蘇智宏 黎圣金 田長(zhǎng)恩 周玉萍
植物鈣調(diào)素和類鈣調(diào)素是細(xì)胞內(nèi)最重要的一類Ca2+感受器,CaM/CML 通過(guò)與鈣調(diào)素結(jié)合蛋白結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理過(guò)程[1]。擬南芥有4 個(gè)CaM 蛋白和50 個(gè)CML 基因,干旱脅迫下類鈣調(diào)素CML37 突變體積累的ABA含量顯著低于野生型,表明CML37 正向調(diào)節(jié)植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng),參與JA和ABA信號(hào)調(diào)節(jié)[2]。擬南芥IQM4 是一個(gè)Ca2+不依賴型鈣調(diào)素結(jié)合蛋白,通過(guò)參與ABA合成調(diào)節(jié)種子休眠和萌發(fā),但I(xiàn)QM4 上游CaM 或CML尚未鑒定[3]。在通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)來(lái)研究CML37 與IQM4 的相互作用時(shí),觀察到轉(zhuǎn)化了pGBKT7- CML37 和pGADT7 質(zhì)粒的酵母菌在四缺培養(yǎng)基(SD- Ade/His/Leu /Trp)上正常生長(zhǎng)并激活了報(bào)告基因LacZ 的表達(dá)。同時(shí),酵母單雜交實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了擬南芥類鈣調(diào)素CML37 具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
擬南芥為Columbia 生態(tài)型;大腸桿菌為E.coli DH5α;酵母雙雜交系統(tǒng)為Clontech公司的Matchmaker Gal4 Two- Hybrid System3;Carrier DNA 購(gòu)自Sigma 公司;實(shí)驗(yàn)所使用的膠回收試劑盒、DNA 片段純化試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶、DNA 連接酶、PRIMER STAR 高保真DNA 聚合酶、rTaq DNA 聚合酶均為TaKaRa 公司產(chǎn)品。
1.2.1 擬南芥CML37 與IQM4 基因克隆
從TAIR 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取CML37 和IQM4 的CDS 序列,分別設(shè)計(jì)克隆引物。以擬南芥cDNA 為模板,利用PRIMERSTAR 高保真DNA 聚合酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,PCR 反應(yīng)結(jié)束后,取少量產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。
1.2.2 酵母表達(dá)載體構(gòu)建
PCR 產(chǎn)物分別用DNA 片段純化試劑盒純化后,其中AD- CML37 片段用EcoR I 和BamH I 定向插入酵母表達(dá)載體pGADT7 質(zhì)粒,BD- CML37 片段用EcoR I 和Pst I 定向插入pGBKT7 質(zhì)粒,而IQM4 片段用Nde I 和Xma I 分別定向插入pGADT7 和pGBKT7 質(zhì)粒。4 種連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞,涂布至含相應(yīng)抗生素的LB 固體培養(yǎng)基(pGADT7 為氨芐青霉素抗性;pGBKT7為硫酸卡那霉素抗性),使用克隆用引物直接菌落PCR 鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子并送至華大公司測(cè)序證實(shí)。
1.2.3 酵母單雜交分析
采用PEG/LiAC 法將BD- CML37 和BD 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞AH109(圖1),涂布于SD- Trp;將AD- CML37和AD 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞并涂布于SD- Leu,30℃培養(yǎng)4 d 至菌落形成。從SD- Trp 平板上挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種于SD- Ade/His/Trp,從SD- Leu 平板挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的單菌落接種于SD- Ade/His/Leu,30℃繼續(xù)培養(yǎng)4 d。
擬南芥CML37 的CDS 序列長(zhǎng)558bp,IQM4 的CDS 序列長(zhǎng)1599bp,克隆產(chǎn)物經(jīng)PCR 擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳后,得到的條帶符合預(yù)期。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞,采用菌落直接PCR 鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,陽(yáng)性克隆送至華大公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果證明CML37、IQM4 基因序列內(nèi)部沒有發(fā)生改變。
前期酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,含有AD- IQM4+BD- CM L37 和AD+BD- CML37 質(zhì)粒組合的酵母菌不僅在四缺培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng),還能分解X- α- gal 產(chǎn)生藍(lán)色菌落;但AD- CML 37+BD- IQM4 質(zhì)粒組合的酵母不能在四缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。結(jié)果表明:在酵母細(xì)胞內(nèi),CML37 不能與IQM4 蛋白相互作用,BD- CML37 融合蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子功能,而AD- CML37 不具備轉(zhuǎn)錄因子功能。
酵母單雜交實(shí)驗(yàn)中將AD- CML37 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后,涂布于SD- Leu 上培養(yǎng)4d 后,將轉(zhuǎn)化酵母轉(zhuǎn)接到SD- Leu/His/Ade 上繼續(xù)培養(yǎng)4d 后沒有觀察到酵母菌落(圖1A);將BD- CML37 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后,涂布于SD- Trp 上培養(yǎng)4d 后,挑取篩選培養(yǎng)基上的酵母接種另一種三缺培養(yǎng)基SD- Trp/His/Ade 上繼續(xù)培養(yǎng)4d 后觀察到酵母菌落(圖1B)。轉(zhuǎn)化有BD- CML37 質(zhì)粒的酵母菌能夠在三缺培養(yǎng)基上生長(zhǎng),但轉(zhuǎn)化AD- CML37 質(zhì)粒的酵母菌不能生長(zhǎng)。酵母單雜交分析表明,擬南芥CML37 蛋白缺少DNA 結(jié)合活性,但具有激活活性;在酵母細(xì)胞中,CML37 與BD(DNA 結(jié)合域)融合后具有轉(zhuǎn)錄因子的功能。
圖1 CML37 的酵母單雜交分析
酵母雙雜交技術(shù)交廣泛應(yīng)用于蛋白分子之間相互作用的研,酵母單雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驊?yīng)用于驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子的DNA 結(jié)合活性和自激活活性[4],擬南芥CML37 蛋白有3 個(gè)EF- hand 基序,沒有其他功能結(jié)構(gòu)域,但酵母雙雜交和單雜交分析都證明CML37具有轉(zhuǎn)錄激活功能,說(shuō)明CML37 基因功能研究還存在未認(rèn)識(shí)的問題。