慢性乙型肝炎患者外周血調(diào)節(jié)性T細胞、Th17細胞的水平及與乙肝表面抗原滴度的相關性

朱義玲， 甘建和， 趙衛(wèi)峰， 孫 蔚， 陳 麗

我國是慢性乙型肝炎（CHB）的高發(fā)區(qū)，相關調(diào)查顯示，目前我國乙型肝炎（乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）攜帶率為7.18%，乙肝病毒（HBV）感染者高達9 300萬，其中CHB患者約2 000萬，占全世界的三分之一[1-2]。CHB的發(fā)生發(fā)展及轉歸與機體的細胞免疫功能密切相關，尤其以效應CD4+T淋巴細胞發(fā)揮的作用最為關鍵，其中調(diào)節(jié)性T細胞（Treg細胞）和Th17細胞在CHB中抗炎和促炎的作用已得到證實，且Treg/Th17比值的大小亦成為評估疾病嚴重程度的免疫指標[3]，而HBsAg滴度水平是CHB患者能否成功治愈的關鍵，也是對HBV免疫控制比較直觀的指標，因此本研究選擇相關病例進行Th17和Treg細胞的檢測，評估其與HBsAg的相關性及其在CHB發(fā)展過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 研究對象

回顧性研究2018年1－12月在蘇州大學附屬第一醫(yī)院感染病科住院治療的CHB患者38例（乙肝組），男 29例，女9例，平均年齡（51.9±15.5）歲；乙肝肝硬化（LC）患者30例（肝硬化組），男25例，女5例，平均年齡（54.1±13.2）歲；選擇20名健康體檢者作為正常對照組，男15例，女5例，平均年齡（48.4±8.4）歲。患者納入標準：符合《慢性乙型肝炎防治指南（2017年版）》。排除其他嗜肝病毒（甲、丙、丁、戊）感染；排除酒精性肝病及自身免疫性肝??；排除合并其他重大疾病。所有研究對象均知情同意，研究方案取得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑、儀器及檢測方法

1.2.1 流式細胞檢測 所用儀器為Beckman Coulter公司Epics XL4C。所用主要試劑分別為：BD公司的IL-17A-PE，Beckman Coulter公司的CD4-FITC、CD127-PE、CD3-ECD、CD25-PC5和C8-PC5。采集2 mL靜脈血于肝素抗凝管中，上下顛倒混勻 5 次，2 h內(nèi)送檢。

Th17細胞檢測步驟：因淋巴細胞刺激劑中的離子霉素和佛波酯會使淋巴細胞表面CD4分子表達明顯下降，有研究表明CD3+CD8-細胞可反映CD4+T細胞的數(shù)量[4]，故本實驗以CD3和CD8抗體作標記，具體步驟如下，取 30 μL刺激劑（BD白細胞刺激劑：1640培養(yǎng)液=1∶50）加入 50 μL全血中，震蕩混勻于 37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育5 h，加入CD3-ECD 和 CD8-PC5各5 μL，震蕩混勻避光標記15 min，加入100 μL固定劑震蕩混勻避光10 min，加入 1 mL PBS 震蕩混勻后1 500 r/min離心5 min 棄上清液，加入100 μL破膜劑震蕩混勻，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中孵育10 min后1 500 r/min 離心5 min 棄上清液，加入IL-17A- PE 5 μL震蕩混勻避光標記15 min，用500 μL PBS 重懸混勻后上機，計數(shù)3 000～5 000 個細胞。

Treg細胞檢測步驟：CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE 單抗各5 μL加入50 μL 全血中，震蕩混勻避光標記15 min，加入自制的紅細胞裂解液 A 液600 μL，震蕩混勻至澄清約8 s加入B液265 μL，震蕩混勻后1 500 r/min離心5 min棄上清液，用 500 μL PBS重懸混勻后上機，計數(shù)3 000～5 000 個細胞。

以上經(jīng)上機采集的數(shù)據(jù)經(jīng)CXP軟件分析，獲得最終結果。

1.2.2 乙肝兩對半定量數(shù)據(jù) 采集靜脈血分離血清標本，經(jīng)本科實驗室羅氏cobas e 411儀器檢測，獲得HBsAg定量的結果。相關生化數(shù)據(jù)均由本院臨床檢測中心完成。

1.3 統(tǒng)計學分析

應用 SPSS 22.0軟件包進行統(tǒng)計學處理 ，計量資料符合正態(tài)性分布以x±s表示 ，非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，相關分析采用Spearson法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意 義。

2 結果

2.1 一般資料比較

CHB組、LC組和健康對照組臨床資料見表1。三組研究對象性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義。CHB組和LC組的HBV-DNA及丙氨酸轉氨酶（ALT）指標均高于健康對照組，差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 Th17、Treg百分率及Treg/Th17比值比較

CHB組、LC組和健康對照組外周血Th17、Treg百分率、Treg/Th17比值見圖1和表2。與健康對照組比較，CHB組Treg、Th17百分率及Treg/Th17比值均明顯升高，且組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。CHB組與LC組比較，Treg、Th17百分率差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而Treg/Th17比值差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.3 CHB組Th17、Treg百分率及Treg/ Th17比值與HBsAg滴度的相關性分析

C H B組H B s A g滴 度 為6 4 7.8 8（1 8 5.8 1，1 009.85）IU/mL，HBsAg與Treg百分率具有統(tǒng)計學意義的正相關性（r=0.73，P＜0.05），而與Th17百分率（r=-0.16，P=0.35）及Treg/Th17比值（r=-0.05，P=0.77）無明顯相關性。見圖2。

表1 CHB組、LC組與健康對照組臨床資料比較Table1 Clinical data of chronic hepatitis B， hepatitis B cirrhosis compared with healthy subjects

圖1 健康對照組、 CHB 組和LC組Th17（CD3+CD8-IL-17+） 、Treg（CD4+CD25+CD127low）細胞流式圖Figure 1 Flow cytometry diagrams for Th17 cells （CD3+CD8-IL-17+） and Treg cells （CD4+CD25+CD127low） in healthy subjects，chronic hepatitis B， and hepatitis B cirrhosis.

表2 CHB組、LC組與健康對照組外周血Th17、Treg百分率、Treg/Th17比值比較Table 2 Th17， Treg cell percentage and Treg/Th17 ratio in peripheral blood compared between chronic hepatitis B， hepatitis B cirrhosis and healthy subjects

圖2 CHB組Treg與HBsAg的相關性分析Figure 2 Correlation between Treg and HBsAg in chronic hepatitis B patients

3 討論

我國是CHB高發(fā)國，每年因乙肝帶來的各種并發(fā)癥如肝硬化、肝癌、肝衰竭給社會和家庭帶來沉重的負擔，因此降低這些肝病的發(fā)生率，控制乃至完全治愈CHB是關鍵，但是在臨床治愈方面仍存在很多疑點和難點，可以肯定的是機體免疫功能與CHB各種臨床預后有著密切的相關性。

Treg細胞是T淋巴細胞亞群，在HBV 感染中高表達的 Treg細胞和樹突狀細胞數(shù)量減少及功能受損引起特異性CD8+T細胞數(shù)量減少及功能損傷，從而不能有效刺激機體產(chǎn)生特異性抗病毒免疫應答[5-6]。另外，Treg細胞還可通過抑制固有免疫和適應性免疫淋巴細胞的增殖及相關細胞因子的分泌，或通過細胞與細胞的直接接觸來持久性地抑制 CD8+T 細胞和 NK 細胞的細胞毒作用，減少免疫性肝損傷，而導致HBV 持續(xù)感染及原發(fā)性肝癌進展[7]。研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者外周血中 Treg細胞數(shù)量明顯高于 HBV 攜帶者、恢復期和健康者，且與HBV e抗原（HBeAg）滴度和血清 HBV-DNA 水平呈正相關[8]。

近年來，Th17細胞在CHB致病過程中的作用已得到證明，但目前的研究對于 Th17 細胞在CHB中的變化趨勢存在一定的爭論。Feng等[9]研究發(fā)現(xiàn)CHB患者外周血 Th17 細胞數(shù)量表達顯著上調(diào)，并與肝組織炎性活動程度呈正相關，Th17細胞誘導炎癥的發(fā)生，Treg細胞則抑制已經(jīng)發(fā)生的免疫炎性反應，兩者相互作用使機體處于復雜而精細的 Treg/Th17 平衡狀態(tài)，維持機體免疫狀態(tài)的相對穩(wěn) 定。

為了進一步研究CHB患者的免疫狀態(tài)，本研究中檢測了38例CHB患者外周血的Treg、Th17百分率以及Treg/Th17比值，結果表明CHB患者這三者水平均較健康人明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義；并對比了30例LC患者外周血的Treg、Th17百分率及Treg/Th17比值，前兩項數(shù)據(jù)差異存在統(tǒng)計學意義。在CHB患者中， Th17細胞的增殖并釋放細胞因子如IL-17等引起免疫損傷，造成肝組織炎癥加劇，而Treg細胞亦相應增加來抑制炎性活動從而緩和Th17細胞及其他免疫細胞帶來的免疫損傷[10]，提示CHB患者可能處于一種Th17細胞增多并趨于優(yōu)勢地位的Treg /Th17免疫失衡狀態(tài)，這可能是導致肝臟炎性反應的重要因素。有研究顯示 HBV 攜帶者、CHB、靜止期肝硬化、活動期肝硬化患者 IL-17 的表達依次升高，提示 Th17 細胞及 IL-17 介導的免疫反應與 HBV 感染的嚴重程度及肝細胞損傷機制有關，這與本研究結果相符。因此，在CHB的發(fā)展與轉歸過程中，檢測Th17和Treg細胞對預后評估有積極的作用。

HBsAg是HBV感染肝細胞后產(chǎn)生的重要抗原，HBsAg誘發(fā)的細胞免疫、體液免疫反應對抑制HBV復制及殺滅病毒至關重要，且與HBV感染的進程及預后密切相關，在 CHB 病情發(fā)展的不同階段，血清 HBsAg 滴度呈現(xiàn)不同[11]。尹艷霞等[12]研究顯示HBeAg 陽性的 CHB患者，當處于免疫耐受期時 HBsAg 定量最高，在HBeAg 陰性的低復制期患者中最低。因此，可以認為HBsAg與患者免疫功能水平密切相關，但關于這方面的研究鮮有報道，本研究檢測了CHB患者的HBsAg滴度，并將其與患者的外周血Treg、Th17百分率及其比值進行了相關性分析，結果發(fā)現(xiàn)CHB患者HBsAg與Treg百分率具有明顯的正相關性，而與Th17百分率以及Treg/Th17比值無明顯的相關性，考慮可能是因為CHB時，機體針對HBV的特異性免疫被激活，升高的HBsAg能夠刺激特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）[13]，而Treg細胞則可以抑制過強的免疫應答以免造成嚴重的免疫損傷如肝衰竭等，從而維持免疫穩(wěn)態(tài)， 但CHB患者大多數(shù)接受了抗病毒治療，HBV-DNA大部分均為陰性，而這可能干擾了Th17細胞水平的變化，進而影響HBsAg的清除。雖然這只是猜測之一，還需要更多的研究支持，但對免疫機制復雜的CHB，仍需更多的研究和探討。