艱難梭菌芽孢形成與萌發(fā)的研究進(jìn)展

趙寶鑫， 強(qiáng)翠欣， 趙建宏

艱難梭菌是一種可形成芽孢、產(chǎn)生毒素的革蘭陽性桿菌，是引起醫(yī)院感染的重要致病菌之一[1]。艱難梭菌生長繁殖需要嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，芽孢是感染和傳播的重要形式。在艱難梭菌感染患者的腸道內(nèi)，芽孢萌發(fā)成為繁殖體，后者產(chǎn)生毒素，引起腹瀉或偽膜性腸炎等疾病。同時，繁殖體形成難被清除的芽孢，導(dǎo)致感染復(fù)發(fā)，芽孢也可能播散到環(huán)境中[2]。艱難梭菌的芽孢形成、萌發(fā)過程和芽孢結(jié)構(gòu)等的研究進(jìn)展緩慢，其過程與芽孢桿菌屬和梭菌屬細(xì)菌差異顯著，本文就艱難梭菌芽孢研究成果作一綜述。

1 艱難梭菌芽孢形成

艱難梭菌芽孢由內(nèi)膜、芽孢壁、皮質(zhì)、外膜等多層結(jié)構(gòu)包被，且細(xì)胞質(zhì)高度脫水濃縮，對各種不利條件的抵抗能力增強(qiáng)，利于其在體內(nèi)外環(huán)境中傳播。艱難梭菌芽孢形成過程包括4個階段：①不對稱分裂，形成前芽孢和母細(xì)胞；②母細(xì)胞裹吞前芽孢；③芽孢皮質(zhì)、芽孢殼及芽孢外衣包繞前芽孢；④母細(xì)胞裂解，釋放成熟芽孢[3]。

1.1 艱難梭菌芽孢形成的起始信號轉(zhuǎn)導(dǎo)

艱難梭菌芽孢形成的引發(fā)信號及分子機(jī)制尚未完全闡明?；贖iggins等[4]對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的研究推斷，艱難梭菌芽孢形成與營養(yǎng)不足或群體感應(yīng)等環(huán)境壓力密切相關(guān)。Spo0A蛋白是芽孢形成信號向下游傳遞的關(guān)鍵分子，Spo0A被磷酸化激活后才可發(fā)揮其功能[5]，見圖1。Narula等[6]發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌細(xì)胞膜上的組氨酸激酶通過Spo0F/Spo0B磷酸基轉(zhuǎn)移系統(tǒng)激活Spo0A。然而尚未在艱難梭菌中發(fā)現(xiàn)組氨酸激酶或磷酸基轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的同源基因。Underwood等[7]在艱難梭菌630菌株基因組上鑒定了5個基因（CD1352、CD1492、CD1579、CD1949和CD2492）可編碼孤兒組氨酸激酶，并發(fā)現(xiàn)通過ClosTron敲除CD2492基因的艱難梭菌突變株產(chǎn)芽孢能力明顯降低，推測其可能參與Spo0A激活。研究還發(fā)現(xiàn)CD1579可自磷酸化，并將磷酸基直接轉(zhuǎn)移到Spo0A。Childress等[8]指出，CD1492是艱難梭菌芽孢形成的負(fù)調(diào)節(jié)子。研究發(fā)現(xiàn)codY和sinR基因缺失可抑制芽孢形成，并推測Spo0A激活過程受到抑制[9-10]。這些研究結(jié)果提示，艱難梭菌存在不同于其他細(xì)菌的Spo0A激活系統(tǒng)。不同研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白和RstA蛋白可分別抑制或促進(jìn)芽孢形成[11-12]，但具體機(jī)制是否涉及Spo0A的激活過程還有待研究。

圖1 艱難梭菌芽孢形成過程中的信號通路

1.2 RNA聚合酶σ因子的區(qū)域性激活

激活的Spo0A-P可促進(jìn)RNA聚合酶σ因子（σE、σF、σG及σK）的表達(dá)，各σ因子進(jìn)而識別特定的啟動子，調(diào)節(jié)相應(yīng)基因表達(dá)，其中σE和σK在母細(xì)胞中發(fā)揮作用，σF和σG在前芽孢中行使功能[13-14]，見圖1。各σ因子的級聯(lián)激活過程如下：①芽孢形成開始后，前芽孢中SigH和Spo0A-P與spoⅡAA–spoⅡAB–sigF操縱子上游的啟動子結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄[15]。Campbell等[16]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌中，σF與抑制因子SpoⅡAB分離才能在早期的前芽孢中發(fā)揮作用。艱難梭菌中σF的活性如何調(diào)控，尚需實驗證明。②不對稱分裂完成后，SigA和Spo0A-P啟動spoⅡGA–sigE–sigG操縱子轉(zhuǎn)錄，后期SigF和SigG先后與sigG基因上游的啟動子結(jié)合，啟動sigG轉(zhuǎn)錄，裹吞完成后SigG活性的調(diào)節(jié)需SigE及母細(xì)胞與前芽孢之間的SpoⅢAH-SpoⅡQ通道參與[17-18]。sigG基因轉(zhuǎn)錄是如何被精細(xì)調(diào)節(jié)及其活性在不同階段受何種因素的影響，還有待深入研究。③母細(xì)胞中，SigA和Spo0A-P共同啟動spoⅡGA–sigE–sigG操縱子轉(zhuǎn)錄[19]?？莶菅挎邨U菌中，pro-σE末端的肽段需要被SpoⅡGA蛋白酶切除才能激活。研究表明，艱難梭菌pro-SigE的激活并不需要SpoⅡGA參與，可能存在其他激活機(jī)制[20]。④sigK基因的轉(zhuǎn)錄前期由SigE啟動，后期依靠SigK的正反饋調(diào)節(jié)，并受到SpoⅢD的正向調(diào)控[21]。與枯草芽孢桿菌不同，艱難梭菌中SigK的表達(dá)與SigG無關(guān)，但可能受到SigF的影響[22]。綜上，艱難梭菌芽孢形成過程中，前芽孢與母細(xì)胞中σ因子的激活過程基本相互獨立，并不像枯草芽孢桿菌復(fù)雜。艱難梭菌各σ因子的級聯(lián)激活與不對稱分裂和裹吞等時間節(jié)點也無直接關(guān)聯(lián)[23]。

1.3 RNA聚合酶σ因子的功能

RNA測序和微陣列分析顯示[20，24-25]，芽孢形成過程中200多種基因受到4種σ因子的調(diào)節(jié)：σF調(diào)控母細(xì)胞-前芽孢信息交流的spoⅡR、spoⅡQ及spoⅣB的轉(zhuǎn)錄，芽孢抵抗性相關(guān)蛋白主要依賴σG特異性調(diào)節(jié)，σE在前芽孢的裹吞、皮質(zhì)及芽孢殼蛋白質(zhì)的合成及芽孢成熟時所需的能量代謝方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，σK影響芽孢殼及芽孢外衣的合成及組裝和成熟芽孢的釋放過程。綜合這些研究結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，與芽孢桿菌屬及梭菌屬細(xì)菌相比，艱難梭菌中的4種σ因子的功能和芽孢形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)獨樹一幟，反映了其作為一種腸道定植細(xì)菌為適應(yīng)生存環(huán)境而進(jìn)化出的特征。

2 艱難梭菌芽孢結(jié)構(gòu)

2.1 艱難梭菌芽孢的基本結(jié)構(gòu)與其抵抗性

艱難梭菌芽孢最內(nèi)層是芽胞核心，包含基因組DNA、各種RNA、蛋白質(zhì)和核糖體[26]。Redondo-Solano等[27]發(fā)現(xiàn)，核心含有大量的吡啶二羧酸鈣（CaDPA）和α/β型小酸溶性蛋白質(zhì)（SASP），含水量較低。這些特點使芽孢對各種刺激，如基因毒性藥物、干燥劑、干熱及濕熱、紫外線及γ射線等，具有較強(qiáng)的抵抗性。核心外層是與繁殖體細(xì)胞膜具有相似磷脂組成的內(nèi)膜，內(nèi)膜對小分子物質(zhì)的通透性較低，內(nèi)膜外層是含肽聚糖的芽胞壁、由特殊的肽聚糖組成的較厚的皮質(zhì)層以及來源于母細(xì)胞的外膜[28]。最外層為芽孢殼及芽孢外衣，是艱難梭菌芽孢研究熱點。

研究發(fā)現(xiàn)，盡管艱難梭菌和枯草芽孢桿菌芽孢殼結(jié)構(gòu)相似，均為層狀結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)[29]，但后者編碼芽孢殼蛋白的基因僅有25%與艱難梭菌同源[30]。艱難梭菌芽孢最外層呈毛發(fā)樣突起，蛋白質(zhì)組成的芽孢外衣[31]。透射電鏡研究發(fā)現(xiàn)，艱難梭菌芽孢外衣與芽孢殼層緊密連接，但艱難梭菌630菌株芽孢外衣卻不存在發(fā)樣突起結(jié)構(gòu)[32-33]。Permpoonpattana等[29]發(fā)現(xiàn)生物膜形成過程中形成的芽孢缺少芽孢外衣，說明芽孢外衣不穩(wěn)定。然而也有研究指出芽孢外衣很穩(wěn)定，只有經(jīng)超聲和 /或蛋白酶處理才會丟失[34]。Pizarro-Guajardo等[35]綜合所有研究成果，認(rèn)為芽孢外衣的穩(wěn)定性或許與實驗采用的菌株及所用蛋白酶不同有關(guān)。

2.2 艱難梭菌芽孢殼的形成

艱難梭菌芽孢形成過程中，母細(xì)胞將前芽孢裹吞完成后，芽孢殼中各種蛋白質(zhì)包繞于前芽孢外層，芽孢逐漸成熟，見表1。Pereira等[36]通過對芽孢桿菌的研究發(fā)現(xiàn)，SafA、SpoⅣA、SpoⅤM及SpoⅥD等十余種蛋白協(xié)助芽孢殼中各種蛋白質(zhì)在前芽孢周圍的準(zhǔn)確定位。但艱難梭菌中只存在SpoⅣA和SpoⅤM同源蛋白，且SpoⅤM存在與否對芽孢形成影響甚微[37]，推測可能存在其他蛋白發(fā)揮類似作用。Touchette等[38]發(fā)現(xiàn)一種新的梭菌綱蛋白質(zhì)SipL（SpoⅣA interacting protein L），通過羧基末端LysM結(jié)構(gòu)域與SpoⅣA結(jié)合，是芽孢殼形成過程中必不可少的。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，芽孢殼中的其他蛋白質(zhì)與SpoⅣA、SipL和SpoⅤM的相互作用，有待深入研究。

2.3 艱難梭菌芽孢殼和芽孢外衣中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的作用

研究發(fā)現(xiàn)，艱難梭菌芽孢殼和芽孢外衣中蛋白除了作為結(jié)構(gòu)蛋白存在，還與芽孢的抵抗性及免疫原性相關(guān)。Ghose等[39]發(fā)現(xiàn)，膠原蛋白樣糖蛋白BclA1是艱難梭菌芽孢外衣的重要組成部分，但免疫原性較差，不足以誘發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)。Calderón-Romero等[40]通過電鏡觀察到編碼富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)基因cdeC缺失的艱難梭菌芽孢外衣缺少發(fā)樣突起的芽孢外衣結(jié)構(gòu)，提示CdeC在芽孢殼和芽孢外衣間發(fā)揮錨蛋白作用。CotA、CotB、CotCB、CotD、CotE、CotF、CotG、CotL和SodA均作為艱難梭菌芽孢殼的結(jié)構(gòu)蛋白而發(fā)揮重要作用[29，41]。另外一項蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)艱難梭菌630菌株芽孢外衣中的鐵氧化還原蛋白（CD0116、CD0117、CD0118）及黃素氧化還原蛋白（CD1474、CD1524、CD2845）可能賦予艱難梭菌芽孢對化學(xué)消毒劑的抵抗性[31]，但還需實驗證實。見表1。

表1 艱難梭菌630菌株芽孢殼和芽孢外衣中的重要蛋白質(zhì)

表1（續(xù)）

艱難梭菌芽孢可能通過多種相互作用黏附于腸黏膜細(xì)胞表面。芽孢表面（即芽孢殼和芽孢外衣）的疏水作用即是其中的一種[35]。不同研究表明，艱難梭菌繁殖體可與宿主小腸黏膜細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白Ⅰ、血小板反應(yīng)蛋白、纖連蛋白及玻連蛋白結(jié)合，黏附于宿主細(xì)胞表面[42-43]。芽孢能否也可與上述蛋白結(jié)合，還有待研究。Mora-Uribe等[44]研究發(fā)現(xiàn)，艱難梭菌芽孢外衣的發(fā)樣突起與腸上皮細(xì)胞的頂端微絨毛之間存在相互作用，芽孢外衣可能參與芽孢與腸上皮細(xì)胞的特異性結(jié)合；去除芽孢外衣的芽孢比結(jié)構(gòu)完整的芽孢能更有效地與Caco-2細(xì)胞結(jié)合，但結(jié)合可能是非特異性的。

盡管艱難梭菌芽孢結(jié)構(gòu)研究取得初步進(jìn)展，但芽孢外衣的組成成分、芽孢外衣在環(huán)境中的半衰期、芽孢外衣在芽孢與上皮細(xì)胞黏附方面的作用等眾多問題，還懸而未決。

3 艱難梭菌芽孢萌發(fā)

在適宜的環(huán)境中，艱難梭菌芽孢接受一系列信號刺激，可在數(shù)分鐘內(nèi)失去皮質(zhì)及芽孢殼等保護(hù)性外殼，恢復(fù)成為繁殖體。Setlow等[45]綜述，艱難梭菌芽孢必須萌發(fā)為繁殖體才可釋放毒素，引起腸壁細(xì)胞壞死，導(dǎo)致相應(yīng)的臨床癥狀，見圖2。

圖2 艱難梭菌芽孢萌發(fā)過程示意圖

3.1 艱難梭菌芽孢萌發(fā)信號

迄今，艱難梭菌是所有產(chǎn)芽孢細(xì)菌中唯一利用膽酸作為萌發(fā)劑的一個菌種，這也反映了艱難梭菌主要定植于哺乳動物腸道中并引起腸道疾病的一種適應(yīng)策略[46]。膽酸和鵝脫氧膽酸（CDCA）是人體內(nèi)的兩種主要初級膽酸，與?；撬峄蚋拾彼峤Y(jié)合。分泌進(jìn)入小腸的初級膽酸大部分經(jīng)腸肝循環(huán)被肝臟重吸收用于食物消化，少部分進(jìn)入大腸并在結(jié)腸內(nèi)微生物組代謝生成的膽鹽水解酶作用下脫羥基變?yōu)榇渭壞懰幔撗跄懰幔―CA）、石膽酸（LCA）及熊脫氧膽酸（UDCA）等50余種，初級膽酸/次級膽酸平衡失調(diào)可促進(jìn)腸道炎癥[47-48]。體內(nèi)實驗[49]和體外研究[50]均證明，膽酸可有效促進(jìn)艱難梭菌芽孢萌發(fā)，CDCA是艱難梭菌芽孢萌發(fā)的抑制劑。Thanissery等[51]系統(tǒng)分析了不同膽酸對艱難梭菌芽孢萌發(fā)的作用，結(jié)果表明CDCA、DCA及LCA及其衍生物對艱難梭菌芽孢萌發(fā)的影響十分顯著，但不同菌株的敏感性存在差異。在小鼠動物模型中發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)不同膽酸的平衡狀態(tài)影響艱難梭菌感染的進(jìn)程，并且鑒定了一種可產(chǎn)生初級膽酸7α-脫羥酶的裂解梭菌，后者定植的小鼠對艱難梭菌感染的抵抗力增強(qiáng)，并且與腸道內(nèi)的次級膽酸代謝相關(guān)[52]。

3.2 艱難梭菌芽孢萌發(fā)共激活劑

膽酸是艱難梭菌芽孢萌發(fā)的首要條件，但萌發(fā)還需要氨基酸作為共激活劑[53]。Shrestha等[54]發(fā)現(xiàn)，甘氨酸是艱難梭菌芽孢萌發(fā)最有效的共激活劑，原因可能是艱難梭菌芽孢壁肽聚糖層中四肽側(cè)鏈的第四位為甘氨酸，而其他細(xì)菌為丙氨酸。研究表明，L-丙氨酸、?；撬峒癓-谷氨酰胺等也可作為艱難梭菌芽孢萌發(fā)的共激活劑[53-55]。Kochan等[55]發(fā)現(xiàn)艱難梭菌芽孢在不含Ca2+的培養(yǎng)基中不能萌發(fā)，表明Ca2+是芽孢萌發(fā)過程中不可缺少的。由此推測：Ca2+可能和甘氨酸一起促進(jìn)芽孢萌發(fā)，抑或Ca2+是萌發(fā)信號下游的輔助因子。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在萌發(fā)關(guān)鍵分子CspB的晶體結(jié)構(gòu)中沒有Ca2+，但Ca2+促進(jìn)芽孢萌發(fā)的作用還有待深入研究[56]。Shrestha等[57]發(fā)現(xiàn)，鋱也是艱難梭菌芽孢萌發(fā)的影響因素，故在芽孢萌發(fā)監(jiān)測實驗中應(yīng)注意氯化鋱的使用量。

3.3 艱難梭菌芽孢萌發(fā)過程中的關(guān)鍵分子

研究表明，枯草芽孢桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌及生孢梭菌等利用芽孢內(nèi)膜的Ger型萌發(fā)劑受體啟動芽孢萌發(fā)，但艱難梭菌不表達(dá)該受體[58]。艱難梭菌利用融合基因cspBA和cspC，編碼3種絲氨酸蛋白酶CspA、CspB和CspC。Kevorkian等[59]證實，CspA的催化結(jié)構(gòu)域不完整，但可能控制CspC整合進(jìn)入芽孢。艱難梭菌利用催化結(jié)構(gòu)域同樣不完整的CspC作為膽酸受體，利用CspB蛋白酶向下游傳遞萌發(fā)信號，這在其他細(xì)菌中還未曾見到[60]。有趣的是，CspC點突變會改變艱難梭菌芽孢萌發(fā)劑的特異性，突變株的芽孢可在含有萌發(fā)抑制劑CDCA的培養(yǎng)基中萌發(fā)[61]。Shrestha等[62]發(fā)現(xiàn)CspA突變的艱難梭菌可在無共激活劑氨基酸的環(huán)境中萌發(fā)，推測CspA是共激活劑的受體。另有研究發(fā)現(xiàn)部分艱難梭菌芽孢在不含膽酸的培養(yǎng)基中也能萌發(fā)，表明可能存在其他或更加復(fù)雜的芽孢萌發(fā)機(jī)制[50]。

研究表明，CspB蛋白酶通過切除皮質(zhì)水解酶pro-SleC氨基末端序列，激活SleC，后者將皮質(zhì)降解，CaDPA從芽孢核心釋放[59，63]，見圖2。SpoⅤA在芽孢形成及萌發(fā)過程中，作為運(yùn)輸CaDPA的通道，調(diào)節(jié)芽孢核心內(nèi)的滲透壓。Velásquez等[64]發(fā)現(xiàn)，芽孢皮質(zhì)被SleC降解后，在滲透膨脹作用下，內(nèi)膜上的SpoⅤA蛋白形成小孔，導(dǎo)致CaDPA從芽孢核心釋放。由此可見，艱難梭菌皮質(zhì)降解先于CaDPA釋放，芽孢萌發(fā)過程以一種“從外到內(nèi)”的方式進(jìn)行。

4 結(jié)語

綜上所述，艱難梭菌芽孢形成及萌發(fā)的大致過程及信號通路逐漸清晰，但仍存在一些問題有待解決，如艱難梭菌如何及在什么時機(jī)開始形成芽孢，芽孢萌發(fā)特異性蛋白酶如何將膽酸信號處理及傳遞，還需要更多研究來解答。由于芽孢是艱難梭菌感染性疾病傳播和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵形式，了解艱難梭菌芽胞形成、結(jié)構(gòu)及萌發(fā)過程，不僅能充分理解艱難梭菌的生命周期，還可提供控制艱難梭菌感染的新靶點。