普通級(jí)實(shí)驗(yàn)犬微生物學(xué)、寄生蟲(chóng)學(xué)控制標(biāo)準(zhǔn)介紹

盛雅潔，肖春蘭，趙麗娟，周正宇

（蘇州大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，江蘇 蘇州 215123）

犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在解剖、生理以及代謝等生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域中起著至關(guān)重要的作用，因此廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)科學(xué)研究[1]。但是實(shí)驗(yàn)犬的飼養(yǎng)往往多采用群體飼養(yǎng)，容易感染狂犬病、布魯桿菌以及弓形蟲(chóng)感染等一系列人畜共患病，這些人畜共患病不僅直接影響到實(shí)驗(yàn)犬的健康，還會(huì)對(duì)相關(guān)工作人員生命健康造成一定的威脅[2]。實(shí)驗(yàn)犬的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)在提高實(shí)驗(yàn)犬的質(zhì)量、保障相關(guān)科學(xué)研究中起了至關(guān)重要的作用。微生物學(xué)、寄生蟲(chóng)學(xué)質(zhì)量控制是衡量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的主要標(biāo)準(zhǔn)之一。關(guān)于實(shí)驗(yàn)犬質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，包括微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)控制標(biāo)準(zhǔn)[3]。該標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)犬檢測(cè)技術(shù)與檢測(cè)體系的發(fā)展，并達(dá)到了一定的標(biāo)準(zhǔn)化水平[4]。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)犬的微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)以及具體檢測(cè)方法進(jìn)行了相應(yīng)的整理歸納。

1 檢測(cè)規(guī)則

根據(jù)國(guó)標(biāo)要求，普通級(jí)實(shí)驗(yàn)犬每3個(gè)月至少檢測(cè)1次，要求選取成年動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)。此外，國(guó)標(biāo)對(duì)選取動(dòng)物數(shù)量也進(jìn)行了規(guī)定，取樣數(shù)量由生產(chǎn)繁殖單元大小決定，要求群體大?。?00只時(shí)，取樣數(shù)量應(yīng)＞5只；群體大小在100～500只時(shí)，取樣數(shù)量＞10只；群體大?。?00只時(shí)，要求取樣數(shù)量＞20只。此外，在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，還往往要求取樣時(shí)雌雄各半，因?yàn)榇菩詣?dòng)物跟雄性動(dòng)物對(duì)不同病原體的敏感程度存在一定的差異。

2 采樣方法

首先對(duì)待檢實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行編號(hào)，然后進(jìn)行外觀檢查，之后對(duì)不同病原體采取分別進(jìn)行取樣，包括皮膚毛發(fā)，血液以及糞便或者肛拭子。

2.1 毛發(fā)取樣

采取用透明膠帶粘取犬的毛發(fā)或者直接用鑷子在實(shí)驗(yàn)犬的易感染部位拔取少許被毛，散放于載玻片上，用透明膠帶壓?。ɑ蚣右坏紊睇}水后，覆以蓋玻片），編號(hào)待檢。

2.2 刀片刮取皮層物取樣

檢測(cè)皮層內(nèi)寄生螨類(lèi)時(shí)還需用刀片刮取動(dòng)物潰瘍部位深層碎屑或擠破膿瘡取其內(nèi)容物，置于載玻片上，滴加氫氧化鈉液化或者甘油使之透明后編號(hào)待檢。

2.3 采血

國(guó)標(biāo)推薦的采血方式為耳部無(wú)菌采血，但是實(shí)際操作中犬前肢臂頭靜脈更粗一點(diǎn)，并且位置好找，容易操作，往往采用前肢臂頭靜脈采血。血液需4℃冰箱過(guò)夜后分離血清，56℃恒溫水浴滅活30 min后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.4 糞便或肛拭子

采集時(shí)應(yīng)采集新鮮糞便或直接用無(wú)菌棉簽采集肛拭子，置于無(wú)菌離心管中編號(hào)待檢。

3 檢測(cè)項(xiàng)目及標(biāo)準(zhǔn)

包括微生物學(xué)和寄生蟲(chóng)學(xué)控制標(biāo)準(zhǔn)，具體檢測(cè)項(xiàng)目、檢測(cè)依據(jù)及技術(shù)要求見(jiàn)表1。

表1 普通級(jí)實(shí)驗(yàn)犬質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)及要求

3.1 微生物學(xué)質(zhì)量控制

普通級(jí)實(shí)驗(yàn)犬的病原菌必須檢測(cè)項(xiàng)目包括沙門(mén)菌、皮膚病原真菌、布魯桿菌，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分別為GB/T14926.1-2001,GB/T14926.4-2001以及GB/T14926.45-2001。

犬沙門(mén)菌又稱犬副傷寒，是一種常見(jiàn)的人畜共患病，臨床癥狀主要為嘔吐、腹瀉[5]。實(shí)驗(yàn)犬沙門(mén)菌的檢測(cè)通常采集糞便或肛拭子，然后接種SS或DHL培養(yǎng)基進(jìn)行直接分離培養(yǎng)，或者接種SF增菌液后轉(zhuǎn)至SS或DHL培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，挑選可疑菌落增菌后通過(guò)菌落形態(tài)、菌體特征以及生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定。沙門(mén)菌在DHL和SS培養(yǎng)基上均形成無(wú)色透明表面光滑濕潤(rùn)的菌落，部分菌落帶黑心。顯微鏡下沙門(mén)菌為革蘭陰性桿菌，無(wú)芽孢，無(wú)莢膜。生化反應(yīng)包括硫化氫試驗(yàn)、靛基質(zhì)試驗(yàn)、尿素培養(yǎng)基試驗(yàn)、氰化鉀培養(yǎng)及試驗(yàn)以及賴氨酸脫氫酶培養(yǎng)基試驗(yàn)，目前很多檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)多采用了全自動(dòng)或半自動(dòng)微生物檢定儀進(jìn)行鑒定，雖然前期儀器成本較為昂貴，但是可以更加方便快捷準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，節(jié)省了不少人力物力。

皮膚病原真菌感染犬容易引起真菌性皮膚病，出現(xiàn)脫毛、皮膚瘙癢等癥狀。犬孢子菌和須毛癬菌是感染犬的最常見(jiàn)皮膚病原真菌[6]。皮膚病原真菌的檢測(cè)則是刮取動(dòng)物皮毛、鱗屑直接涂片或者通過(guò)培養(yǎng)基分離培養(yǎng)然后觀察菌落形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)。直接檢查是將樣本置于載玻片后滴加氫氧化鉀二甲基亞砜液，蓋上蓋玻片10～15 min后顯微鏡下觀察。分離培養(yǎng)則是將樣本接種沙氏培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)7～14 d后觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行涂片鏡檢。

布魯桿菌是一種胞內(nèi)寄生的病原菌，主要感染犬的淋巴系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)，也是一種較為嚴(yán)重的人畜共患病[7]。布魯桿菌的檢測(cè)則是通過(guò)血清學(xué)方法進(jìn)行，“S（光滑）型”和“R（粗糙）型”布魯桿菌是犬必須排除的病原菌，國(guó)標(biāo)根據(jù)布魯桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗原與犬血清試管凝集效價(jià)判定犬是否感染布魯桿菌。試驗(yàn)方法包括“S”抗原試管凝集試驗(yàn)以及“R”抗原試管凝集試驗(yàn)。國(guó)標(biāo)要求通過(guò)檢測(cè)血清中布魯桿菌抗體來(lái)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)犬是否感染布魯桿菌，檢測(cè)結(jié)果要求陰性。此外，中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物協(xié)會(huì)還建立了布魯桿菌檢測(cè)的PCR方法的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，可以更為準(zhǔn)確地檢測(cè)犬的布魯桿菌。

普通級(jí)實(shí)驗(yàn)犬的病毒檢測(cè)項(xiàng)目包括狂犬病病毒、犬細(xì)小病毒、傳染性犬肝炎病毒以及犬瘟熱病毒。這4種病毒均是急性、烈性、高度接觸性傳染病，犬一旦感染，很容易引起傳染及死亡[8]。檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分別為GB/T14926.56-2008、GB/T14926.57-2008、GB/T14926.58-2008以及GB/T14926.59-2001。值得注意的是只有犬瘟熱病毒的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是在2001年發(fā)布后未經(jīng)重新修訂過(guò)，其余三個(gè)均是在2001年頒布標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上于2008年經(jīng)修訂后重新發(fā)布，并增加了基礎(chǔ)級(jí)犬的群體免疫抗體合格率。

狂犬病毒國(guó)標(biāo)推薦的檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫吸附法，犬肝炎病毒以及犬細(xì)小病毒檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以及血凝抑制試驗(yàn)，犬瘟熱病毒的檢測(cè)方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以及免疫酶試驗(yàn)方法。這幾種方法均為血清學(xué)方法，由于所有普通級(jí)實(shí)驗(yàn)犬均需要免疫，需要通過(guò)檢測(cè)血清中病毒抗體水平來(lái)衡量免疫效果，要求血清中病毒抗體陽(yáng)性，因此檢測(cè)需采用血清學(xué)方法進(jìn)行，不能夠用PCR等方法進(jìn)行替代，國(guó)標(biāo)要求經(jīng)檢測(cè)后抗體效價(jià)達(dá)到陽(yáng)性為合格，其中基礎(chǔ)級(jí)犬群體免疫抗體合格率達(dá)到70%以上則可判斷為該犬群免疫合格，計(jì)算方式如下：免疫抗體合格率=（被檢動(dòng)物抗體陽(yáng)性數(shù)/被檢動(dòng)物總數(shù)）×100%。

3.2 寄生蟲(chóng)學(xué)質(zhì)量控制

普通級(jí)實(shí)驗(yàn)犬的寄生蟲(chóng)學(xué)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)包括體外寄生蟲(chóng)（節(jié)肢動(dòng)物）以及弓形蟲(chóng)，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)分別為GB/T18448.1-2001以及GB/T18448.2-2008。進(jìn)行體外寄生蟲(chóng)檢測(cè)應(yīng)先進(jìn)行肉眼觀察，體外寄生蟲(chóng)感染嚴(yán)重時(shí)，可引起犬的脫毛、毛糙甚至由瘙癢引起潰瘍、結(jié)痂。檢查時(shí)首先進(jìn)行外觀檢查，尤其要注意耳根、頸后、眼周、腹股溝等易感部位，然后直接拔毛進(jìn)行取樣或者用透明膠帶粘取毛發(fā)進(jìn)行取樣，顯微鏡下觀察是否有體外寄生進(jìn)行判定，發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)卵、幼蟲(chóng)、若蟲(chóng)、成蟲(chóng)等均判為陽(yáng)性。

犬的弓形蟲(chóng)感染一般為隱性感染，但是當(dāng)機(jī)體免疫力減弱時(shí)會(huì)出現(xiàn)高熱稽留、食欲不振、嘔吐、呼吸困難等臨床癥狀[9]。國(guó)標(biāo)弓形蟲(chóng)的檢測(cè)方法則是通過(guò)血清學(xué)方法進(jìn)行采用間接血凝法（IHA）或者間接免疫熒光法，其原理均為抗原抗體特異性反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，檢測(cè)血清中弓形蟲(chóng)抗體，結(jié)果要求陰性。

4 小結(jié)

在檢測(cè)過(guò)程中，檢測(cè)方法不同、檢測(cè)人員的水平均可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成一定的差異，因此，所有檢測(cè)結(jié)果為不合格的病原體均需采用相同或者不同方法重新進(jìn)行檢測(cè)。此外，隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)技術(shù)體系的不斷發(fā)展，很多更為方便、更為準(zhǔn)確的方法已用于實(shí)驗(yàn)犬的檢測(cè)中來(lái)，需要檢測(cè)人員不斷學(xué)習(xí)。

建立質(zhì)量檢測(cè)體系并嚴(yán)格按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)犬質(zhì)量的有效保證。目前，我國(guó)實(shí)驗(yàn)犬質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)已沿用多年，該標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施促進(jìn)了我國(guó)實(shí)驗(yàn)犬質(zhì)量的發(fā)展，但是伴隨著檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，實(shí)驗(yàn)犬的微生物學(xué)與寄生蟲(chóng)學(xué)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也需要進(jìn)行修訂和完善，使之更適用于今后的實(shí)驗(yàn)犬質(zhì)量的檢測(cè)。