松蘿酸對3種腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響

于大永，郭秀磊，高鴻雁，曹 鶴，史麗穎

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連116622）

松蘿酸是地衣類植物中常見的一種代謝產(chǎn)物，為二苯丙呋喃類化合物.1844年，德國科學(xué)家W.Knop首次在地衣中發(fā)現(xiàn)松蘿酸并分離出來，1933年開始被人工大量合成[1].松蘿酸有2種對應(yīng)異構(gòu)體，分別為（-）-松蘿酸和（+）-松蘿酸[2].松蘿酸主要存在于松蘿等地衣植物中，這種地衣植物在我國主要分布于新疆、甘肅、陜西等地.松蘿酸具有抗炎、抗菌、抗病毒等作用[3-4]，常被用作牙膏和化妝品的添加劑.在美國，其鈉鹽一般用作補充劑來控制體重[5].以往對于松蘿酸的研究主要集中在抗菌、抗炎、抗病毒等方面，近年來關(guān)于松蘿酸抗腫瘤方面的研究逐漸增多.如郝凱華等[6]研究發(fā)現(xiàn)，松蘿酸能夠抑制小鼠H22細(xì)胞的增殖以及血管生成，明顯抑制了VGEF和bFGF的表達；Geng等[7]對肺癌細(xì)胞BGC823和SGC7901的研究表明，松蘿酸能夠引起細(xì)胞發(fā)生G1期和G2期阻滯，從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡；左舒婷[8]研究發(fā)現(xiàn)，松蘿酸能夠體外特異性地殺死乳腺癌細(xì)胞.

白血病是發(fā)生于血液和骨髓中的惡性腫瘤，由于白血病細(xì)胞具有可以避免生長停滯和終末分化的特性，因此白血病治愈的難度非常大[9-11].骨肉瘤是較常見的發(fā)生于青少年或兒童的一種惡性骨腫瘤，根據(jù)最新的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，骨肉瘤在美國最常見的兒童和青少年癌癥中存活率最低[12-13].惡性黑色素瘤是一種侵襲性和治療抵抗性黑色素細(xì)胞惡性腫瘤[14]，在世界范圍內(nèi)發(fā)病數(shù)量約占所有惡性腫瘤的3%.為了進一步挖掘松蘿酸在腫瘤治療方面的應(yīng)用潛力，本研究分別以人白血病細(xì)胞U937、人骨肉瘤細(xì)胞MG-63和人黑色素瘤細(xì)胞A375這3種腫瘤細(xì)胞為材料，通過MTT實驗檢測松蘿酸對這3種細(xì)胞增殖的抑制情況，并篩選出抑制效果最好的細(xì)胞.同時，利用Hoechst 33342染色和Western Blot方法，初步研究松蘿酸對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用機制，為松蘿酸抗腫瘤的新藥開發(fā)及其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 細(xì)胞株

人白血病細(xì)胞U937，Human Sciences Research Bank（日本人類科學(xué)基金會，日本東京）；人骨肉瘤細(xì)胞MG-63，大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院；人黑色素瘤細(xì)胞A375，大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院.

1.1.2 主要試劑

松蘿酸，阿拉丁試劑公司；MTT、DMSO、Caspase-3、GAPDH和抗體，生工生物工程上海股份有限公司；Hoechst 33342染料，北京索萊寶試劑公司；5-氟尿嘧啶（5-Fu），天津金耀氨基酸有限公司；蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，瑞士Roche公司；BCA Protein Assay Kit，碧云天生物技術(shù)研究所；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，北京全式金生物技術(shù)有限公司；Bax抗體、Bcl-2抗體和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG，武漢博士德生物有限公司.

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養(yǎng)箱，新加坡ESCO公司；酶標(biāo)儀、ini-PROTEN system Casting stand制 膠 器、Mini-PROTEN Tetra System電泳槽和PowerPacTM Basic電泳儀，美國BIO-RAD公司；SYGN2/7503化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，英國基因公司.

1.2 方法

1.2.1 藥品的制備

松蘿酸（相對分子質(zhì)量為344.32）溶于一定量的DMSO中，使母液的濃度為50 mmol/L（DMSO的終體積分?jǐn)?shù)小于0.5%），除菌后-20℃保存.

1.2.2 細(xì)胞株的培養(yǎng)

用含有滅活的胎牛血清（體積分?jǐn)?shù)為10%）的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)U937細(xì)胞；用含有10%滅活的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63和A375細(xì)胞.3種細(xì)胞均在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下進行培養(yǎng)，每2 d換液1次，每3 d傳代1次，使細(xì)胞一直保持在對數(shù)生長期，以便用于后續(xù)實驗.

1.2.3 MTT法對藥物增殖抑制作用的測定

選取處于對數(shù)生長期的上述3種細(xì)胞，臺盤藍(lán)染色，利用血球計數(shù)板計數(shù)，選取存活率不低于95%的細(xì)胞進行實驗.調(diào)整U937細(xì)胞的濃度為4×104mL-1，MG-63和A375細(xì)胞的濃度均為2×104mL-1，接種于96孔板中.MG-63和A375細(xì)胞培養(yǎng)12 h后用松蘿酸處理，U937直接用松蘿酸處理.用無血清的培養(yǎng)基稀釋松蘿酸母液，使其濃度分別為12.5、25.0、50.0、100.0μmol/L，依次加入96孔板中，陽性對照組中加入5-氟尿嘧啶（終濃度為100μmol/L）.于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下分別培養(yǎng)24 h和48 h.松蘿酸處理終止前4 h加入10μL的MTT溶液（5 g/L），相同條件下培養(yǎng)4 h后向含有U937細(xì)胞的96孔板中加入200μL的鹽酸-SDS-異丁醇三聯(lián)液，繼續(xù)在相同條件下培養(yǎng)過夜，利用酶標(biāo)儀在570 nm處測定吸光度值OD570.將含有A375和MG-63細(xì)胞的96孔板倒掉上清液，吸去多余液體，每孔加入200μL的DMSO，在搖床上搖晃20 min后于490 nm處測定吸光度值OD490.計算抑制率，實驗重復(fù)3次.

1.2.4 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察

調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105mL-1，向6孔板中加入處于對數(shù)生長期的U937細(xì)胞，利用不同濃度梯度的松蘿酸（0、50、75、100μmol/L）處理6 h后，對照組中加入5-氟尿嘧啶.加入適量的Hoechst 33342溶液（1 mg/mL），使得工作質(zhì)量濃度為2μg/mL，避光染色10 min，收集細(xì)胞，利用PBS清洗3遍，用熒光顯微鏡（日本Nikon公司）拍照.

1.2.5 Western Blot檢測蛋白變化

選取處于對數(shù)生長期的人白血病細(xì)胞U937，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106mL-1，接入6孔板中，加入待測的藥物松蘿酸使其終濃度分別為50、75、100μmol/L.加藥處理6 h后，加入150μL的蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，用Western Blot法測定促凋亡蛋白Bax、逆凋亡蛋白Bcl-2、Caspase-3以及GAPDH的表達，利用Image J軟件分析灰度值.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗重復(fù)3次.利用SPSS 25.0進行單因素方差分析，采用LSD檢驗進行多重比較.以0.01＜P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 松蘿酸對3種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

不同濃度的松蘿酸對3種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制情況如表1所示.

表1 松蘿酸對3種腫瘤細(xì)胞的抑制率Tab.1 Inhibitory rates of three kinds of tumor cells treated with usnic acid %

由表1可以看出，隨著處理濃度的增加，松蘿酸對3種細(xì)胞增殖的抑制作用均增強，且與對照組的差異多數(shù)具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）.這表明松蘿酸對3種腫瘤細(xì)胞均有增殖抑制作用并且呈現(xiàn)出劑量依賴性.不同濃度處理組中，松蘿酸對3種細(xì)胞的抑制率總體上隨著處理時間的延長而增加.

計算松蘿酸對3種腫瘤細(xì)胞的IC50值，結(jié)果如圖1所示.

圖1 松蘿酸對3種腫瘤細(xì)胞的IC50值Fig.1 IC50 value of three kinds of tumor cells treated with usnic acid

由圖1可以看出，3種細(xì)胞在處理48 h時的IC50均低于24 h時的數(shù)值，即松蘿酸對3種腫瘤細(xì)胞的抑制作用具有時間依賴性.作用24 h時，U937、A375和MG-63的IC50分別為90.90、139.48和103.00μmol/L；作用48 h時，3種細(xì)胞的IC50分別為54.08、65.39和90.48μmol/L.比較3種腫瘤細(xì)胞的IC50可知，松蘿酸對人白血病細(xì)胞U937的抑制效果最好.

2.2 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察

不同濃度的松蘿酸處理人白血病細(xì)胞U937 6 h后，細(xì)胞生長情況如圖2所示.

圖2 松蘿酸對人白血病細(xì)胞U937凋亡形態(tài)學(xué)的影響（×200）Fig.2 Effect of usnic acid on the apoptotic morphology of U937（×200）

由圖2可以看出，同對照組相比，50μmol/L處理組中細(xì)胞就已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的凋亡特征，細(xì)胞核的體積縮小，細(xì)胞核裂解并伴有凋亡小體.隨著松蘿酸濃度的增加，細(xì)胞裂解地更加充分，凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加.

2.3 Western Blot檢測凋亡蛋白的表達情況

利用Western Blot檢測松蘿酸處理下腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的變化，結(jié)果如圖3所示.

圖3 松蘿酸處理U937 6 h后凋亡相關(guān)蛋白的變化Fig.3 Expression of proteins related with apoptosis in U937 cells treated with usnic acid for 6 h

由圖3可以看出，隨著松蘿酸處理濃度的增加，促凋亡蛋白Bax的表達量上調(diào)，50、75和100μmol/L處理組中的Bax表達量均顯著高于對照組（P＜0.05）.逆凋亡蛋白Bcl-2和Caspase-3的表達量均隨著松蘿酸處理濃度的增加而顯著下降，3個處理組的表達量均顯著低于對照組.由于Bax的表達量上升Bcl-2的表達量下降，導(dǎo)致Bax/Bcl-2比值增大.

3 討論

本研究用不同濃度的松蘿酸處理人白血病細(xì)胞U937、人骨肉瘤細(xì)胞MG-63和人黑色素瘤細(xì)胞A375，探究松蘿酸對這3種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，松蘿酸對3種腫瘤細(xì)胞均有增殖抑制作用，并呈現(xiàn)出劑量和時間依賴關(guān)系.比較松蘿酸對3種腫瘤細(xì)胞的抑制效果，發(fā)現(xiàn)松蘿酸對人白血病細(xì)胞U937的抑制效果最好，其次是人黑色素瘤細(xì)胞A375.通過Hoechst 33342染色發(fā)現(xiàn)松蘿酸能夠誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞U937發(fā)生凋亡，從而抑制其生長.

左舒婷[8]的研究表明，松蘿酸體外特異性地殺死乳腺癌細(xì)胞主要是通過ROS介導(dǎo)的線粒體凋亡實現(xiàn)的.Fan等[15]研究發(fā)現(xiàn)，松蘿酸對2個髓性白血病細(xì)胞系中Mnk1/el F4E和Pim-1/4E-BP1的信號傳導(dǎo)作用均有抑制作用，可能是一種潛在的原癌基因Pim-1抑制劑.Galanty等[16]研究松蘿酸對前列腺癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞HTC-140的作用，發(fā)現(xiàn)松蘿酸除了具有抑制細(xì)胞增殖的作用外還可抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，這使得松蘿酸有望被用于針對腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)過程的治療.

利用Western Blot檢測松蘿酸處理人白血病細(xì)胞U937后腫瘤相關(guān)蛋白包括Bax、Bcl-2、Caspase-3的變化.Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，可通過調(diào)控線粒體膜的透性控制線粒體凋亡，該家族成員包括促凋亡蛋白（如Bax）和逆凋亡蛋白（如Bcl-2）[17-18]，二者比值決定細(xì)胞的命運，如果比值變大，即增加Bax表達或降低Bcl-2的表達，就會促進細(xì)胞凋亡.半胱天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族在細(xì)胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的主要效應(yīng)者[19-21].本研究發(fā)現(xiàn)，松蘿酸處理U937后，細(xì)胞中Bax蛋白的表達量上升，Bcl-2蛋白的表達量降低，Caspase-3蛋白表達量下調(diào)，Bax/Bcl-2比值增大，即松蘿酸也是通過Caspase依賴性線粒體途徑誘導(dǎo)人白血病細(xì)胞的凋亡.