松針揮發(fā)油對氯仿誘發(fā)小鼠心室顫動(dòng)的影響

黃雪泉 劉明春 蔣能高

松針揮發(fā)油對氯仿誘發(fā)小鼠心室顫動(dòng)的影響

黃雪泉 劉明春 蔣能高

（廣西柳州畜牧獸醫(yī)學(xué)校 廣西 柳州 545003）

試驗(yàn)采用吸入氯仿復(fù)制小鼠心律失常的動(dòng)物模型，觀察灌胃給藥松針揮發(fā)油對抗氯仿誘發(fā)小鼠心律失常的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，松針揮發(fā)油低劑量組(0.320ml/kg)對氯仿所致小鼠心室顫動(dòng)與陰性對照組相比具有顯著對抗作用(P<0.05)，中劑量組(1.010ml/kg)、高劑量組(3.194ml/kg)和美西律組(80mg/kg)對氯仿所致小鼠心室顫動(dòng)與陰性對照組相比具有極顯著對抗作用(P<0.01)。說明松針揮發(fā)油對氯仿誘發(fā)的心律失常具有對抗作用，具有與I類抗心律失常藥的作用。

松針揮發(fā)油 氯仿 誘發(fā) 小鼠 心室顫動(dòng)

松針(Pine needles)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物的針葉，全世界松有一百多種，在廣西境內(nèi)分布的主要為云南松和馬尾松。其松香、松實(shí)、松針歷代均入藥用，而松針采集最為方便[1]，目前國內(nèi)外對松針的研究和利用重點(diǎn)均放在了松針及提取物營養(yǎng)方面[2]；但對松針揮發(fā)油藥理作用研究鮮少，本試驗(yàn)測定松針揮發(fā)油對昆明種小鼠氯仿誘發(fā)小鼠心律失常的影響，觀察其微觀藥用效果，對其藥理作用進(jìn)行研究，旨在為研究開發(fā)松針揮發(fā)油產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 提取馬尾松松針揮發(fā)油方法 供試參照《中國藥典》2000年版一部附錄XD揮發(fā)油測定法(甲法)[3]，將1000g馬尾松新鮮針葉全剪為3.5cm長的規(guī)格，置入6.5L的高壓鍋內(nèi)，加清水2000ml，稍拌后加蓋緊蓋好；鍋置1000W的電爐上，再用乳膠管連接高壓鍋的出氣管口，乳膠管另一端連接測定器的分叉管口；將測定器套緊回流冷凝管，然后安裝其余部件；整個(gè)裝置裝好后，檢查確保牢穩(wěn)、密閉；開電爐加熱，待觀察到有水蒸氣進(jìn)入乳膠管中時(shí)開冷凝水，進(jìn)行蒸餾提??；提取過程中要求有一操作者坐在冷凝回收系統(tǒng)前，從測定器下端不斷放走冷凝水(冷凝水收集于一燒杯內(nèi)并將其蓋好)，待有2cm左右高度的揮發(fā)油后放之入玻璃小瓶內(nèi)、蓋好；不斷接收至出油量很少為止。對于盛放揮發(fā)油小瓶中可能混入的少量水，可用注射器小心將水抽出；將所得揮發(fā)油裝棕色瓶密封后置-20℃冰箱內(nèi)[4]。全部藥液用高壓滅器滅菌，1210C滅菌15~20min，取出后置于40C冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 藥品及試劑 松針揮發(fā)油藥液配制：量取揮發(fā)油0.79、2.50、7.91ml，分別以1%吐溫-80生理鹽水配為120ml，即得松針揮發(fā)油的高、中、低給藥濃度；配好的藥液裝瓶蓋緊置4℃冰箱存放，每天灌胃前2h將藥取出，使藥液溫度和室溫平衡。聚山梨酯-80(吐溫-80)，江蘇省無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司生產(chǎn)(批號201800401)；美西律片，上海醫(yī)藥(集團(tuán))有限公司信誼制藥總廠生產(chǎn)(批號180302)；氯仿，重慶川東化工(集團(tuán))有限公司化學(xué)試劑廠生產(chǎn)(批號20180615)；生理鹽水，山東辰欣藥業(yè)股份有限公司(批號1808290723)。

1.1.3 儀器和器材 RM6240C型多道生理記錄處理系統(tǒng)為廣東省東莞市塘廈興萬電子廠生產(chǎn)，針型電極為江蘇科倫醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 實(shí)試動(dòng)物 用4~5周齡昆明種小鼠150只，雌雄各半，體重25~30g，從廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買(使用許可證：SYXK桂2014-0002)。動(dòng)物在試驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，動(dòng)物房溫度20± 3℃、濕70%左右。標(biāo)準(zhǔn)全價(jià)顆粒飼料由該實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。試驗(yàn)期間動(dòng)物自由飲水、攝食。

1.2 方法

1.2.1 小鼠預(yù)篩試驗(yàn) 自整批小鼠中隨機(jī)取30只，逐一將小鼠放入含有2ml氯仿的棉球(以后每換一只小鼠加入1ml氯仿)倒置的600ml燒杯內(nèi)，使吸入氯仿直至呼吸停止。立即取出小鼠，仰位固定，標(biāo)準(zhǔn)肢I(xiàn)I導(dǎo)聯(lián)測心電圖，通過心電圖判斷室顫發(fā)生率。心室顫動(dòng)發(fā)生率在80%以上方能使用該批小鼠進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)[5]。

1.2.2 分組給藥及造模方法 小鼠隨機(jī)分為五組，每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只，灌胃給藥；實(shí)驗(yàn)組分別給予松針揮發(fā)油高、中、低劑量，給藥劑量如表1所示，給藥容量均為0.2ml/10g體重；陽性對照組給予美西律80mg/kg[6]；陰性對照組給予等容量1%吐溫-80生理鹽水。每日9時(shí)灌胃，1次/d，連續(xù)給藥6d。于末次給藥1hr后，取1.5g脫脂棉，浸含氯仿2ml，放入倒置的600ml燒杯中；逐一將小鼠放入燒杯內(nèi)，使吸入氯仿直至呼吸停止。立即取出小鼠，仰位固定，迅速以針型電極插入三肢皮下記錄標(biāo)準(zhǔn)肢體II導(dǎo)聯(lián)心電圖(ECG)，通過心電圖判斷室顫發(fā)生率。比較試驗(yàn)組與對照組室顫發(fā)生率的差別。

1.2.3 測定小鼠心電圖 （1）用RM6240C型多道生理記錄處理系統(tǒng)測定正常小鼠心電圖，正常小鼠心電圖無Q波，且S-T段短，心電測定參數(shù)為20ms/div，1ms，0.02s，100Hz，zoom(1/2)。（2）測定氯仿空白組誘發(fā)小鼠發(fā)生的室顫，心電測定參數(shù)為5ms/div，200μv，0.02s，30Hz，zoom(1)。（3）分別測定氯仿法松針揮發(fā)油低劑量組(0.320ml/kg)、中劑量組(1.010ml/kg)、高劑量組(3.194ml/kg)的小鼠心電圖，均能抵抗小鼠室顫發(fā)生。心電測定參數(shù)分別為20ms/div，200μv，0.02s，30Hz，zoom(1)；10ms，400μv，0.2s，30Hz，zoom(1)；40ms，200μv，0.2s，30Hz zoom(1)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件的One-way ANOVA，檢驗(yàn)各治療組、陽性對照組與陰性對照組的各計(jì)量指標(biāo)的差別，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果(見附表)

附表 松針揮發(fā)油對小鼠室顫模型的保護(hù)作用(n=7-10)

組別劑量(ml/kg)室顫率 陰性對照組-73.333±3.331 揮發(fā)油低0.32040.000±5.775※ 揮發(fā)油中1.01024.000±3.063※※ 揮發(fā)油高3.19416.270±2.913※※ 美西律組8023.333±8.820※※

注：與陰性對照組對比※P<0.05，※※P<0.01

從試驗(yàn)結(jié)果(表1)可知，發(fā)現(xiàn)松針揮發(fā)油低劑量組(0.320ml/kg)對氯仿所致小鼠心室顫動(dòng)與陰性對照組相比具有顯著對抗作用(P<0.05)，中劑量組(1.010ml/kg)、高劑量組(3.194ml/kg)和美西律組(80mg/kg)對氯仿所致小鼠心室顫動(dòng)與陰性對照組相比具有極顯著對抗作用(P<0.01)。

3 討論

3.1 松針揮發(fā)油的提取和配制

揮發(fā)油是植物中一類具有芳香氣味、在常溫下能揮發(fā)的油狀液體的總稱。揮發(fā)油在植物界分布很廣，特別是菊科、樟科和姜科等植物中[7]。本實(shí)驗(yàn)使用水蒸氣蒸餾法自馬尾松針葉中提取出總揮發(fā)油，其化學(xué)成分復(fù)雜。據(jù)文獻(xiàn)記載主要含有萜烯為主的一系列不飽和碳?xì)浠衔锛捌溲苌?，如?蒎烯、β-丁香烯等。高效毛細(xì)管氣相色譜法測定松葉中α-蒎烯的含量說明：松針的干品和鮮品的α-蒎烯的含量差異顯著[8]。故松針采回后應(yīng)立即進(jìn)行提取，以減少其揮發(fā)性成分耗散。揮發(fā)油提取后冷藏-20℃冰箱中以減少其揮發(fā)和保持其成分穩(wěn)定。吐溫-80是一種乳化劑也是揮發(fā)油的助溶劑。實(shí)驗(yàn)初時(shí)以1%的吐溫-80生理鹽水液溶解松針揮發(fā)油，發(fā)現(xiàn)靜置片刻即分層，故改用5%的吐溫-80生理鹽水液，結(jié)果揮發(fā)油較易溶且不分層[9]。

3.2 心律失常動(dòng)物模型構(gòu)建

研究抗心律失常藥，需要心律失常動(dòng)物模型[9]。實(shí)驗(yàn)性心律失常方法較多，如藥物誘導(dǎo)心律失常法、電刺激引起心律失常法、結(jié)扎冠狀動(dòng)脈引起心律失常法等。但目前尚無一個(gè)理想的心律失常動(dòng)物模型，因此，常需要幾種模型相互配合來分析抗心律失常藥作用機(jī)理[10]?？紤]本課題實(shí)驗(yàn)研究的目的和實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件等因素，本課題采用了氯仿致小鼠心室顫動(dòng)作為初篩實(shí)驗(yàn)；通過肢體標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)記錄心電圖來觀察心律失常發(fā)生、持續(xù)時(shí)間和心律失常類型等。試驗(yàn)采用預(yù)防給藥法。

3.3 松針揮發(fā)油對小鼠室顫的影響

揮發(fā)油低(0.320ml/kg)、中(1.010ml/kg)、高(3.194ml/kg)劑量小鼠灌胃6d，對氯仿致小鼠室顫具顯著對抗作用(與陰性對照組比P<0.05)，說明其可能可以阻止氯仿致的Adr-R依賴性Ca2+內(nèi)流作用[11]。本試驗(yàn)中高劑量組的小鼠死亡較多(死亡3只)，懷疑該劑量對小鼠來說還是過高。因?yàn)楫?dāng)初給藥劑量的確定是根據(jù)林健等文獻(xiàn)記載的松針揮發(fā)性成分小鼠Po的LD50>18g/kg來折算的，折算結(jié)果可能與實(shí)際藥物作用有一定的差距，但此實(shí)驗(yàn)為下一步實(shí)驗(yàn)的用藥劑量提供了參考數(shù)據(jù)。

3.4 氯仿、美西律的作用機(jī)理

3.4.1 氯仿的作用機(jī)理 氯仿誘發(fā)心律失常，可能與促使Adr-R依賴性Ca2+內(nèi)流有關(guān)；與自主神經(jīng)及其遞質(zhì)的釋放、腎上腺髓質(zhì)分泌以及對心臟的直接作用有關(guān)。腎上腺素激活心肌細(xì)胞膜的β受體，使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+過量而誘發(fā)心律失常[11]。本實(shí)驗(yàn)采用以上實(shí)驗(yàn)方法，可以考察松針揮發(fā)油對Ca2+、Na+離子分布及其通道的影響；還考察了揮發(fā)油對多因素如自由基損傷及鈣反?，F(xiàn)象的影響；本試驗(yàn)法是較成熟的，因此能較好的達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

3.4.2 美西律的作用機(jī)理 美西律主要作用于?！窒到y(tǒng)，可縮短浦肯野纖維的動(dòng)作電位時(shí)程和有效不應(yīng)期且縮短動(dòng)作電位時(shí)程更為明顯，故相對延長有效不應(yīng)期；大劑量還可減慢傳導(dǎo)。美西律可口服應(yīng)用，且吸收迅速而完全，生物利用度高。用于治療各種快速性心律失常，如早搏、心動(dòng)過速等[12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其對氯仿所致小鼠的室顫具有顯著對抗作用。

3.5 揮發(fā)油灌胃劑量的摸索

松針揮發(fā)油的灌胃劑量，預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)以文獻(xiàn)記載[13]的其揮發(fā)性成分小鼠Po的LD50>18g/kg來折算小鼠灌胃給藥劑量:即高劑量為6.39ml/kg小鼠；中劑量為2.02ml/kg小鼠；低劑量為0.64ml/kg小鼠。但以此劑量灌胃幾天后發(fā)現(xiàn)小鼠攝食減少，毛色差，體重下降且高劑量組的小鼠死亡較多。故認(rèn)為此劑量偏高了，是造成本實(shí)驗(yàn)中高劑量組的小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡較多的原因。于是調(diào)整正式實(shí)驗(yàn)的灌胃劑量且以小鼠的中劑量的1/2折算為灌胃的高劑量即1.01ml/kg，調(diào)整灌胃劑量后，在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)此劑量對小鼠是合適的，小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡減少。將來可以松針揮發(fā)油的準(zhǔn)確灌胃劑量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：松針揮發(fā)油對氯仿誘發(fā)的心律失常具對抗作用，揮發(fā)油能阻止氯仿所致的鈣離子內(nèi)流作用；松針揮發(fā)油具有與I類抗心律失常藥類似的抗心律失常作用。

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（2020–06–05）

S816.76

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1007-1733(2020)09-0008-03