益生菌ABC轉(zhuǎn)運體寡糖結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)學研究進展

蘇思韻,楊思婷,張宇博,周志立,黃珍金,鐘先鋒,黃桂東

(佛山科學技術(shù)學院食品科學與工程學院,廣東省傳統(tǒng)發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心,廣東省食品流通安全控制工程技術(shù)研究中心,佛山市釀造工程技術(shù)研究中心,佛山農(nóng)業(yè)生物制造工程技術(shù)研究中心,廣東佛山 528231)

人體腸道定殖一系列微生物菌群,共同維持著腸道的微生態(tài)平衡。益生菌是對人體健康有益的一類微生物,其包括雙歧桿菌、乳桿菌、芽孢桿菌等[1]。這些菌群對宿主的益處表現(xiàn)在其能夠產(chǎn)生維生素、氨基酸、短鏈脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì),有助于機體的代謝[2]。其次,益生菌能夠產(chǎn)生抗菌肽等靶向作用于細菌的物質(zhì),從而有效地抑制病原菌[3]。同時,有助于增強機體的免疫應答[4],降低炎癥反應[5-7]。益生菌還能參與治療結(jié)腸炎[8]、自身免疫性疾病[9]、兒童咳嗽變異性哮喘[10]等疾病。

寡糖的攝入有助于益生菌的增殖和代謝,對人體有益。首先,寡糖的攝入有助于促進腸道益生菌的增殖和活力,顯著增加雙歧桿菌、乳酸桿菌、腸球菌的數(shù)量[11-13],同時有助于減少炎癥及其相關(guān)癥狀[14]。其次,寡糖被益生菌代謝產(chǎn)生乳酸、短鏈脂肪酸等[15-17],降低腸道pH,抑制有害菌的生長。其能改善鈣的吸收從而促進骨骼健康[18],還有助于降低心血管疾病風險[19-22]。

益生菌的基因組編碼了一系列能夠識別并轉(zhuǎn)運寡糖的ABC通道[23-25]。其中一類ABC通道(如ECF型ABC通道),在攝入寡糖的過程中,不需要胞外底物識別亞基[24]。該通道由兩個跨膜亞基(EcfS和EcfT)以及兩個位于細胞質(zhì)的亞基(EcfA1和EcfA2)組成。跨膜亞基EcfS能夠直接識別底物,而EcfA1和EcfA2則是核苷酸結(jié)合亞基,能夠組裝成二聚體以協(xié)助供能。本課題組首先在嗜酸乳桿菌CICC22162中識別了轉(zhuǎn)運水蘇糖的ECF通道[24]。還有一類ABC通道(如MSM型ABC通道)[26],在攝入寡糖的過程中,需要胞外底物識別蛋白。該類型通道能夠通過位于胞外區(qū)域的底物結(jié)合蛋白(solute-binding protein,SBP)識別寡糖底物,進一步通過SBP與跨膜亞基的互作將底物傳遞進細胞。

本文將益生菌結(jié)合寡糖的ABC通道胞外的底物結(jié)合蛋白稱為寡糖結(jié)合蛋白。探討寡糖結(jié)合蛋白識別寡糖的作用細節(jié),有助于深入理解益生菌攝入寡糖的分子機制。經(jīng)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)學工作者的不懈努力,一系列ABC通道的寡糖結(jié)合蛋白的原子結(jié)構(gòu)得以解析。本文將對益生菌中寡糖結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特性及識別寡糖的異同進行綜述。

1 ABC通道寡糖結(jié)合蛋白的共性

近年來,部分益生菌中寡糖結(jié)合蛋白的空間結(jié)構(gòu)獲得解析。與之前報道的ABC通道底物結(jié)合蛋白[27-29]相似,這些寡糖結(jié)合蛋白在結(jié)構(gòu)上具有共性,具體表現(xiàn)在該類蛋白是由α和β兩個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,在未與底物結(jié)合時,寡糖結(jié)合蛋白展示更加柔性的特征,使得α和β結(jié)構(gòu)域能夠在鉸鏈區(qū)附近自由旋轉(zhuǎn)。這種自由旋轉(zhuǎn)使得蛋白的α和β結(jié)構(gòu)域能夠傾向于分開,從而使其構(gòu)象以“開啟”狀態(tài)存在。在與底物結(jié)合時,蛋白構(gòu)象以“關(guān)閉”狀態(tài)存在,此時作為底物的寡糖被α和β結(jié)構(gòu)域之間的接觸面識別。該過程也被形象稱為“捕蠅夾”機制[30]。圖1A展示了典型的寡糖結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)共性,包括了由鉸鏈區(qū)連接的α和β結(jié)構(gòu)域。圖1B代表了結(jié)構(gòu)已經(jīng)鑒定的寡糖結(jié)合蛋白,分別是甘露寡糖結(jié)合蛋白(PDB:6I5W)[23]、阿拉伯木糖結(jié)合蛋白(PDB:4C1U)[31]、巖藻糖基乳糖結(jié)合蛋白(PDB:6HUR)[32]、乳糖-N-二糖結(jié)合蛋白(PDB:2Z8D)[33]、棉子糖系列寡糖結(jié)合蛋白(PDB:4RK9)。其α和β結(jié)構(gòu)域之間形成底物的結(jié)合口袋,有利于底物的識別。

2 寡糖結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)特性及其底物功能研究

2.1 甘露寡糖結(jié)合蛋白

2.1.1 結(jié)構(gòu)特性 雙歧桿菌中存在能夠結(jié)合甘露寡糖的蛋白BlMnBP1。該蛋白能夠與甘露二糖、甘露三糖、甘露五糖發(fā)生相互作用。BlMnBP1與底物互作界面既包括直接的氫鍵相互作用,也包括水分子介導的間接氫鍵作用(如圖2所示)。甘露二糖、甘露三糖和甘露五糖均存在于BlMnBP1的空腔口袋中,這三個寡糖具有不同的糖鏈長度。其中,甘露五糖在這三個寡糖中具有最長的糖鏈,能夠與BlMnBP1的16個氨基酸形成氫鍵相互作用,而甘露三糖和甘露二糖則分別與BlMnBP1的10個和6個氨基酸形成氫鍵作用。甘露五糖能夠與BlMnBP1的3個正電荷氨基酸K126、K152和K287形成最直接的鹽橋相互作用,其鹽橋的距離分別為5.35、5.46和3.68 ?。而甘露三糖和甘露二糖僅與BlMnBP1的1個正電荷氨基酸K287形成鹽橋作用,其鹽橋距離分別為3.75和3.80 ?。

圖2 雙歧桿菌甘露寡糖結(jié)合蛋白的空間結(jié)構(gòu)信息

糖鏈最長的甘露五糖通過3個水分子介導與BlMnBP1的相互作用,而糖鏈最短的甘露二糖則通過13個水分子介導間接相互作用。其中Q223通過4個水分子與甘露二糖形成相互作用,而N163則通過2個水分子形成相互作用。這也表明短糖鏈的甘露二糖,需要通過更多的水分子,維持空腔處構(gòu)象的穩(wěn)定。

這三種寡糖與BlMnBP1之間形成微摩爾級別的結(jié)合力(表1)。SPR試驗測得BlMnBP1與甘露二糖、甘露三糖和甘露五糖的結(jié)合力分別為187、82、108 μmol/L。ITC測得BlMnBP1與甘露二糖、甘露三糖的結(jié)合力分別為820和262 μmol/L。這表明甘露三糖在識別受體的過程中比甘露二糖的結(jié)合力稍強。甘露三糖識別BlMnBP1和BlMnBP2代表了一種相似的結(jié)合力。

2.1.2 底物的功能研究 甘露聚糖是一個重要的半纖維素聚合物,是木質(zhì)纖維素的主要成分[34]。甘露聚糖能被腸道微生物,如青春雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌和蓋氏乳桿菌等利用,而產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸桿菌等產(chǎn)生有害物質(zhì)的有害菌則不能利用甘露聚糖[35]。甘露聚糖被腸道菌群發(fā)酵后,最終生成乙酸、丙酸和正丁醇等短鏈脂肪酸[35],有利于調(diào)節(jié)腸道健康。

2.2 巖藻糖基乳糖結(jié)合蛋白

2.2.1 結(jié)構(gòu)特性 雙歧桿菌中存在能夠結(jié)合巖藻糖基乳糖的蛋白BiFl2BP。BiFl2BP能夠識別2′-巖藻糖基乳糖和3-巖藻糖基乳糖。與BlMnBP1和BlAXBP不同的是,巖藻糖基乳糖在與BiFl2BP相互作用過程中,除了氫鍵相互作用外,還通過范德華力與周圍一系列非極性氨基酸形成疏水相互作用,如N39、A88和F92。這種疏水相互作用極大的增加了BiFl2BP與底物的結(jié)合能力。通過ITC及SPR對結(jié)合力的測定(表1)表明,BiF12BP能夠以5～10 μmol/L的親和力識別巖藻糖基乳糖,遠高于BlMnBP1和BlAXBP對寡糖的識別。除了疏水相互作用,該蛋白能通過11至13個氫鍵相互作用識別底物,這極大的穩(wěn)定了巖藻糖基乳糖靠近空腔的區(qū)域。特別是水分子介導的間接氫鍵相互作用中,2′-巖藻糖基乳糖能夠通過水分子與Q63形成三個顯著的相互作用,還能通過水分子與S212、S322形成間接相互作用。這些水分子介導的相互作用在3-巖藻糖基乳糖的識別過程中沒有出現(xiàn),也體現(xiàn)了該識別過程的特異性。

2.2.2 底物的功能研究 巖藻糖基乳糖是母乳寡糖的重要組成成分,能被長雙歧桿菌攝入并產(chǎn)生乳酸和脂肪酸,顯著降低腸道pH[36]。腸道中的病原菌如產(chǎn)氣莢膜桿菌則不能大量利用巖藻糖基乳糖,且該菌的生長在低pH環(huán)境受到抑制[36]。體外實驗表明,2′-巖藻糖基乳糖可抑制病原菌如空腸彎曲桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸型血清沙門氏菌和銅綠假單胞菌對人腸細胞系Caco-2的粘附,而3-巖藻糖基乳糖可抑制人腸致病性大腸桿菌、銅綠假單胞菌對人腸細胞系Caco-2的粘附[37]。此外,2′-巖藻糖基乳糖能直接下調(diào)CD14的表達,影響革蘭氏陰性菌的脂多糖的識別和結(jié)合,從而減少革蘭氏陰性菌在腸道的定殖[38]。用含有2′-巖藻糖基乳糖的配方奶粉喂養(yǎng)嬰兒,嬰兒的炎癥細胞因子較低,達到與母乳喂養(yǎng)的嬰兒相似的水平[39]。

2.3 乳糖-N-二糖結(jié)合蛋白

2.3.1 結(jié)構(gòu)特性 BlGL-BP對乳糖-N-二糖、半乳-N-二糖及乳糖-N-四糖的識別也展示了顯著的差異。ITC測定BlGL-BP與這三個寡糖的相互作用(表1)表明,BlGL-BP能夠較強地結(jié)合半乳-N-二糖,而與乳糖-N-四糖展示最弱的結(jié)合。結(jié)構(gòu)分析表明(圖3),BlGL-BP與這三個底物的結(jié)合表面出現(xiàn)了相似數(shù)量的氫鍵相互作用以及水介導的間接作用,特別是R49均能與三個底物形成鹽橋。這些結(jié)構(gòu)特性表明長雙歧桿菌的乳糖-N-二糖結(jié)合蛋白的進化關(guān)系具有相近的同源性,這些蛋白對非還原性半乳糖的識別基本上是保守的,而相鄰的位置是多樣化,以適應不同的糖苷鍵和單糖殘基[40]。

圖3 乳糖-N-二糖結(jié)合蛋白與三個底物的作用細節(jié)

2.3.2 底物的功能研究 乳糖-N-二糖、半乳-N-二糖及乳糖-N-四糖是母乳寡糖的重要成分,在嬰兒正常發(fā)育中發(fā)揮重要作用[41]。有研究[41-42]表明其能特異性地促進嬰兒腸道的雙歧桿菌增殖。

2.4 阿拉伯木糖結(jié)合蛋白

2.4.1 結(jié)構(gòu)特性 雙歧桿菌中還存在能夠結(jié)合阿拉伯木糖的蛋白BlAXBP。BlAXBP與其底物的相互作用界面主要由氫鍵相互作用以及水分子介導的氫鍵作用組成(如圖4所示)。在BlAXBP參與識別阿拉伯木三糖的過程中,共有10個氨基酸參與底物的直接氫鍵相互作用,分別是N39、S41、A42、N72、E73、F75、A76、L96、Q254和D386。其中,N39、S41、N72和G77也能夠通過水分子介導與阿拉伯木三糖的間接相互作用。而在BlAXBP識別阿拉伯二糖的過程中,僅通過五個氨基酸N39、N72、Q254、Y346和D386與配體形成氫鍵相互作用。同時還可以觀察到H199能夠與配體形成直接的鹽橋相互作用。水分子介導了8個間接的相互作用,這也表明二糖在結(jié)合空腔中的穩(wěn)定存在也較多依賴于水分子。結(jié)合力測定(表1)表明阿拉伯木二糖和阿拉伯木三糖與BlAXBP的相互作用力較為接近,分別為81和71 μmol/L。

圖4 雙歧桿菌阿拉伯木糖結(jié)合蛋白的空間結(jié)構(gòu)信息

表1 益生菌中已鑒定結(jié)構(gòu)的寡糖結(jié)合蛋白

2.4.2 底物的功能研究 阿拉伯木聚糖(arabinoxylo-oligosaccharides,AXOS)具有促進人結(jié)腸雙歧桿菌生長和生產(chǎn)丁酸鹽的能力[43],具有雙歧作用和產(chǎn)丁酸作用[44]。飲食健康人群每天攝入10 g AXOS,可以促進雙歧桿菌的增長,同時抑制尿毒素對甲酚的排泄。另一研究表明,只需要在飲食中添加2.2 g的AXOS即可促進氮從尿道排泄轉(zhuǎn)換到從糞便排泄,這種轉(zhuǎn)換是一種有益的轉(zhuǎn)換,減少了對腎的損傷[45]。長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)和直腸真桿菌(Eubacteriumrectale)以AXOS為碳源共同培養(yǎng)時,兩株菌株的生長和基因表達都受到共同培養(yǎng)的影響。長雙歧桿菌消耗了AXOS的阿拉伯糖基,同時產(chǎn)生乙酸鹽,乙酸鹽隨后通過直腸真桿菌的發(fā)酵產(chǎn)生丁酸鹽[44]。

2.5 棉子糖系列寡糖結(jié)合蛋白

2.5.1 結(jié)構(gòu)特性 芽孢桿菌中存在能夠識別棉子糖系列寡糖家族的結(jié)合蛋白MsmE(圖5)。其中,地衣芽孢桿菌中的BlMsmE與水蘇糖的復合體結(jié)構(gòu)模型在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報道。該結(jié)構(gòu)模型代表了BlMsmE的一種“閉合”狀態(tài),即BlMsmE形成一個顯著的結(jié)合口袋,與水蘇糖形成直接作用。同時,枯草芽孢桿菌BsMsmE未與底物結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)也在數(shù)據(jù)庫中得到報道,該模型采取了一種顯著的“開啟”狀態(tài)。與“閉合”狀態(tài)的BlMsmE不同,該開啟狀態(tài)的α結(jié)構(gòu)域和β結(jié)構(gòu)域傾向于分開,從而形成更加自由擺動的空間構(gòu)象。這也意味著該類蛋白可能通過其顯著的構(gòu)象變化識別完成對棉子糖家族寡糖的攝入。

圖5 棉子糖系列寡糖結(jié)合蛋白的晶體結(jié)構(gòu)

2.5.2 底物的功能研究 棉子糖系列寡糖包括棉子糖、水蘇糖、毛蕊草糖等。其中,水蘇糖能改善腸道微環(huán)境[46],有助于糖尿病的治療[47]。Liu等[47]比較了水蘇糖和二甲雙胍均對2型糖尿病大鼠的糖尿病有改善,同時降低大鼠的炎癥水平。在分別給予大鼠水蘇糖或二甲雙胍4周后,采血分析生化指標。結(jié)果表明,水蘇糖和二甲雙胍均降低了血清脂多糖含量,同時降低炎癥因子(IF-6)和腫瘤壞死因子α的表達。

2.6 環(huán)糊精結(jié)合蛋白

2.6.1 結(jié)構(gòu)特性 干酪乳桿菌中存在環(huán)糊精和麥芽寡糖的結(jié)合蛋白(圖6A)。該蛋白在與底物結(jié)合后,發(fā)生了顯著的構(gòu)象變化。該構(gòu)象變化包括兩部分,首先在螺旋處的位置發(fā)生了顯著的空間遷移,其次部分螺旋區(qū)域變成了無規(guī)則卷曲。進一步比較LcMalE1與α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精、γ-環(huán)糊精的結(jié)合模式,發(fā)現(xiàn)α-環(huán)糊精形成了相對較小的環(huán)狀構(gòu)象(圖6B),而β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精展示了較大的環(huán)狀構(gòu)象,且這兩個構(gòu)象的尺寸較為接近。這很好的解釋了LcMalE1與α-環(huán)糊精的結(jié)合力弱于β-環(huán)糊精與γ-環(huán)糊精。還比較了LcMalE1與β-環(huán)糊精和麥芽四糖的結(jié)合模式(圖6C)。麥芽四糖在結(jié)合口袋的位置展示了與β-環(huán)糊精相似的非閉合環(huán)狀模式,這種模式使其穩(wěn)定的定位在結(jié)合口袋中,并且展示了與β-環(huán)糊精相似的強結(jié)合力。

圖6 乳桿菌寡糖結(jié)合蛋白的空間結(jié)構(gòu)信息

2.6.2 底物的功能研究 環(huán)糊精在胃腸道中不能被消化,或只能部分消化,到達腸道后被腸道菌群發(fā)酵利用[48]。α-、β-、γ-環(huán)糊精分別由六、七、八個葡萄糖組成[49]。α-環(huán)糊精在腸道發(fā)酵產(chǎn)生有機酸、短鏈脂肪酸,通過調(diào)節(jié)脂類代謝相關(guān)基因的表達從而減少肥胖。Nihei等[50]研究了α-環(huán)糊精的攝入對高脂肪飲食誘發(fā)的肥胖模型鼠的影響。與高脂飲食小鼠腸道的擬桿菌、雙歧桿菌和乳酸菌減少不同,攝入α-環(huán)糊精的小鼠腸道細菌總數(shù)增加。α-環(huán)糊精的攝入能夠增加小鼠盲腸的乳酸和短鏈脂肪酸(如醋酸、丙酸和丁酸)的濃度,降低盲腸的葡萄糖濃度。此外,基因表達水平試驗表明,α-環(huán)糊精誘導過氧化物酶體增殖物激活受體γ和α的基因表達上調(diào),這兩個受體分別與脂肪細胞的分化和能量消耗相關(guān)。而補充α-環(huán)糊精使固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c和脂肪酸合酶的基因表達下調(diào),該兩個基因均與脂肪組織的脂肪酸和甘油三酸酯合成相關(guān)[50]。Grunberger等[51]研究表明,補充α-環(huán)糊精能改善肥胖II型糖尿病患者的脂肪代謝?；颊哌B續(xù)3個月每天補充6 gα-環(huán)糊精,體重能減輕或至少保持在原來狀態(tài),對胰島素敏感性增加,脂聯(lián)素水平增加,血漿甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇降低[51]。

3 結(jié)論

胃腸道是一個復雜的生態(tài)系統(tǒng),是一個多樣化的高度進化的微生物群落[54]。腸道中的不同細菌有其偏好的攝食圖譜,這種現(xiàn)象被稱為“交叉攝食”[55-60]。有報道稱,從嬰兒腸道分離的長雙歧桿菌偏好短鏈人體母乳寡糖,而不是復雜的高分子量人體母乳寡糖[61]。即使是同屬于雙歧桿菌的長雙歧桿菌(B.bifidum)和嬰兒雙歧桿菌(B.infantis),其利用寡糖的策略都不同。B.bifidum和B.infantis存在于嬰兒腸道中,競爭攝取利用母乳中的寡糖。B.infantis擅長通過寡糖結(jié)合蛋白攝入母乳寡糖,而B.bifidum使用幾組糖基水解酶,先將復雜的寡糖降解,再攝入胞內(nèi)[41]。與益生菌不同,腸道致病菌沙門氏菌的寡糖結(jié)合蛋白更偏向于結(jié)合單糖β-D-葡萄糖、β-D-半乳糖等單糖[62-65]。研究腸道不同菌群偏好的寡糖,有助于精準調(diào)控腸道菌群,促進人體健康。

ABC通道是益生菌重要的寡糖攝取通道,其寡糖結(jié)合蛋白的作用是識別和結(jié)合寡糖,很大程度上決定了ABC通道的底物特異性[31,66]。寡糖運輸?shù)鞍资莾?yōu)選的研究糖代謝偏好性的探針,因為它能特異性直接與特定寡糖作用[40]。寡糖轉(zhuǎn)運體的生化和結(jié)構(gòu)表征,是實現(xiàn)基于基因組序列數(shù)據(jù)的代謝偏好研究的關(guān)鍵[40]。此外,了解寡糖結(jié)合蛋白與底物的作用細節(jié),有助于開發(fā)新型益生元,評價益生元的功效。隨著經(jīng)濟社會的發(fā)展,功能性食品行業(yè)發(fā)展迅猛。當代功能性食品的開發(fā),需要經(jīng)過人體及動物實驗驗證是否具有某種生理功能。同時,還需要明確功效成分,及其含量、結(jié)構(gòu)、作用機理等。研究益生菌的寡糖結(jié)合蛋白,以及該類蛋白的寡糖識別機制,為益生元類功能性食品的開發(fā)提供理論支撐。

本論文綜述了人體腸道益生菌中ABC通道寡糖結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)學研究進展。盡管不同的寡糖結(jié)合蛋白展示了三級結(jié)構(gòu)相似性,其特異性識別寡糖的分子機制各不相同。X-射線晶體結(jié)構(gòu)揭示了寡糖結(jié)合蛋白識別線型、環(huán)型寡糖的原子細節(jié),也揭示了其結(jié)合底物,以及未結(jié)合底物的結(jié)構(gòu)異同。目前,還存在一系列益生菌的寡糖結(jié)合蛋白尚未被鑒定和解析,對其結(jié)構(gòu)學研究為進一步認知益生菌寡糖攝入機制,提供研究基礎(chǔ)。