lncRNA與缺血性腦卒中相關(guān)分子機制的研究進(jìn)展

藺文娟綜述，吳松笛,2,3審校

腦卒中是目前導(dǎo)致全球范圍內(nèi)死亡和致殘的主要病因，其中缺血性腦卒中約占全部腦卒中的60%～70%。中國是世界上卒中負(fù)擔(dān)最沉重的國家之一，2019年全球疾病負(fù)擔(dān)研究顯示，1990年-2017年間各大疾病導(dǎo)致的死亡率中，腦卒中超過了缺血性心臟病和癌癥成為中國人第一大死因[1]。如何更好地防治卒中已成為目前亟待解決的重要問題之一。

長鏈非編碼RNA(long-non coding RNA,lncRNA)是一類由RNA polⅡ從獨立啟動子轉(zhuǎn)錄的長度大于200 nt、不編碼蛋白質(zhì)但能轉(zhuǎn)錄且具有特定功能的RNA分子，缺少特異完整的開放閱讀框(open-reading frame,ORF)，具有細(xì)胞和組織特異性，序列保守性通常比較低，但其二級結(jié)構(gòu)比較保守[2]。lncRNA的分類尚未標(biāo)準(zhǔn)化，目前一種廣泛的分類是科學(xué)家根據(jù)lncRNA在蛋白編碼基因組中所處的有關(guān)位置進(jìn)行分類的(見圖1)[3]。大部分lncRNA具有反式作用，能夠遠(yuǎn)距離調(diào)控基因的表達(dá)，在細(xì)胞中具有獨立的轉(zhuǎn)錄位點并能夠執(zhí)行多種細(xì)胞功能；部分lncRNA具順式作用，能夠調(diào)節(jié)鄰近蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄，精密控制多樣性基因位點的時空表達(dá)，從而調(diào)控其功能。盡管lncRNA有這些特殊性，但越來越多的lncRNA的功能和機制已經(jīng)開始被闡明，它的重要性逐漸被人們認(rèn)識到。近些年，大量研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在缺血性腦卒中的病理生理過程中發(fā)揮著重要作用。本文綜述最新的相關(guān)文獻(xiàn)，就lncRNA與缺血性腦卒中相關(guān)分子機制的最新研究進(jìn)展加以綜述，包括lncRNA在缺血性腦卒中后表達(dá)譜的變化、在缺血性腦卒中后細(xì)胞凋亡、血管生成、炎癥和自噬中的調(diào)節(jié)作用等，以期為卒中的更好防護(hù)提供依據(jù)。

注：Enhancer lncRNA(增強子lncRNA)，在基因組的增強子區(qū)域被轉(zhuǎn)錄；Bidirectional lncRNA(雙向lncRNA)，在蛋白質(zhì)編碼基因的啟動子區(qū)域以雙向方式轉(zhuǎn)錄；Intronic lncRNA(內(nèi)含子lncRNA)，在蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)域轉(zhuǎn)錄；Intergenic lncRNA(基因間lncRNA)，在兩個蛋白編碼基因之間轉(zhuǎn)錄；Antisense lncRNA(反義lncRNA)，在重疊的蛋白編碼基因的反義鏈方向上轉(zhuǎn)錄。

1 缺血性卒中后lncRNA表達(dá)譜變化

lncRNA廣泛存在于哺乳動物的腦組織中，基于lncRNA芯片和全基因轉(zhuǎn)錄組測序平臺的多項研究顯示，缺血性腦卒中后lncRNA的表達(dá)譜發(fā)生了廣泛改變，這些改變的lncRNA通過調(diào)控興奮性毒性、氧化應(yīng)激、血管生成、神經(jīng)炎癥、凋亡及自噬等病理機制在神經(jīng)元的死亡和/或再生過程中發(fā)揮著重要作用[4]。Ashutosh Dharap等[5]最早發(fā)現(xiàn)局灶腦缺血再灌注后大鼠腦內(nèi)lncRNA的表達(dá)譜存在變化。隨著技術(shù)的逐漸成熟和研究的不斷深入，Bhattarai等[6]采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)發(fā)現(xiàn)，局灶性腦缺血再灌注誘導(dǎo)小鼠皮質(zhì)中l(wèi)ncRNA表達(dá)發(fā)生了廣泛變化，且這些變化與缺血再灌注時間點(再灌注時間點特異性分析顯示，lncRNA表達(dá)變化在缺血再灌注6 h時達(dá)到峰值)具有明顯的相關(guān)性依賴性表達(dá)特征。另有研究發(fā)現(xiàn)，急性缺血性腦卒中患者lncRNAs表達(dá)譜在急性期(24 h)向亞急性期(7 d)轉(zhuǎn)變期間發(fā)生了顯著變化；且這些差異表達(dá)的lncRNA可能與缺血性腦卒中患者外周免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)過程相關(guān)[7]。此外，Deng等[8]研究發(fā)現(xiàn)，急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者中Linc-DHFRL1-4、SNHG15、Linc-FAM98A-3等lncRNAs的表達(dá)明顯高于健康對照組和短暫性腦缺血發(fā)作者，其中，SNHG15、Linc-FAM98A-3有作為AIS患者生物標(biāo)志物的潛力。

2 lncRNA在腦缺血后的功能意義

缺血性腦卒中后繼發(fā)性細(xì)胞死亡是由多種機制協(xié)同介導(dǎo)的，包括能量耗竭、興奮性毒性、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血管功能障礙、細(xì)胞凋亡和自噬等病理生理機制[9]。越來越多的研究表明，lncRNA在缺血性腦卒中病理生理過程中起著重要調(diào)節(jié)作用，有學(xué)者基于從部分患者中篩查出的差異性lncRNAs，在細(xì)胞或/和動物模型上對這些lncRNAs的相關(guān)功能及下游靶點進(jìn)行了研究(見表1)，有望為腦卒中的有效防控提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。

2.1 lncRNA和缺血后細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡(Apoptosis)是嚴(yán)格受基因控制的細(xì)胞出現(xiàn)的自主有序的死亡，凋亡過程的紊亂會引發(fā)多種疾病的發(fā)生。腦缺血發(fā)生后，受損的細(xì)胞為了適應(yīng)變化的環(huán)境，減少對周圍細(xì)胞的影響，通過一系列調(diào)控方式啟動細(xì)胞凋亡。其中，細(xì)胞在外源性刺激下，死亡配體(如：FasL、TNFR1、DRs)會與細(xì)胞表面的受體(如：Fas、TNF、TRAIL)結(jié)合，激活下游caspase級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控凋亡通路，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而內(nèi)源性刺激則是由線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑激活的，腦卒中后細(xì)胞內(nèi)環(huán)境受損，細(xì)胞外Ca2+大量內(nèi)流，激活線粒體膜上的凋亡蛋白，促使線粒體轉(zhuǎn)化孔開放，釋放Cyto C，進(jìn)而與線粒體外的凋亡蛋白酶激活因子1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)、Pro-caspase-9形成凋亡小體，最終引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

越來越多的研究表明，lncRNA在細(xì)胞凋亡參與的缺血性細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[10,12,13]。lncRNA可直接或間接作用于caspase和Bcl-2兩大家族的凋亡蛋白質(zhì)，影響線粒體凋亡途徑，調(diào)控細(xì)胞凋亡過程。例如，在氧-糖剝離(oxygen-glucose deprivation,OGD)誘導(dǎo)的嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞PC-12中，位于INK4位點的反義lncRNA ANRIL的體外沉默能夠促進(jìn)抗凋亡因子Mcl-1的表達(dá)，抑制線粒體凋亡程序的啟動，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡帶來的損害[10]。體外敲低lncRNA SNHG6則能抑制下游凋亡蛋白caspase-3的活性，并抑制線粒體膜上Bcl-2的下游靶點Bim的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，增加OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞存活率；減少大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠的腦梗死體積[12]。lncRNA也可能通過調(diào)節(jié)下游凋亡蛋白(如：p53)的啟動，調(diào)控由DNA損傷引發(fā)的凋亡。例如，lncRNA MALAT1在缺血性損傷中(包括69例腦卒中患者和OGD/R誘導(dǎo)的HBMECs)能夠下調(diào)MDM2，增加p53蛋白水平，抑制細(xì)胞凋亡[13]。lncRNA還可能通過參與染色質(zhì)異質(zhì)化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能。近期的一項研究顯示，lncRNA Gas5的體外沉默能夠抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3B(DNA methyltransferase 3B,Dnmt3b)的募集，進(jìn)而抑制MAP4K4的甲基化，增加MAP4K4的表達(dá)，減輕由缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡[17]。細(xì)胞凋亡途徑是一個復(fù)雜而又精密的龐大系統(tǒng)，而與lncRNA有關(guān)的細(xì)胞凋亡途徑的研究目前尚處于初步階段，lncRNA如何精細(xì)的調(diào)控卒中后凋亡還有待進(jìn)一步的揭示。

表1 lncRNA在缺血性腦卒中中的作用及相關(guān)機制

2.2 lncRNA和缺血后血管生成 血管生成(Angiogenesis)是指從已有的血管中形成新的血管。在正常生理狀態(tài)下，血管生成受血管生成促進(jìn)因子(如：VEGF、AngⅠ、AngⅡ等)和血管生成抑制因子(如：TSP、ENS等)的調(diào)節(jié)而處于動態(tài)平衡中，可改善周圍組織的血流供應(yīng)。然而，在缺血性腦卒中后，責(zé)任血管支配的腦組織區(qū)域血流迅速下降，導(dǎo)致氧和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足，最終引發(fā)受損腦組織部位細(xì)胞損傷甚至死亡，通過促進(jìn)血管生成及建立側(cè)支循環(huán)可能會誘導(dǎo)損傷腦組織的結(jié)構(gòu)重塑及神經(jīng)功能恢復(fù)[26]。lncRNA表達(dá)譜的改變可能發(fā)揮著誘導(dǎo)或促進(jìn)血管生成的作用[11,21,22]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為血管生成過程中的重要促進(jìn)因子，具有高度特異性，對內(nèi)皮細(xì)胞有明顯的靶向誘導(dǎo)作用[27]。而lncRNA可通過調(diào)節(jié)VEGF來誘導(dǎo)血管生成。例如，在缺氧條件下，體外沉默lncRNA SNHG1能夠減少OGD誘導(dǎo)的小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells,BMEC)中VEGF-A的表達(dá)，進(jìn)而抑制血管生成[11]。在缺血缺氧條件下，低氧轉(zhuǎn)錄因子(hypoxia-inducible factor,HIF-1α)表達(dá)水平升高，可以調(diào)控VEGF/Notch1信號通路，促進(jìn)腦卒中后的血管生成[28]。而源自HIF-1α的天然反義lncRNA HIF1A-AS2作為miR-153p的海綿，通過改變HIF-1α的活性，促進(jìn)VEGF-A表達(dá)，進(jìn)而抑制缺氧條件下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)損傷，促進(jìn)血管生成[21]。此外，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子X-盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein l,XBP1)能促進(jìn)大鼠BMEC存活，誘導(dǎo)血管生成[29]。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)lncRNA DANCR可通過“海綿”作用抑制miR-33a-5p的表達(dá)，促進(jìn)XBP1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)OGD誘導(dǎo)的BMECs存活和血管生成。上述研究顯示lncRNA是腦缺血后血管生成的重要介質(zhì)，進(jìn)一步探索lncRNA在血管生成中的生物學(xué)作用及其機制，有利于為缺血性腦卒中的臨床治療策略奠定基礎(chǔ)。

2.3 lncRNA和缺血后炎癥反應(yīng) 炎癥反應(yīng)(Inflammation)在缺血性腦損傷中起著重要的作用，其過程主要由小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和外周血中的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞介導(dǎo)。其中，小膠質(zhì)細(xì)胞的表型(M1型和M2型)極化在控制促炎和抗炎狀態(tài)之間的平衡中起著重要作用[30]。經(jīng)典激活型(M1極化)的小膠質(zhì)細(xì)胞主要發(fā)揮促炎功能，促進(jìn)IL-1、IL-6、IL-1β、TNF-α和NO、ROS、Glu等促炎因子和介質(zhì)的合成，啟動中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡和繼發(fā)性腦損傷等。而替代激活型(M2極化)的小膠質(zhì)細(xì)胞則通過分泌IL-10、IL-1Ra、IL-37和TGF-β、PDGF等抗炎細(xì)胞因子和生長因子發(fā)揮抗炎功能，促進(jìn)組織修復(fù)和再生，實現(xiàn)對神經(jīng)的保護(hù)作用。小膠質(zhì)細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化在缺血性腦損傷引發(fā)的炎癥過程中起著一定的作用，有望為臨床治療帶來希望。lncRNA在小膠質(zhì)細(xì)胞的表型極化過程中發(fā)揮著一定的作用[19,23]。例如，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19在缺血損傷后(包括腦卒中患者、MCAO小鼠模型及OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞)表達(dá)水平升高，并通過驅(qū)動依賴于組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase1,HDAC1)的M1小膠質(zhì)細(xì)胞極化來促進(jìn)神經(jīng)炎癥[19]。同時，lncRNA也可通過直接或間接方式調(diào)節(jié)炎癥經(jīng)典信號通路NF-κB，維持促炎因子和抗炎因子之間的平衡，抑制炎癥損傷的發(fā)生。例如，在缺血性損傷后(MCAO小鼠和OGD誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞)，lncRNA Nespas能直接和轉(zhuǎn)化生長因子激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1,TAK1)相互作用，阻止E3連接酶TRIM8泛素化調(diào)控K63連接的重要分子TAK1，導(dǎo)致NF-κB失活，抑制神經(jīng)炎癥，減輕細(xì)胞死亡[23]。此外，lncRNA在靶向巨噬細(xì)胞的神經(jīng)炎癥調(diào)控方面也有巨大潛力。研究顯示，在腦卒中急性期，免疫細(xì)胞(包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等白細(xì)胞)會主動遷移到腦病變區(qū)域并加重腦損傷[31]，其中，巨噬細(xì)胞(按來源可分為外周單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MoDM)和小膠質(zhì)細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞(MiDM))在腦卒中誘發(fā)的神經(jīng)炎癥中起著關(guān)鍵作用[9]。新近一項研究使用流式細(xì)胞分選技術(shù)從MCAO的小鼠大腦中分離出了MoDM和MiDM細(xì)胞，并使用RNA深度測序從中鑒定和篩選出對MoDM至關(guān)重要的lncRNA Maclpil。發(fā)現(xiàn)Maclpil通過靶向調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞胞漿蛋白1(lymphocyte cytosolic protein1,LCP1)抑制MoDMs的遷移和吞噬能力，進(jìn)而抑制神經(jīng)炎癥，改善MCAO小鼠神經(jīng)功能[24]。由此可知，lncRNA介導(dǎo)的缺血性損傷后炎癥反應(yīng)的潛在機制復(fù)雜多樣，研究lncRNA在缺血后炎癥反應(yīng)中的機制可能給缺血性腦卒中的臨床抗炎治療帶來希望。

2.4 lncRNA和缺血后細(xì)胞自噬 細(xì)胞自噬(Autophagy)是受基因調(diào)控的，通過破壞異常折疊的蛋白質(zhì)和功能失調(diào)的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞器來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。在正常生理情況下，自噬是真核生物體內(nèi)存在的一種自我保護(hù)機制，能夠通過雙層膜選擇性的將細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包裹在囊泡內(nèi)形成自噬體，進(jìn)而與溶酶體結(jié)合成自溶酶體，對包裹的物質(zhì)進(jìn)行降解，以達(dá)到物質(zhì)的再利用，提供能量，維持細(xì)胞穩(wěn)定。然而，在腦缺血發(fā)生后，因營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、能量供給減少，組織細(xì)胞的自噬水平可能上調(diào)。已有研究表明，可通過調(diào)節(jié)lncRNA調(diào)控缺血后細(xì)胞自噬，減輕缺血性損傷。例如，位于人體染色體11q13上的lncRNA MALAT1可通過新型調(diào)控網(wǎng)絡(luò)MALAT1-miR-30a-Beclin1機制抑制自噬，保護(hù)OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元免受自噬帶來的損害[6]。

腦損傷后，lncRNA可通過多種自噬途徑調(diào)節(jié)自噬水平[20,25]。自噬相關(guān)蛋白7(autophagy related protein 7,ATG7)被認(rèn)為是一種關(guān)鍵的自噬啟動子，特異性的敲低ATG7有利于防止缺氧后的腦損傷[32]，lncRNA可以通過調(diào)控ATG7在自噬中發(fā)揮作用，減輕缺血導(dǎo)致的損傷。例如，反義lncRNA KCNQ1OT1作為miR-200a的競爭內(nèi)源性RNA通過調(diào)節(jié)ATG7的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子FOXO3的表達(dá)，調(diào)節(jié)ATG7的活性，減輕缺血再灌注引發(fā)的自噬，增加N2a細(xì)胞活力[25]。LC3是自噬體形成的關(guān)鍵，LC3合成后經(jīng)磷脂酰乙醇胺(PE)修飾形成LC3-Ⅱ，結(jié)合在自噬體膜上，促進(jìn)自噬體形成，在調(diào)節(jié)腦缺血后神經(jīng)元的自噬活性中起重要作用[33]。H19被證明通過抑制下游效應(yīng)子DUSP5來消除其對LC3-Ⅱ和Beclin1的抑制作用，同時激活ERL1/2，增加OGD/R誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞自噬水平，促進(jìn)MCAO大鼠缺血再灌注損傷[20]。以上研究為基于自噬的腦卒中干預(yù)治療策略提供了新的理論依據(jù)。

3 lncRNA作為缺血性腦卒中生物標(biāo)志物的臨床研究

隨著近些年基因測序技術(shù)的快速發(fā)展，已有臨床研究開始探索急性腦卒中患者體內(nèi)lncRNA及其基因多態(tài)型的表達(dá)變化作為缺血性腦卒中臨床生物標(biāo)志物的潛力。新近一項研究納入了126名AIS患者和126名健康對照者，采用qRT-PCR定量測定方法檢測發(fā)現(xiàn)ANRIL表達(dá)與卒中患者嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，且ANRIL的低表達(dá)與急性缺血性卒中患者的風(fēng)險增加、疾病嚴(yán)重程度和促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、hs-CRP)水平升高有關(guān)。隨著大數(shù)據(jù)的挖掘，有學(xué)者應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)尋找與缺血性腦卒中相關(guān)的關(guān)鍵基因和通路lncRNA。例如，Wang等[34]選擇了3例IS患者和3例正常對照者，應(yīng)用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)技術(shù)，分析和篩選出與IS相關(guān)的關(guān)鍵lncRNA模塊(共調(diào)查了3627個lncRNA，分析了17個模塊)。其中，一個模塊與IS高度相關(guān)，且其與AKT1和MAPK14(IS相關(guān)的兩個中樞基因)信號通路、T細(xì)胞淋巴病毒-1(T cell lymphotropic virus,HTLV-1)感染途徑和mTOR信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)，提示其可能成為未來IS精確診斷和診療的生物標(biāo)志物靶標(biāo)。Cao等[35]從基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中篩選了20例IS患者和20例匹配對照者，構(gòu)建了一種識別IS患者外周血單核細(xì)胞中顯著異常lncRNA的lncRNA介導(dǎo)的調(diào)節(jié)三聯(lián)體(lncRNA-mediated regulatory triplet,lncMRT)網(wǎng)絡(luò)拓補結(jié)構(gòu)，功能分析顯示lncMRTs參與IS后磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路的調(diào)節(jié)。

迄今為止，盡管有關(guān)腦卒中的大多數(shù)lncRNA的研究尚處于初期階段，但這些研究仍然強調(diào)了這一策略的應(yīng)用前景。因此，對lncRNA基因座中關(guān)鍵遺傳變異的鑒定和卒中患者差異表達(dá)的lncRNA基因位點的評估，有望讓基于lncRNA的治療方法進(jìn)入臨床試驗變成現(xiàn)實。

4 展 望

越來越多的證據(jù)顯示，lncRNA在缺血性腦卒中后的病理生理學(xué)中發(fā)揮著廣泛的調(diào)控作用。因此，lncRNA可能會成為有助于腦卒中臨床診療和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。有關(guān)lncRNA的大多數(shù)研究描述了其作為miRNA的海綿效應(yīng)機制，但基于lncRNA-miRNA-mRNA的調(diào)節(jié)機制在腦卒中后是否發(fā)揮著廣泛效應(yīng)，目前尚不清楚。未來，仍需進(jìn)一步就lncRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在缺血性腦卒中后的作用進(jìn)行深入研究，為腦卒中的有效防控提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。