α7nAChR-HDAC6通路在右美托咪啶降低幼鼠七氟烷神經(jīng)毒性中的作用

朱敏，于洪麗，孫英，杜洪印，喻文立

（南開大學(xué)附屬天津市第一中心醫(yī)院麻醉科，天津300192）

嬰幼兒接受麻醉，特別是生長(zhǎng)發(fā)育爆發(fā)期（3個(gè)月～2歲），神經(jīng)系統(tǒng)容易遭到外界刺激傷害，導(dǎo)致成年后相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠七氟烷暴露可導(dǎo)致幼鼠前額葉皮層NMDA受體亞基組成發(fā)生變化，引起神經(jīng)元退行性變以及成年后學(xué)習(xí)記憶受損[3]。右美托咪啶作為特異性更強(qiáng)的α2受體激動(dòng)劑，具有獨(dú)特鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛及“交感切除”特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用臨床[4]。Dahmani等[5]發(fā)現(xiàn)，右美托咪啶減少神經(jīng)元死亡及凋亡效應(yīng)器caspase-3表達(dá)，可能與激活α2受體，促進(jìn)灶性黏附激酶表達(dá)相關(guān)。課題前期發(fā)現(xiàn)右美托咪啶能夠降低七氟烷麻醉小兒術(shù)后譫妄發(fā)生率及術(shù)后惡心、嘔吐，但具體機(jī)制并未清楚。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)幼鼠七氟烷暴露導(dǎo)致血清中炎性因子表達(dá)顯著增加[6]。α7煙堿型乙酰膽堿受體（α7nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR）為基礎(chǔ)的“膽堿能抗炎通路”可作用于免疫細(xì)胞，抑制炎癥因子釋放；Hui等[8]發(fā)現(xiàn)右美托咪啶預(yù)處理能夠增加神經(jīng)迷走系統(tǒng)活性，而切斷迷走神經(jīng)以及應(yīng)用α7nAChR受體拮抗劑可降低右美托咪啶抑制炎癥反應(yīng)。因此本研究旨在探討α7nAChR相關(guān)膽堿能通路在右美托咪啶降低小兒七氟烷暴露神經(jīng)損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 7 d齡Sprague-Dawle（SD）幼鼠（中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供），采取隨機(jī)數(shù)字表法分為5組（n=40）：空白對(duì)照組（C組），七氟烷麻醉組（S組），右美托咪啶對(duì)照組（D組），七氟烷+右美托咪啶組（SD組），七氟烷+右美托咪啶+抑制劑MLA組（M組）。

1.2 動(dòng)物模型的構(gòu)建 將幼鼠置于3%七氟烷，以100%氧氣為載體，氣體流量4 L/min的培養(yǎng)箱2 h，連續(xù)3 d構(gòu)建七氟烷模型。C組幼鼠置入培養(yǎng)箱前腹腔注射等體積生理鹽水；D組、SD組和M組腹腔注射25 μg/kg右美托咪啶；M組提前30 min注射3 mg/kg MLA，其余同前。麻醉過程中采用氣體監(jiān)測(cè)儀（Drager，Lubeck，Germany）檢測(cè)麻醉箱內(nèi)氧氣、二氧化碳、以及七氟烷濃度。

1.3 ELISA法檢測(cè)促炎因子和腦損傷標(biāo)志物 灌注后斷頭取腦加入生理鹽水，4℃勻漿離心，收取上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)腦組織促炎因子TNF-α、IL1β 和 IL-6，腦損傷標(biāo)志物 S-100β 和NSE水平。具體實(shí)驗(yàn)步驟參見說明書，最后計(jì)算得出相應(yīng)因子濃度。

1.4 尼式染色檢測(cè)神經(jīng)元存活情況 灌注后斷頭取腦，制備海馬區(qū)冠狀石蠟切片，厚度約10 μm，加溫脫蠟后無水乙醇浸泡，滴加尼式染色液，蒸餾水洗滌后脫水封片。采用BX-51光學(xué)顯微鏡觀察并照相，隨機(jī)選取CA1區(qū)連續(xù)不重疊視野，Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件對(duì)神經(jīng)元計(jì)數(shù)，取5個(gè)視野的平均值做統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 Western印跡法檢測(cè)α7nAChR和HDAC6蛋白表達(dá) 斷頭取腦，游離幼鼠海馬組織，預(yù)冷組織蛋白裂解液勻漿，4℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清為組織蛋白。成功提取蛋白進(jìn)行定量檢測(cè)，將等量蛋白煮沸變性，經(jīng)轉(zhuǎn)膜封閉洗滌等步驟后分別加入一抗α7nAChR和HDAC6抗體和β-actin抗體，4℃過夜清洗，二抗室溫孵育，曝光，掃描，采用Gene Tools圖像分析軟件測(cè)定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值反映目的蛋白的表達(dá)情況。

1.6 Y迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)幼鼠認(rèn)知水平 41 d幼鼠進(jìn)行Y迷宮實(shí)驗(yàn)，Y迷宮隨機(jī)分為起始臂（S臂），新異臂（N臂）和其他臂（O臂），N臂內(nèi)壁貼上不同圖形以作區(qū)別。采用Any-maze視頻軟件追蹤分析系統(tǒng)，記錄此時(shí)間段內(nèi)大鼠在各臂的穿梭次數(shù)和停留時(shí)間，計(jì)算大鼠在N臂停留時(shí)間的比例，評(píng)價(jià)幼鼠空間識(shí)別記憶能力。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組促炎因子和腦損傷因子表達(dá)水平 與C組相比，S組、SD組和M組腦組織促炎因子TNF-α、IL1β、IL-6和腦損傷因子S-100β、NSE表達(dá)明顯增加（均P＜0.05）；與S組相比，SD組和M組相關(guān)因子表達(dá)降低（均P＜0.05）；與SD組相比，M組相關(guān)指標(biāo)增加（均P＜0.05），見表 1。

2.2 各組幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活情況 與C組相比，S組、SD組和M組幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列稀疏，存活神經(jīng)元數(shù)目明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與S組相比，SD組和M組幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列稀疏程度改善，存活神經(jīng)元數(shù)目明顯增加（均P＜0.05）；與SD組相比，M組幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列稀疏程度降低，存活神經(jīng)元數(shù)目明顯降低（P＜0.05），見圖1和表2。

表1 各組幼鼠炎癥因子和腦損傷因子表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)（x±s）Tab 1 Expression of inflammatory cytokines and brain injury factors in each group（x±s）

圖1 各組幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元尼氏染色鏡下存活情況（400×）Fig 1 Survival neurons in hippocampal CA1 area with Nissl staining of each group（400×）

表2 各組幼鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元存活情況比較（x±s）Tab 2 Comparison of survival neurons in hippocampal CA1 area of each group（x±s）

2.3 各組幼鼠海馬組織α7nAChR和HDAC6蛋白表達(dá)情況比較 與C組相比，S組、SD組和M組幼鼠海馬組織α7nACh表達(dá)降低，HDAC6增加（均P＜0.05）；與S組相比，SD組和M組α7nAChR表達(dá)增加，HDAC6減少（均P＜0.05）；與SD組相比，M組α7nAChR表達(dá)降低，HDAC6增加（均P＜0.05），見圖2和表3。

圖2 各組幼鼠海馬組織α 7nAChR和HADC6蛋白表達(dá)Fig 2 Expression of α 7nAChR and HDAC6 in hippocampus of each group

表3 各組幼鼠海馬組織α7nAChR和HADC6蛋白（%con組）表達(dá)統(tǒng)計(jì)（x±s）Tab 3 Expression of α7nAChR and HADC6(%con group)in hippocampus of each group（x±s）

2.4 各組幼鼠新異臂停留時(shí)間比較 與C組相比，S組、SD組和M組幼鼠新異臂停留時(shí)間比例明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與S組相比，SD組和M組幼鼠新異臂停留時(shí)間比例顯著增加（均P＜0.05）；與D組相比，M組幼鼠新異臂停留時(shí)間降低（P＜0.05），見表 4。

表4 各組幼鼠新異臂停留時(shí)間比較（x±s）Tab 4 Comparison of time in N arm(%of 60 s)in each group（x±s）

3 討論

嬰幼兒處于大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)形成的關(guān)鍵時(shí)期[1]，特別是處于生長(zhǎng)發(fā)育爆發(fā)期時(shí)，更容易遭受外界如手術(shù)麻醉等刺激傷害，進(jìn)而導(dǎo)致成年相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥。Wilder等[9]臨床研究表明，年齡小于3歲、接受多次麻醉暴露或者麻醉時(shí)間超過3 h的患兒，其在成年后學(xué)習(xí)能力明顯低于正常年齡段小兒。七氟烷因其血?dú)夥峙湎禂?shù)低，呼吸道刺激弱，便于快速誘導(dǎo)和蘇醒，廣泛應(yīng)用于小兒臨床麻醉[10]。研究發(fā)現(xiàn)學(xué)齡前兒童實(shí)施七氟烷麻醉可顯著增加術(shù)后譫妄的發(fā)生率[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)七氟烷暴露導(dǎo)致幼鼠神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙、神經(jīng)炎癥以及神經(jīng)突觸發(fā)生障礙等相關(guān)變化，可能導(dǎo)致遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙，但具體機(jī)制并未完全清楚[12]。因此，探究幼鼠七氟烷麻醉暴露所致神經(jīng)損傷及遠(yuǎn)期認(rèn)知功能障礙的機(jī)制以及保護(hù)措施具有重要的意義。

神經(jīng)炎癥在幼鼠七氟烷麻醉暴露所致神經(jīng)損傷中扮演著重要作用。Wang等[7]發(fā)現(xiàn)幼鼠暴露于4.1%七氟烷6 h可激活NF-κB通路增加血清IL-6和TNF-α表達(dá)。C57出生6 d小鼠暴露3%七氟烷2 h，連續(xù)3 d導(dǎo)致其遠(yuǎn)期認(rèn)知功能水平下降，其機(jī)制與神經(jīng)炎性相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)幼鼠七氟烷暴露可導(dǎo)致腦組織促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6和腦損傷因子表達(dá)顯著增加。研究表明，α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路是神經(jīng)免疫細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用的重要機(jī)制[14]。右美托咪啶作為特異性α2受體激動(dòng)劑能夠增加迷走神經(jīng)活性，改善內(nèi)毒素動(dòng)物炎性模型愈后。本研究發(fā)現(xiàn)七氟烷暴露導(dǎo)致α7nAChR表達(dá)下降，而右美托咪啶處理可顯著增加α7nAChR表達(dá)，提升迷走神經(jīng)活性，抑制促炎因子釋放，發(fā)揮抗炎保護(hù)作用。

HDAC6是唯一催化多種胞漿蛋白而非組蛋白的去乙?；?，主要表達(dá)于神經(jīng)元胞漿，參與神經(jīng)系統(tǒng)軸突運(yùn)輸、突觸傳遞、神經(jīng)炎癥等生物學(xué)反應(yīng)[15]。Akimova等[16]發(fā)現(xiàn)抑制HDAC6表達(dá)可增加Foxp3表達(dá)及乙?；?，促進(jìn)Treg細(xì)胞抑制炎癥反應(yīng)。神經(jīng)發(fā)育期幼鼠多次七氟烷暴露可導(dǎo)致HDAC6表達(dá)及活性增加，并介導(dǎo)神經(jīng)突觸限制性發(fā)育及影響成年大鼠認(rèn)知行為能力[17]。而α7nAChR蛋白激活可顯著抑制HDAC6表達(dá)及生物活性，有效改善神經(jīng)突觸可塑性及認(rèn)知水平[18]。本研究結(jié)果表明七氟烷暴露可增加幼鼠海馬組織HDAC6蛋白表達(dá)，而右美托咪啶可以顯著降低HDAC6表達(dá)；同時(shí)α7nAChR受體拮抗劑MLA可有效逆轉(zhuǎn)右美托咪啶介導(dǎo)的HDAC6抑制作用，降低抗炎作用。

綜上所述，右美托咪啶降低七氟烷麻醉暴露所致膽堿能抑制作用，增加膽堿能受體α7nAChR表達(dá)，抑制組蛋白去乙酰化酶HDAC6表達(dá)，進(jìn)而抑制七氟烷神經(jīng)炎癥毒性反應(yīng)及神經(jīng)發(fā)育障礙作用，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)。