用于臨床新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的分子診斷新技術(shù)

謝春梅，武海萍，馬雪萍，周?chē)?guó)華,2

綜 述

用于臨床新型冠狀病毒核酸檢測(cè)的分子診斷新技術(shù)

謝春梅1，武海萍1，馬雪萍1，周?chē)?guó)華1,2

1. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)臨床藥學(xué)科，南京 210002 2. 南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州 510515

目前新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019, COVID-19)在全球仍呈現(xiàn)大流行趨勢(shì)，該病潛伏期長(zhǎng)、傳染性強(qiáng)，給全世界人民的健康安全帶來(lái)嚴(yán)重威脅。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)核酸檢測(cè)作為COVID-19確診的重要依據(jù)之一，在疫情防控工作中發(fā)揮了巨大的作用。截至2020年8月17日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局已應(yīng)急批準(zhǔn)15個(gè)新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒，其中10個(gè)試劑盒是以逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)為主要技術(shù)原理，其余試劑盒分別采用了不同于RT-qPCR的5種分子診斷技術(shù)。本文對(duì)上述檢測(cè)試劑盒所使用的技術(shù)原理、反應(yīng)時(shí)間、優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行了介紹，以期為COVID-19及類(lèi)似傳染病的快速篩查、確診、防控提供更多的方案思路。

新型冠狀病毒；核酸檢測(cè)；分子診斷

2019年12月，湖北省武漢市報(bào)道了數(shù)例以咳嗽、發(fā)燒、肺部感染為主要癥狀的不明原因肺炎，且存在明顯的人傳人現(xiàn)象。2020年1月經(jīng)分離鑒定，確認(rèn)導(dǎo)致該病的病原體為新型冠狀病毒[1]。2月11日，國(guó)際病毒分類(lèi)學(xué)委員會(huì)將該病毒正式命名為SARS-CoV-2 (severe acute respiratory syndrome co-ronavirus 2)，同日，世界衛(wèi)生組織將其引發(fā)的新型冠狀病毒病命名為COVID-19 (corona virus disease 2019)。截至2020年8月17日，中國(guó)累計(jì)確診病例9萬(wàn)例，現(xiàn)存確診614例，現(xiàn)存無(wú)癥狀感染者356例。雖然疫情在國(guó)內(nèi)得到了有效控制，但近日美國(guó)、巴西等國(guó)家的感染人數(shù)暴增，全球累計(jì)確診病例已超過(guò)2500萬(wàn)例，死亡人數(shù)接近85萬(wàn)人。COVID-19已具有全球大流行趨勢(shì)[2]，疫情的爆發(fā)使全世界人民的健康安全及公共衛(wèi)生財(cái)產(chǎn)面臨巨大挑戰(zhàn)。

研究報(bào)道，SARS-CoV-2是含有包膜的正義單鏈RNA病毒，此前在人體中從未被發(fā)現(xiàn)，是一種全新的β屬冠狀病毒。SARS-CoV-2基因組約由3萬(wàn)個(gè)核苷酸組成，與人類(lèi)SARS-CoV的核苷酸具有82%的同源性[3]，主要含有6個(gè)功能性開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)/蛋白編碼區(qū)：ORF1a/b、S、E、M、N[3](圖1)。SARS-CoV-2侵入人體宿主細(xì)胞的方式與人SARS-CoV一致，由細(xì)胞膜上血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (ACE2)受體介導(dǎo)[4]，ACE2受體廣泛存在于口腔、呼吸道和結(jié)腸等部位的黏膜細(xì)胞，因此無(wú)防護(hù)措施下與外界環(huán)境相通的口腔、呼吸道、眼瞼等部位極易因暴露而感染[5]。

此次COVID-19潛伏期較長(zhǎng)、傳染性強(qiáng)，疫情爆發(fā)期間亟需開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的診斷技術(shù)，早確診、早隔離、早治療可幫助病人被盡早治愈。初期研究人員通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)最先檢出病毒并將其作為確診途徑[6]，但該技術(shù)成本高且費(fèi)時(shí)，不滿(mǎn)足大規(guī)模檢測(cè)的需求，而核酸檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏、高特異、結(jié)果可定量等優(yōu)勢(shì)，為COVID-19的確診及疫情防控提供了極大幫助，截至2020年8月17日，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局應(yīng)急批準(zhǔn)的23個(gè)新型冠狀病毒檢測(cè)產(chǎn)品中囊括了15個(gè)核酸檢測(cè)試劑盒。本文主要綜述了目前國(guó)內(nèi)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀，以期為COVID-19的快速篩查、確診提供更多的方案思路，同時(shí)提高公共衛(wèi)生領(lǐng)域?qū)OVID-19等傳染性疾病的防控能力。

1 逆轉(zhuǎn)錄—實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT- qPCR)核酸檢測(cè)技術(shù)

美國(guó)生物化學(xué)家Kary Mullis于1985年首次提出聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)——一種在體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)[7]。SARS-CoV-2為RNA病毒，需先將目標(biāo)片段逆轉(zhuǎn)錄為cDNA再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，首先針對(duì)目標(biāo)片段設(shè)計(jì)一對(duì)上下游引物，在DNA聚合酶的作用下，通過(guò)熱變性、退火、延伸等步驟按照半保留復(fù)制的機(jī)制完成新的DNA合成，新合成的DNA也可以作為模板，不斷重復(fù)這一過(guò)程，目標(biāo)片段的合成量將呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在普通PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上增加了化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，最常用的為T(mén)aqMan探針?lè)ǎ砣鐖D2所示，探針的5?端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3?端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，在熒光諧振能量傳遞(fluo-rescence resonance energy transfer, FRET)效應(yīng)下，熒光呈現(xiàn)淬滅狀態(tài)。當(dāng)目標(biāo)片段擴(kuò)增時(shí)，酶對(duì)探針進(jìn)行切割，熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，發(fā)出熒光，利用專(zhuān)門(mén)儀器測(cè)定熒光到達(dá)一定閾值所需的循環(huán)數(shù)(值)即可對(duì)初始模板進(jìn)行精確定量。

由于RNA病毒容易發(fā)生變異，RT-qPCR技術(shù)用于檢測(cè)SARS-CoV-2時(shí)一般會(huì)在ORF1ab、S、N、E 等基因中選取多個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，防止出現(xiàn)漏檢錯(cuò)檢，從而提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。RT-qPCR技術(shù)可以高靈敏、高特異地完成SARS-CoV-2的檢測(cè)，易于在臨床上推廣普及，成為《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中首推的檢測(cè)方法[8]。截至2020年8月17日，國(guó)家藥監(jiān)局已應(yīng)急批準(zhǔn)10個(gè)以RT-qPCR技術(shù)為主要原理的核酸檢測(cè)試劑盒，其中大部分試劑盒選擇SARS-CoV-2的多個(gè)基因作為檢測(cè)靶標(biāo)，以提高檢測(cè)準(zhǔn)確率。

然而，在臨床實(shí)際診斷過(guò)程中，出現(xiàn)了RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果為假陽(yáng)性及假陰性的問(wèn)題，分析產(chǎn)生假陽(yáng)性的原因如下：(1)樣本轉(zhuǎn)運(yùn)、提取過(guò)程中被污染；(2)引物設(shè)計(jì)不當(dāng)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；(3)閾值設(shè)置過(guò)低導(dǎo)致假陽(yáng)性判讀結(jié)果；而產(chǎn)生假陰性的原因如下：(1)病毒基因組變異，影響與原先設(shè)計(jì)引物/探針的結(jié)合；(2)感染早期，采樣部位所含病毒量低于檢測(cè)限；(3)樣本轉(zhuǎn)運(yùn)、保存過(guò)程不規(guī)范；(4)檢測(cè)人員操作不當(dāng)、儀器設(shè)備等因素；(5)試劑存在質(zhì)量問(wèn)題或者不同試劑盒提取擴(kuò)增效率不一致；(6)閾值設(shè)置過(guò)高導(dǎo)致假陰性判讀結(jié)果。據(jù)報(bào)道，目前RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)SARS-CoV-2感染的準(zhǔn)確率僅達(dá)到30%~50%[9]，因此亟需研究開(kāi)發(fā)出準(zhǔn)確度更高、效果更好的核酸檢測(cè)技術(shù)。

2 非RT-qPCR核酸檢測(cè)技術(shù)

目前針對(duì)SARS-CoV-2的核酸檢測(cè)大多通過(guò)RT-qPCR技術(shù)進(jìn)行，由于需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員及精密的溫控設(shè)備，不斷升降溫導(dǎo)致反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，檢測(cè)速度較慢且存在假陽(yáng)性及假陰性問(wèn)題，世界衛(wèi)生組織已于2020年2月明確指出“開(kāi)發(fā)準(zhǔn)確并且使用簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急”。我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局為進(jìn)一步滿(mǎn)足疫情防控的需求，已應(yīng)急批準(zhǔn)以下5種原理不同于RT-qPCR技術(shù)的核酸檢測(cè)試劑盒，各試劑盒所使用的檢測(cè)技術(shù)和靶標(biāo)如表1所示。

圖1 SARS-CoV-2基因組結(jié)構(gòu)模式及常見(jiàn)的引物擴(kuò)增位置

橙色位置為擴(kuò)增片段擴(kuò)增位置。

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(TaqMan探針?lè)?原理

2.1 恒溫?cái)U(kuò)增芯片技術(shù)

相比于需要不斷升降溫的RT-qPCR技術(shù)，核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在恒定溫度下即可進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，操作簡(jiǎn)單、快速、性?xún)r(jià)比高，且靈敏度和特異性與PCR反應(yīng)相當(dāng)。環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[10~12](loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是2000年開(kāi)發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其原理是針對(duì)目標(biāo)基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異性引物，利用鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63 ℃左右)下保溫30~60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，具體原理如圖3所示。

成都博奧晶芯生物科技有限公司在2019年通過(guò)將LAMP恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與蝶式微流控技術(shù)相結(jié)合[13,14]，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)6種豬病毒的目的，在此研究基礎(chǔ)上，該公司設(shè)計(jì)出全球首個(gè)能在1.5 h內(nèi)檢測(cè)包括SARS-CoV-2、甲型流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒(2009)、甲型H3N2流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒共6項(xiàng)呼吸道病毒的核酸檢測(cè)芯片試劑盒，通過(guò)熒光進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。此前的SARS- CoV-2核酸檢測(cè)產(chǎn)品均只能針對(duì)SARS-CoV-2單一指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，而該試劑盒可以針對(duì)多個(gè)靶標(biāo)實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，能夠有效快速地區(qū)分普通流感患者與COVID-19患者，為臨床上大量的疑似感染患者提供更加簡(jiǎn)便快速的診斷，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)診斷、精準(zhǔn)治療。

綜合對(duì)比LAMP恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)與蝶式微流控技術(shù)，恒溫?cái)U(kuò)增芯片技術(shù)步驟簡(jiǎn)單、擴(kuò)增高效、有較高的靈敏度及特異性、樣品用量少，利用微流控分區(qū)可對(duì)多項(xiàng)指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，有效降低醫(yī)務(wù)人員感染的風(fēng)險(xiǎn)。但是該技術(shù)沒(méi)有將核酸提取步驟與擴(kuò)增、檢測(cè)流程集成，仍需依靠其他設(shè)備或人工提取病毒核酸，并未完全實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)、結(jié)果出”的集成化和全自動(dòng)化。

2.2 SAT-RNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

SARS-CoV-2檢測(cè)存在的“假陰性”問(wèn)題與樣本采集、保存運(yùn)輸、預(yù)處理、核酸提取、擴(kuò)增檢測(cè)等過(guò)程息息相關(guān)，提取出高質(zhì)量的病毒核酸可有效改善這一問(wèn)題。SARS-CoV-2為RNA病毒，傳統(tǒng)的濾膜吸附洗脫提取會(huì)損失部分樣本，特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)(磁珠法) (specific target capture technology (mag-netic bead method))[15]可以提取到高純度RNA，通過(guò)在磁珠表面標(biāo)記Oligo (dT)，與含有互補(bǔ)Oligo (dA)的特異性捕獲核酸配對(duì)結(jié)合，若樣本中存在待測(cè)靶標(biāo)，捕獲探針將會(huì)與其互補(bǔ)配對(duì)，最終利用磁鐵吸附磁珠，可特異性提取出待測(cè)靶標(biāo)，原理如圖4所示。

上海仁度生物科技有限公司采用獨(dú)特的樣本保存液對(duì)RNA病毒樣本進(jìn)行常溫保存，減少樣本損失，然后通過(guò)特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)以及SAT-RNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(simultaneous amplification and testing-RNA technology)開(kāi)發(fā)了高通量、全自動(dòng)一體化的SARS-CoV-2檢測(cè)平臺(tái)(Auto-SAT新冠自動(dòng)檢測(cè)平臺(tái))。在42 ℃恒溫條件下，靶標(biāo)RNA在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成帶T7啟動(dòng)子的雙鏈cDNA，T7 RNA聚合酶以該雙鏈DNA為模板進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，每個(gè)cDNA分子可以轉(zhuǎn)錄出100~1000拷貝的RNA，合成的RNA與分子信標(biāo)結(jié)合，釋放出熒光，通過(guò)高分辨率的分子信標(biāo)檢測(cè)技術(shù)來(lái)監(jiān)控?cái)U(kuò)增循環(huán)情況，可完全實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)、結(jié)果出”的自動(dòng)化檢測(cè)，具體原理如圖5所示。

表1 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的非RT-qPCR技術(shù)的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒

圖3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)原理

A：LAMP外部引物F3/B3和內(nèi)部引物FIP/BIP與靶標(biāo)的6個(gè)區(qū)域互補(bǔ)；B：恒溫?cái)U(kuò)增過(guò)程。

與國(guó)內(nèi)其他快速分子診斷平臺(tái)相比，該平臺(tái)有更高的檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度及特異性，采用雙靶標(biāo)/雙內(nèi)標(biāo)分管模式進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè)，一次性放置80個(gè)樣本并實(shí)現(xiàn)連續(xù)上樣，做到病毒核酸提取純化、擴(kuò)增檢測(cè)、結(jié)果報(bào)告的全程一體化。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在密閉環(huán)境內(nèi)進(jìn)行，保證了實(shí)驗(yàn)的生物安全性，降低了檢測(cè)人員的感染風(fēng)險(xiǎn)，且全流程標(biāo)準(zhǔn)化操作，無(wú)需人工干涉，可排除人為因素引起的結(jié)果偏差。

圖4 特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)(磁珠法)原理

同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本時(shí)，Auto-SAT新冠自動(dòng)檢測(cè)平臺(tái)90 min后給出第一個(gè)結(jié)果，后續(xù)每10 min出6個(gè)結(jié)果，24 h即可檢測(cè)700個(gè)樣本[16]，適合對(duì)大批量樣本進(jìn)行篩查。雖然該平臺(tái)展現(xiàn)出大通量檢測(cè)的差異性?xún)?yōu)勢(shì)，但需要昂貴的大型設(shè)備，若只需要檢測(cè)少量樣本，則會(huì)導(dǎo)致平均檢測(cè)費(fèi)用較高。同時(shí)SAT恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)由于循環(huán)過(guò)程復(fù)雜，需重復(fù)加入多種酶，造成試劑成本相對(duì)較高，不適合在疫情一線進(jìn)行快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

2.3 交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增—實(shí)時(shí)熒光技術(shù)

在某些疫情一線地區(qū)沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的生物安全實(shí)驗(yàn)室及專(zhuān)業(yè)檢測(cè)人員，無(wú)法對(duì)SARS-CoV-2進(jìn)行快速檢測(cè)，杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司利用交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[17](cross priming amplification, CPA)以及試劑玻璃化技術(shù)開(kāi)發(fā)了EasyNAT 新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒。試劑運(yùn)輸過(guò)程無(wú)需冷鏈，配套使用全自動(dòng)CPA核酸分析儀，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)樣本中的SARS-CoV-2，實(shí)現(xiàn)診斷關(guān)口前移，確保更好地防控和治療。該產(chǎn)品已在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院進(jìn)行了60例臨床驗(yàn)證，其臨床靈敏度達(dá)100%、特異性達(dá)100%，優(yōu)于對(duì)照的PCR試劑盒[18]。

圖5 SAT-RNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

CPA技術(shù)共需要設(shè)計(jì)兩對(duì)引物：交叉擴(kuò)增引物和外圍置換引物[19,20]。將RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA樣本后，交叉擴(kuò)增引物與cDNA中的互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合，在Bst DNA聚合酶的作用下合成雙鏈DNA，外圍置換引物與cDNA的前端序列互補(bǔ)，一邊與cDNA形成雙鏈結(jié)構(gòu)一邊置換交叉擴(kuò)增引物合成的單鏈產(chǎn)物，最終形成兩端帶有交叉引物結(jié)合位點(diǎn)的單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。隨著交叉擴(kuò)增引物的不斷雜交和延伸，分支狀擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)不斷增加，體系里含有的熒光探針與其結(jié)合后發(fā)出熒光，可達(dá)到實(shí)時(shí)檢測(cè)的目的，主要原理如圖6所示。

圖6 交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)原理

A：帶有交叉引物位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生；B：交叉引物擴(kuò)增最終生成分支狀產(chǎn)物。

SARS-CoV-2具有較高的傳染性，全自動(dòng)CPA核酸分析儀只需將樣本加入密閉的獨(dú)立檢測(cè)管，放入儀器中即可快速進(jìn)行反應(yīng)，無(wú)接觸感染風(fēng)險(xiǎn)，極大地保障了醫(yī)護(hù)及檢測(cè)人員安全。全自動(dòng)“傻瓜式”操作可以實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)、結(jié)果出”，對(duì)檢測(cè)人員的技能要求低。該技術(shù)能夠快速、方便、準(zhǔn)確地對(duì)SARS-CoV-2核酸進(jìn)行檢測(cè)，尤其適用于疫情一線配置薄弱的生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，但該儀器一次只能檢測(cè)兩個(gè)樣本，不適合用于疫情嚴(yán)重地區(qū)的大規(guī)模檢測(cè)篩查。

2.4 雜交捕獲免疫熒光技術(shù)

上述幾種方法均需配備專(zhuān)門(mén)的檢測(cè)設(shè)備，無(wú)法實(shí)現(xiàn)儀器小型化、操作簡(jiǎn)單化、報(bào)告結(jié)果即時(shí)化的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，導(dǎo)致COVID-19的確診周期較長(zhǎng)。安邦(廈門(mén))生物科技有限公司基于2019年公開(kāi)的核酸雜交捕獲免疫熒光技術(shù)[21]開(kāi)發(fā)了新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒，該技術(shù)無(wú)需提取純化SARS-CoV-2核酸，無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用處理液直接裂解病原體并釋放靶核酸，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，設(shè)計(jì)能與該核酸片段雜交的探針來(lái)捕獲待測(cè)樣本中的靶核酸，形成RNA/DNA雙鏈雜交體，該雜交體在免疫熒光層析試紙條上的加樣區(qū)與熒光素標(biāo)記第一捕獲抗體結(jié)合，通過(guò)毛細(xì)管作用到達(dá)檢測(cè)區(qū)與第二捕獲抗體結(jié)合形成三元復(fù)合物，恒溫反應(yīng)45 min左右對(duì)該復(fù)合物進(jìn)行熒光信號(hào)識(shí)別，可對(duì)樣本中SARS-CoV-2的核酸實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，主要原理如圖7所示。

雜交捕獲免疫熒光技術(shù)是一種新型的快速分子診斷技術(shù)，一步即可快速檢測(cè)病毒、操作簡(jiǎn)單、試劑盒所需組分常溫條件下即可儲(chǔ)存運(yùn)輸、檢測(cè)儀器方便攜帶、無(wú)需專(zhuān)業(yè)人員及PCR實(shí)驗(yàn)室，一臺(tái)儀器一小時(shí)最多可測(cè)試60份樣本，可實(shí)現(xiàn)隨到隨檢的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)且不會(huì)引起實(shí)驗(yàn)室陽(yáng)性產(chǎn)物污染。該試劑盒已在3家臨床單位完成670例臨床試驗(yàn)，臨床靈敏度88.61%，臨床特異性94.92%，總體符合率達(dá)92.69%[22]。

圖7 雜交捕獲免疫熒光技術(shù)原理

但是該技術(shù)只能給出定性結(jié)果，無(wú)法精確定量；檢測(cè)限為500拷貝/mL，靈敏度較低；且不適合用于檢測(cè)咽部2 h內(nèi)用藥的病人。同時(shí)不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理、樣本中病毒含量過(guò)低、待檢病原體探針結(jié)合位點(diǎn)的較大變異均有可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，另外臨床數(shù)據(jù)也顯示不同病程不同階段樣本的陽(yáng)性率存在不一致的情況。

2.5 聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序技術(shù)

在抗“疫”前線，高通量測(cè)序儀可快速助力未知病原體的鑒定。疫情初期，正是高通量測(cè)序第一時(shí)間幫助科研人員獲得了SARS-CoV-2的全基因組序列[23]。華大生物科技(武漢)有限公司以聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序技術(shù)為原理設(shè)計(jì)了SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒，這一技術(shù)的具體細(xì)節(jié)尚未完全公布。主要步驟如下：首先對(duì)樣本進(jìn)行DNA提取并片段化處理，對(duì)DNA片段末端進(jìn)行修復(fù)并加上接頭序列，利用DNA納米球技術(shù)擴(kuò)增，DNA分子錨和熒光探針在DNA納米球上聚合，此過(guò)程可通過(guò)該公司的自動(dòng)化樣本制備工作站MGISP系列完成，隨后利用MGIDL-T7全自動(dòng)樣本加載系統(tǒng)將DNA納米球加載到載片上以完成測(cè)序載片的制備，DNBSEQ-T7高通量測(cè)序儀對(duì)載片上DNA納米球產(chǎn)生的光信號(hào)進(jìn)行采集分析，讀取堿基信息并給出測(cè)序結(jié)果。

聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序技術(shù)在DNBSEQ-T7高通量測(cè)序儀的幫助下能夠獲得特定的病毒基因組序列，即使病毒基因組序列產(chǎn)生變異，也不影響對(duì)整體同源性的比對(duì)。該技術(shù)可以對(duì)核酸檢測(cè)呈陰性但臨床癥狀疑似感染的患者提供復(fù)檢及混合感染診斷等幫助，同時(shí)可對(duì)病毒序列提供持續(xù)監(jiān)測(cè)，方便科研人員對(duì)病毒變異進(jìn)行研究。

聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序技術(shù)通過(guò)全自動(dòng)化平臺(tái)可對(duì)SARS-CoV-2實(shí)現(xiàn)快速高效的核酸檢測(cè)，靈敏度高、不易漏診錯(cuò)診、對(duì)操作人員要求較低。但其結(jié)果也易受多種因素影響，如：(1)未規(guī)范保存樣本、未及時(shí)檢測(cè)樣本導(dǎo)致的錯(cuò)檢；(2)檢測(cè)環(huán)境溫度過(guò)高對(duì)結(jié)果判讀的影響等。

3 結(jié)語(yǔ)與展望

目前我國(guó)新型冠狀病毒肺炎疫情已得到較好的控制，局部地區(qū)出現(xiàn)的反彈現(xiàn)象能得到及時(shí)處理，武漢等地區(qū)大范圍的篩查工作也有序展開(kāi)，但每天仍有數(shù)例境外輸入病例及無(wú)癥狀感染者，個(gè)人防護(hù)仍需重視。目前針對(duì)新型冠狀病毒肺炎最有效的防治措施仍是早確診、早隔離、早治療，這需要快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的檢測(cè)技術(shù)支持。除了新冠病毒的核酸檢測(cè)技術(shù)，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局還批準(zhǔn)了8個(gè)新冠病毒特異性抗體檢測(cè)試劑盒，主要為IgM和IgG兩類(lèi)。IgM抗體在免疫應(yīng)答中首先分泌，一經(jīng)感染快速產(chǎn)生，但維持時(shí)間短，只適合診斷早期感染；IgG抗體屬于記憶性抗體，在機(jī)體再次產(chǎn)生免疫應(yīng)答時(shí)產(chǎn)生，產(chǎn)生時(shí)間較晚，維持時(shí)間長(zhǎng)，可提高診斷準(zhǔn)確性。該類(lèi)基于血清學(xué)的檢測(cè)方法無(wú)需特殊儀器、用時(shí)短，適合對(duì)大規(guī)模人群進(jìn)行初步篩查，但檢測(cè)靈敏度及特異性與機(jī)體感染時(shí)長(zhǎng)密切相關(guān)，對(duì)潛伏期及感染初期的病例容易漏診，因此不適合作為COVID-19確診和排除的單一途徑，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)仍需以核酸檢測(cè)結(jié)果為主要參考。

本文針對(duì)國(guó)內(nèi)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的分子診斷新技術(shù)作了簡(jiǎn)單綜述，高靈敏、高特異、可定量的RT-qPCR技術(shù)是臨床診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，使用高質(zhì)量試劑盒、提高操作熟練度可減少假陽(yáng)性及假陰性問(wèn)題，該技術(shù)仍然是臨床上最為廣泛使用的技術(shù)；由于普通流感與COVID-19的初期癥狀相似，恒溫?cái)U(kuò)增芯片技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)6種呼吸道病毒，快速診斷或排除疑似感染患者，減少醫(yī)院內(nèi)的交叉感染；聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序技術(shù)和SAT-RNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)通量大，能實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化檢測(cè)，適合對(duì)大范圍樣本進(jìn)行篩查，且前者可監(jiān)測(cè)病毒突變；交叉引物恒溫?cái)U(kuò)增——實(shí)時(shí)熒光技術(shù)雖可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化，但通量小，適合在疫情一線地區(qū)進(jìn)行快速檢測(cè)；雜交捕獲免疫熒光技術(shù)所需儀器方便攜帶，檢測(cè)過(guò)程快速簡(jiǎn)便，能夠滿(mǎn)足隨到隨檢的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)(point-of-care testing, POCT)。本文介紹的每一種方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)(表2)，可根據(jù)檢測(cè)人群及檢測(cè)目的的不同選擇合適的檢測(cè)方法。

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，研究人員也在不斷開(kāi)發(fā)更多用于臨床檢測(cè)的分子診斷新技術(shù)，如微滴式數(shù)字化PCR(droplet digital PCR, ddPCR)技術(shù)[24,25]、重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase ampli-fication, RPA)技術(shù)[26]、基于CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas13系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)[27,28]等。ddPCR技術(shù)將水相溶液樣本封裝為數(shù)萬(wàn)個(gè)納升體積大小的微液滴，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，含有待測(cè)靶標(biāo)的微液滴產(chǎn)生熒光信號(hào)，無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)品即可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。該技術(shù)檢測(cè)靈敏度高，在低病毒載量的樣本檢測(cè)中更有優(yōu)勢(shì)且能給出樣本中的病毒載量數(shù)值。目前已有公司開(kāi)發(fā)出試劑盒，檢測(cè)下限低至3拷貝/反應(yīng)，但只限于科研使用，若該技術(shù)獲得批準(zhǔn)用于臨床診斷，可對(duì)微量病毒攜帶者進(jìn)行篩查，大大降低漏檢率及錯(cuò)檢率。RPA技術(shù)被認(rèn)為是可以替代PCR的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)在37 ℃左右依賴(lài)重組酶的鏈置換活性即可對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)迅速且靈敏度與PCR相當(dāng)，目前尚無(wú)將RPA技術(shù)單獨(dú)用于檢測(cè)SARS-CoV-2的報(bào)道，但張鋒團(tuán)隊(duì)[29]將其與CRISPR-Cas13偶聯(lián)，開(kāi)發(fā)出SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)技術(shù)，利用CRISPR-Cas13a在向?qū)蛄械慕閷?dǎo)下與靶標(biāo)結(jié)合時(shí)被激活的附屬無(wú)特異性的RNA酶活性，切割體系中的單鏈RNA報(bào)告探針，發(fā)出熒光，實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)，靈敏度可達(dá)10拷貝/反應(yīng)。未來(lái)高靈敏度、高特異性、可定量、用時(shí)短、可攜帶的多重檢測(cè)將成為分子診斷新技術(shù)的研究重點(diǎn)，為臨床預(yù)防及控制傳染病提供更加快捷準(zhǔn)確的診斷方式。

表2 臨床SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的分子診斷技術(shù)總結(jié)對(duì)比

“?”：暫未公布具體數(shù)據(jù)。

[1] Zhou P, Yang XL, Wang XG, Hu B, Zhang L, Zhang W, Si HR, Zhu Y, Li B, Huang CL, Chen HD, Chen J, Luo Y, Guo H, Jiang RD, Liu MQ, Chen Y, Shen XR, Wang X, Zheng XS, Zhao K, Chen QJ, Deng F, Liu LL, Yan B, Zhang FX, Wang YY, Xiao GF, Shi ZL. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin., 2020, 579(7798): 270–273.

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[23] 一文讀懂測(cè)序技術(shù)在新冠病毒檢測(cè)中的應(yīng)用. https:// www.medsci.cn/article/show_article.do?id=5d4419098e46, 2020-03-27.

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New molecular diagnostic technologies for clinical detection of SARS-CoV-2

Chunmei Xie1, Haiping Wu1, Xueping Ma1, Guohua Zhou1,2

The severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has caused an ongoing pandemic of new coronavirus pneumonia (corona virus disease 2019, COVID-19). The virus has a long incubation period and strong infectivity, which poses a major threat to global health and safety. Detection of SARS-CoV-2 nucleic acid lies at the center of rapid detection of COVID-19, which is instrumental for mitigation of the ongoing pandemic. As of August 17, 2020, The National Medical Products Administration in China has approved 15 new coronavirus nucleic acid detection kits, 10 kits of which are based on reverse transcription-real-time quantitative PCR (RT-qPCR) technology. The remaining kits use five molecular diagnostic technologies different from RT-qPCR. This article reviews the principles, reaction time, advantages and disadvantages of above 15 detection kits, in order to provide references for rapid screening, diagnosis, prevention and control of COVID-19 and similar infectious diseases.

novel coronavirus; nucleic acid detection; molecular diagnostic technology

2020-06-22;

2020-08-19

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：61871403)和江蘇省杰出青年基金項(xiàng)目(編號(hào)：BK20180005)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.61871403), and Jiangsu Provincial Science Fund for Distinguished Young Scholars (No. BK20180005)]

謝春梅，在讀碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：分子診斷。E-mail: 15151868313@163.com

周?chē)?guó)華，博士，研究員，研究方向：分子診斷。E-mail: ghzhou@nju.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-189

2020/9/10 7:18:21

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20200908.1130.002.html

(責(zé)任編委: 謝建平)