

參考課題組前期動物實驗方法[10]并優(yōu)化方案，收集上述培養(yǎng)后的細胞，調(diào)整細胞濃度為5×106個/ml，干預(yù)組再障小鼠模型復(fù)制第1、2、4及6 天經(jīng)尾靜脈各輸注1次，每只小鼠輸注細胞數(shù)為1×106個（0.2 ml）/次。模型組小鼠每次輸注等體積無菌生理鹽水。對照組小鼠不做任何處理。

1.5 觀察指標及結(jié)果分析

每日觀察并記錄小鼠活力、形態(tài)、飲食、體重等一般情況。于模型復(fù)制第7、14、21及28天斷尾采血檢測外周血WBC、Hb及PLT。于模型復(fù)制第28天或瀕死時處死小鼠，對照組小鼠也同步處死。取股骨沖洗，收集骨髓計數(shù)有核細胞（粒系、紅系和淋巴細胞比例及巨核細胞數(shù)），摘眼球采血用流式細胞儀檢測外周血CD3+CD4+（T 輔助細胞、Th 細胞）、CD3+CD8+（T 抑制細胞、Ts細胞）及CD4+CD25+CD127-（調(diào)節(jié)性T細胞、T-regs）細胞比例（小鼠單克隆抗體購自美國Becton Dickinson公司），采用ELISA 法檢測血清中TNF-α、γ 干擾素（IFN-γ）水平，ELISA試劑盒購自奧地利Bender Medsystems公司。

通過比較各組小鼠一般情況及外周血細胞計數(shù)、骨髓有核細胞計數(shù)了解再障模型復(fù)制是否成功，了解干預(yù)組小鼠骨髓造血是否改善。通過比較各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群比例及造血細胞因子水平，尋找規(guī)律，探索機制。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差 （±s）表示，比較用方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞輸注對再障小鼠一般情況的影響

對照組、模型組、干預(yù)組小鼠模型復(fù)制前體重分別為（17.1±0.8）、（17.2±0.7）和（17.1±0.6）g，經(jīng)方差分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.068，P=0.934）。模型組和干預(yù)組模型復(fù)制后較對照組一般情況差，且行動遲緩、弓背、豎毛及食量減少。模型復(fù)制第7天，模型組和干預(yù)組飲食、飲水明顯減少，體重減少。模型復(fù)制第14天，干預(yù)組一般情況逐漸好轉(zhuǎn)，活動增多，弓背、豎毛逐漸好轉(zhuǎn)，飲食、飲水量增加，體重增加；模型組小鼠一般情況無改善，且開始出現(xiàn)死亡。對照組、模型組、干預(yù)組小鼠模型復(fù)制第28天體重分別為（22.1±0.8）、（18.9±0.8）和（21.5±0.7）g，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=36.844，P=0.000）；模型組較對照組和干預(yù)組輕（P＜0.05），干預(yù)組接近對照組（P＞0.05）。模型組共死亡4只，干預(yù)組無死亡。

2.2 細胞輸注對再障小鼠外周血細胞計數(shù)的影響

各組小鼠不同時間點外周血WBC比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和干預(yù)組較對照組低（P＜0.05），干預(yù)組在第21和28天較模型組高（P＜0.05）。見表1。

各組小鼠不同時間點外周血PLT比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和干預(yù)組較對照組低（P＜0.05），干預(yù)組在第21和28天較模型組高（P＜0.05）。見表2。

各組小鼠第7天外周血Hb比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組小鼠第14、21和28天外周血Hb水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和干預(yù)組較對照組低（P＜0.05），干預(yù)組在第28天較模型組高（P＜0.05）。見表3。

表1 各組小鼠不同時間點外周血WBC比較 （×109/L，±s）

表1 各組小鼠不同時間點外周血WBC比較 （×109/L，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別 第7天 第14天 第21天 第28天對照組 8.4±1.4 7.6±0.8 8.2±1.3 8.2±1.3模型組 3.6±0.9① 2.9±1.1① 2.5±0.8① 2.4±0.6①干預(yù)組 3.6±0.8① 2.9±1.0① 4.6±1.0①② 5.6±1.3①②F值 57.041 52.060 64.959 46.743 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表2 各組小鼠不同時間點外周血PLT比較 （×109/L，±s）

表2 各組小鼠不同時間點外周血PLT比較 （×109/L，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別 第7天 第14天 第21天 第28天對照組 529.8±47.0 583.2±55.4 555.0±47.6 571.5±73.8模型組 122.7±22.8① 103.7±21.7① 100.2±20.3① 96.7±22.5①干預(yù)組 128.3±20.8① 118.0±20.0① 285.4±38.5①② 397.6±40.0①②F值 493.196 580.010 310.146 198.409 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 各組小鼠不同時間點外周血Hb比較 （g/L，±s）

表3 各組小鼠不同時間點外周血Hb比較 （g/L，±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別 第7天 第14天 第21天 第28天對照組 150.7±16.1 157.4±15.3 158.7±16.7 154.0±14.6模型組 147.2±14.0 122.5±18.7① 110.7±15.3① 109.0±16.7①干預(yù)組 145.7±15.7 126.6±16.9① 116.1±18.7① 134.6±18.7①②F值 0.224 8.690 16.520 12.058 P值 0.800 0.001 0.000 0.000

2.3 細胞輸注對再障小鼠骨髓有核細胞計數(shù)的影響

各組小鼠骨髓粒系比例、紅系比例、淋巴細胞比例及巨核細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；模型組和干預(yù)組粒系比例、紅系比例及巨核細胞數(shù)較對照組低，淋巴細胞比例較對照組高（P＜0.05），結(jié)合上述模型組一般情況差和外周血細胞計數(shù)降低，提示再障模型復(fù)制成功。干預(yù)組骨髓粒系比例、紅系比例及巨核細胞數(shù)較模型組高，淋巴細胞比例較模型組低（P＜0.05），結(jié)合上述干預(yù)組小鼠一般情況改善和外周血細胞計數(shù)升高，提示干預(yù)組小鼠骨髓造血改善。見表4。

2.4 細胞輸注對再障小鼠外周血T淋巴細胞亞群比例的影響

各組小鼠外周血Th 細胞比例、T-regs細胞比例及Ts細胞比例比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組Th 細胞比例、T-regs細胞比例較對照組低（P＜0.05），Ts細胞比例較對照組高（P＜0.05）；干預(yù)組Th 細胞比例、T-regs細胞比例較模型組高，Ts細胞比例較模型組低（P＜0.05）；干預(yù)組與對照組小鼠外周血Th 細胞比例、T-regs細胞比例及Ts細胞比例比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

2.5 細胞輸注對再障小鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平的影響

各組小鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。模型組較對照組高（P＜0.05），干預(yù)組較模型組低（P＜0.05）；干預(yù)組與對照組小鼠外周血TNF-α、IFN-γ水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表4 各組小鼠骨髓粒系比例、紅系比例、淋巴細胞比例及巨核細胞數(shù)比較 （±s）

表4 各組小鼠骨髓粒系比例、紅系比例、淋巴細胞比例及巨核細胞數(shù)比較 （±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別 n 骨髓粒系比例/% 紅系比例/% 淋巴細胞比例/% 巨核細胞數(shù)/個對照組 6 56.5±2.2 20.3±2.4 22.1±1.6 40.2±2.9模型組 8 18.7±1.6① 9.4±1.4① 69.7±4.3① 5.9±2.0①干預(yù)組 12 38.7±2.7①② 15.1±1.7①② 43.9±3.4①② 28.7±3.5①②F值 475.755 64.919 338.065 255.692 P值 0.000 0.000 0.000 0.000

表5 各組小鼠外周血Th 細胞比例、T-regs細胞比例及Ts細胞比例和TNF-α、IFN-γ水平比較 （±s）

表5 各組小鼠外周血Th 細胞比例、T-regs細胞比例及Ts細胞比例和TNF-α、IFN-γ水平比較 （±s）

注：①與對照組比較，P＜0.05；②與模型組比較，P＜0.05。

組別 n Th 細胞比例/% T-regs細胞比例/% Ts細胞比例/% TNF-α/（ng/L）IFN-γ/（ng/L）對照組 6 37.1±2.8 8.5±1.6 13.6±2.7 330.4±45.7 267.7±43.9模型組 8 23.3±2.5① 3.7±1.1① 25.5±2.5① 543.3±97.2① 355.5±58.7①干預(yù)組 12 34.3±3.4② 7.2±1.3② 15.9±3.8② 351.8±47.1② 282.1±32.4②F值 44.419 26.065 29.839 25.088 8.826 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.001

3 討論

再障發(fā)病機制極為復(fù)雜，主要涉及免疫功能紊亂、造血微環(huán)境異常和造血干/祖細胞缺陷，其中T淋巴細胞免疫功能紊亂導(dǎo)致造血干/祖細胞損傷是發(fā)病的主要環(huán)節(jié)[11-12]。目前認為T細胞可通過以下3種重要途徑導(dǎo)致骨髓衰竭：①直接損傷造血干/祖細胞，抑制其增殖；②造成細胞因子分泌紊亂，正負調(diào)控造血細胞因子失調(diào)，尤其是IFN-γ、TNF-α 等造血抑制因子明顯升高，參與抑制造血；③直接或通過造血細胞因子間接誘導(dǎo)造血干細胞或祖細胞發(fā)生凋亡[11-12]。T淋巴細胞功能亢進及多種與造血有關(guān)的正負調(diào)控細胞因子分泌異常在再障的發(fā)生、發(fā)展及臨床轉(zhuǎn)歸中起著重要作用。因此，本實驗擬通過觀察IL-2/GM-CSF體外處理的外周血單個核細胞對再障小鼠T淋巴細胞亞群比例及造血細胞因子水平的影響，來探討再障細胞治療的機制。

本研究成功復(fù)制了再障小鼠模型，再障小鼠模型復(fù)制后一般情況較差，行動遲緩、弓背及豎毛，飲食、飲水減少，體重減輕，外周血細胞計數(shù)減少，骨髓粒系比例、紅系比例及巨核細胞數(shù)下降，淋巴細胞比例升高。其中接受細胞輸注的干預(yù)組小鼠，模型復(fù)制第14天一般情況開始好轉(zhuǎn)，第21天外周血細胞水平開始改善，第28天體重及外周血細胞水平、骨髓有核細胞比例均升高，而模型組小鼠一般情況無改善，外周血細胞水平及骨髓有核細胞比例均無改善。結(jié)果表明，輸注IL-2/GM-CSF體外處理的外周血單個核細胞后再障小鼠骨髓造血功能得到顯著改善。

有研究表明，再障患者體內(nèi)CD8+T淋巴細胞（Ts細胞）數(shù)量增加、功能增強，是骨髓造血衰竭的直接原因；活化的Ts細胞通過釋放穿孔素、顆粒酶B 等直接殺傷造血細胞，同時還分泌IFN-γ、TNF-α 等造血負調(diào)控細胞因子，表達上調(diào)的負調(diào)控因子一方面直接抑制造血細胞的增殖、分化，另一方面誘導(dǎo)造血細胞發(fā)生凋亡；活化的Ts細胞還通過Fas/FasL 通路的異?；罨閷?dǎo)骨髓單個核細胞凋亡，直接損傷造血干細胞或組細胞[13-16]。

有研究也證實，CD4+T淋巴細胞平衡紊亂也是再障骨髓造血衰竭的重要原因，包括Th 細胞（Th1 細胞、Th2 細胞）、T-regs細胞比例失衡等；T-regs細胞通過抑制自身反應(yīng)性效應(yīng)T細胞來控制自身免疫的發(fā)生、發(fā)展，再障患者體內(nèi)Thl 比例明顯增高，T-regs細胞數(shù)量降低、功能減弱，免疫抑制功能缺陷導(dǎo)致對效應(yīng)T細胞的免疫監(jiān)控能力下降，從而介導(dǎo)骨髓造血功能損傷[17-20]。淋巴細胞亞群紊亂導(dǎo)致再障患者血液中造血負調(diào)控細胞因子IFN-γ、TNF-α 等顯著上調(diào)，加重免疫炎癥反應(yīng)，進一步促進再障的發(fā)生、發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠外周血Th 細胞、T-regs細胞比例較對照組降低，Ts細胞比例較對照組升高，TNF-α、IFN-γ水平較對照組升高，而干預(yù)組Th 細胞、T-regs細胞比例較模型組升高，Ts細胞比例較模型組降低，TNF-α、IFN-γ水平較模型組降低。該結(jié)果提示，T淋巴細胞亞群紊亂、T細胞異常活化及造血負調(diào)控細胞因子水平升高參與模型復(fù)制后再障小鼠疾病的發(fā)生、發(fā)展，而細胞輸注有助于上調(diào)Th 細胞比例、Ts細胞比例，下調(diào)T-regs細胞比例及造血負調(diào)控細胞因子TNF-α、IFN-γ，從而發(fā)揮其促造血作用。

綜上所述，本研究提示輸注IL-2/GM-CSF體外處理的外周血單個核細胞有助于調(diào)節(jié)再障小鼠T淋巴細胞亞群紊亂、下調(diào)造血負調(diào)控細胞因子，從而改善骨髓造血功能，為自體外周血單個核細胞治療再障患者的臨床研究提供了理論依據(jù)。