苦蕎麩皮總黃酮體外抗氧化活性及體內(nèi)解酒護肝作用

童鈺琴,李 姝,牛曼思,王松濤,楊雪琴,孫 琴4,,*,冉茂芳

(1.西南醫(yī)科大學藥學院,四川瀘州 646000;2.瀘州品創(chuàng)科技有限公司,四川瀘州 646000;3.四川大學生命科學學院資源微生物學及生物技術(shù)教育部重點實驗室,四川成都 610064;4.西南醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合藥物研究中心,四川瀘州 646000)

苦蕎麥(Tartary buckwheat),學名韃靼蕎麥(Fagopyrumtataricum(L.)Gaerth),是廖科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrom)的一種營養(yǎng)價值豐富的藥食兩用糧食作物[1]。苦蕎在中國有著悠久的食用歷史,《本草綱目》中記載其有益氣力、續(xù)精神、利耳目、降氣寬腸、健胃的作用?？嗍w麥中除了含有蛋白質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)及維生素等豐富的營養(yǎng)成分外,還含有黃酮類、酚酸、單寧、植物甾醇等生物活性物質(zhì)[2]。

中國有悠久的釀酒歷史和內(nèi)涵豐富的酒文化,酒作為人們?nèi)粘Ｉ钪械囊环N重要飲品,正逐漸成為各種社交及情感溝通的媒介[3]。近年來雖然歐洲國家的酒精性飲料消費量略有下降,但包括中國在內(nèi)的其他國家銷量仍呈現(xiàn)上漲趨勢,因過度飲酒所帶來的個人健康及全球公共衛(wèi)生問題也受到廣泛的關(guān)注[4-5]。正常情況下,自由基及活性氧(Reactive oxygen species,ROS)都是機體的正常代謝物,機體也處于氧化還原的動態(tài)平衡中,因而理性適量的飲酒不會對身體造成嚴重損害;但是長期大量的飲酒則會破壞機體的氧化還原平衡,引起機體的氧化損傷,造成機體生理功能的紊亂[6-7]。過度飲酒嚴重時還會造成酒精性肝損傷,進而引發(fā)酒精性肝炎、肝臟脂肪變性、肝硬化、肝癌等病理性疾病,對機體健康造成威脅[8-9]。因此,解酒護肝產(chǎn)品的研究與開發(fā)也逐漸受到了社會各界的重視。

目前市面上的解酒產(chǎn)品多以古方中的中草藥結(jié)合現(xiàn)代化的手段來進行開發(fā),這些產(chǎn)品以其低毒副作用等優(yōu)勢成為市場上的主流產(chǎn)品,但同時也存在活性成分不明確等問題[10]。近年來的研究表明,膳食中含有的活性物質(zhì)如黃酮、白藜蘆醇、皂苷、多糖和β-胡蘿卜素等,可通過抗氧化、抗炎、促凋亡等多種機制對酒精造成的肝損傷產(chǎn)生保護作用[11-12]。作為植物中普遍存在的一類天然化合物,黃酮類物質(zhì)具有廣泛的生理活性,相關(guān)研究也顯示黃酮類物質(zhì)如葛根總黃酮、荷葉總黃酮等具有良好的解酒護肝功效[13-14]?？嗍w黃酮是苦蕎中主要的功能活性物質(zhì),具有降低血糖、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性,也具有抗動脈粥樣硬化、預防老年癡呆等疾病的作用[15]。然而,目前國內(nèi)外關(guān)于TFTB解酒護肝的研究報道內(nèi)容較少。

本文就TFTB的體外抗氧化活性、解酒功能及對醉酒小鼠肝損傷的保護作用開展研究,以期為TFTB作為解酒功能性食品及解酒藥物的開發(fā)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級KM小鼠 4～5周齡,體重18～22 g,雄性,由西南醫(yī)科大學實驗動物中心提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(川)2018-17,小鼠于實驗前7 d購進,并進行適應(yīng)性喂養(yǎng)。動物房內(nèi)光線充足,通風良好,室內(nèi)溫度(26±1) ℃,相對濕度為45%～50%,小鼠飼喂維持飼料,飲用一級動物飲水,在飼喂期間小鼠自由進食、飲水;苦蕎麩皮總黃酮(Total Flavonoids from Tartary Buckwheat Bran,TFTB) 總黃酮含量70.83%,實驗室自制;兒茶素、表兒茶素、牡荊素、蘆丁、楊梅素、山奈酚-3-O蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚標準品(純度均≥98%) 成都普思生物科技股份有限公司;甲醇、磷酸(色譜純) Knowles;凈品級ADS-7型大孔吸附樹脂 天津浩聚樹脂科技有限公司;磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、無水乙醇、冰乙酸、鹽酸、α-萘乙二胺鹽、羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose sodium,CMC-Na) 分析純,成都市科隆化學品有限公司;維生素C(L-ascorbic acid,VC)、對氨基苯磺酸 上海阿拉丁試劑公司;鄰苯三酚、亞硝酸鈉 分析純,國藥化學試劑公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,DPPH) Sigma公司;38%vol濃香型白酒 瀘州老窖股份有限公司;聯(lián)苯雙酯 北京協(xié)和制藥廠;谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)試劑盒、總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)試劑盒、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒、蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程有限公司。

ME20A型萬分之一天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;LC-16型高效液相色譜儀 日本島津公司;DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司;SP-756P型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;5804R型臺式高速離心機 艾本德中國有限公司;Flex Station 3型酶標儀 美谷分子儀器有限公司;DZKW-D-4恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;MT-30K型自動勻漿器 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;WH-861型渦旋混合器 太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 TFTB的制備方法 取苦蕎麩皮適量,加入10倍量的70%食品級乙醇在60 ℃下熱回流提取3次,每次3 h,合并3次提取液,減壓濃縮至干,得苦蕎麩皮黃酮粗品。以苦蕎麩皮黃酮粗品加適量水樣品作為上樣液,通過ADS-7型大孔吸附樹脂進行動態(tài)吸附,再用90%乙醇洗脫,收集洗脫液減壓濃縮至干,即得TFTB樣品。

1.2.2 TFTB黃酮組分及含量測定 參照高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)[16]測定,取TFTB樣品適量,甲醇充分溶解后,用0.22 μm微孔濾膜過濾,HPLC進行檢測,檢測條件為:色譜柱為Intersustain C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速1.0 mL/min,柱溫35 ℃,檢測波長280 nm;梯度洗脫的流動相A為0.2%磷酸溶液,流動相B為甲醇。洗脫程序:0～25 min,20%～35% B;25～40 min,35%～50% B;40～50 min,50%～90% B;50～60 min,90%～90% B。檢測完畢后與混合標準品進行對比。

1.2.3 體外抗氧化活性測定

其中:V1:未加清除劑時的反應(yīng)速率;V2:加入清除劑時的反應(yīng)速率。

1.2.3.2 DPPH·清除作用的測定 參照文獻[18-19]方法進行測定。分別配制質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的TFTB和蘆丁溶液及VC(0.01、0.02、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 mg/mL)溶液作為清除劑。分別吸取2 mL濃度為0.2 mg/mL的DPPH 50%乙醇溶液及不同濃度清除劑置于具塞試管中,搖勻,避光反應(yīng)30 min后,以無水乙醇作為參比于517 nm測定其吸光度Ai;方法同Ai操作,測定2 mL DPPH 50%乙醇溶液與無水乙醇混合反應(yīng)后吸光度Ac;方法同Ai操作,測定2 mL不同濃度清除劑及50%乙醇溶液混合后吸光度Aj。按照公式計算清除率。用清除率表示清除劑的清除能力,清除率越大表示TFTB的抗氧化性越強。按以下公式計算:

其中:Ai:加清除劑時DPPH·體系的吸光度;Aj:清除劑的吸光度值;Ac:未加清除劑時DPPH·體系吸光度值。

其中:Ac:未加清除劑時吸光度值;Ai:加入清除劑時吸光度值;Aj:未加NaNO2時吸光度值。

1.2.4 解酒護肝作用評價

1.2.4.1 小鼠醉酒模型的建立 通過參考文獻[21]制備小鼠醉酒模型,分別以0.15、0.20、0.23、0.25 mL/10 g劑量給各組小鼠一次性經(jīng)口灌胃38%vol濃香型白酒,每組10只,確定能使小鼠出現(xiàn)翻正反射消失數(shù)量最大而不出現(xiàn)死亡的劑量為最佳致醉劑量。實驗結(jié)果顯示,在能夠保證全部小鼠醒來的情況下,使小鼠醉酒只數(shù)達到最大的最佳致醉劑量為0.20 mL/10 g。

1.2.4.2 動物分組及給藥 取50只雄性KM小鼠,按體重隨機分為5組,每組10只。分別是醉酒模型組(0.5%的CMC-Na溶液)、陽性對照組(聯(lián)苯雙酯,150 mg/kg·bw)、TFTB低、中、高劑量組(100、200、300 mg/kg·bw)。在實驗前先對小鼠禁食不禁水12 h,使用0.5%的CMC-Na溶解陽性藥物及TFTB,各組小鼠以0.1 mL/10 g劑量分別灌胃對應(yīng)劑量的溶媒、陽性藥物及TFTB。各組小鼠在一次性灌胃溶媒或相應(yīng)藥物后30 min按照0.20 mL/10 g劑量一次性灌胃38%vol白酒。

1.2.4.3 小鼠醉酒情況觀察 參考文獻[22]中方法及標準對小鼠醉酒情況進行判定,實驗各組小鼠灌胃白酒后,觀察小鼠的醉酒現(xiàn)象。觀察并記錄小鼠醉酒耐受時間(從灌胃白酒后到醉酒的時間)、醉睡時間(翻正反射消失持續(xù)時間),并計算小鼠的醉酒率。以翻正反射消失作為判斷小鼠醉酒的標準,即當小鼠保持背向下的姿勢30 s以上時,則認為其翻正反射消失,判定為醉酒。

1.2.4.4 血清指標測定 實驗各組小鼠分別于灌胃白酒后5 h,用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(40 mg/kg)麻醉,摘眼球取血,置EP管中,在4 ℃靜置30 min后,3500 r/min離心10 min,取上層血清置另一EP管中,照谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)試劑盒說明書中方法測定小鼠血清中AST活性。

1.2.4.5 肝臟指標測定 各組實驗小鼠分別于灌胃白酒5 h后處死,取出肝臟,使用預冷的生理鹽水反復沖洗,用濾紙吸干水分后,使用天平稱重。稱重后的肝臟加入預冷的生理鹽水勻漿制備10%的肝組織勻漿液,組織勻漿液離心10 min(3000 r/min,4 ℃),取上清液分別按照相關(guān)試劑盒說明書操作,進行SOD、MDA和蛋白含量的測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)比較組間差異,以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的判斷標準。方差齊時,采用LSD法進行兩兩比較,若方差不齊,則采用Tamhane’s法進行兩兩比較。醉酒率比較使用卡方檢驗,以上數(shù)據(jù)由SPSS 19.0 for Windows 進行統(tǒng)計分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 TFTB樣品組分的初步分析

從圖1A可以看出,在此色譜條件下,8種黃酮類化合物的標準品得到較好分離,TFTB樣品溶液色譜圖中4個目標峰的保留時間分別與標準品溶液蘆丁、山奈酚-3-O蕓香糖苷、槲皮素、山奈酚的色譜峰保留時間一致,其中以蘆丁相對含量最高,可達總黃酮含量的87.8%(圖1B)。

圖1 黃酮標準品(A)與TFTB(B)HPLC圖

2.2 體外抗氧化活性

圖2 不同添加量不同清除劑對超氧陰離子自由基的清除作用

2.2.2 對DPPH·清除效果 由圖3可知,TFTB對DPPH·具有一定的清除能力,在試驗濃度范圍內(nèi),TFTB對DPPH·的清除能力隨著濃度的增大而增加,呈現(xiàn)出量效關(guān)系。TFTB對DPPH·清除的IC50為0.02 mg/mL,即質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時,體系中50%的DPPH·可被清除,但TFTB清除能力弱于同質(zhì)量濃度的蘆丁。在質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時,TFTB對DPPH·的清除率能夠達到90%,與蘆丁的清除作用相當,但清除能力低于VC。郭剛軍等[23]研究表明,苦蕎黃酮對DPPH·具有較好的清除能力,清除DPPH·能力隨著苦蕎黃酮質(zhì)量濃度的增大而升高,與本研究結(jié)果一致。

圖3 不同添加量不同清除劑對DPPH·的清除作用

圖4 不同添加量不同清除劑對的清除作用

注:與醉酒模型組相比,*表示具有顯著差異,P<0.05;**表示具有極顯著差異性,P<0.01。表2、表3同。

2.3 解酒護肝作用

2.3.1 防醉解酒作用 當按照實驗確定劑量灌胃白酒后,各組小鼠均表現(xiàn)出不同程度的醉酒現(xiàn)象。具體表現(xiàn)為出現(xiàn)醉酒后的興奮狀態(tài),爬行不穩(wěn),頻繁用前肢搔頭、閉眼不動等行為。由表1可知,在醉酒率方面,醉酒模型組有9只小鼠醉酒,醉酒率為90%,結(jié)合醉酒模型建立實驗結(jié)果及文獻報道,表明醉酒模型造模成功[22];TFTB各組醉酒率較之醉酒模型組略有降低但無顯著性差異(P>0.05)。在耐受時間方面,與醉酒模型組相比,除TFTB高劑量組外,其他組耐受時間均有不同程度的縮短,一方面可能是酒精的攝入抑制了TFTB在體內(nèi)的進一步吸收和利用,另一方面可能是TFTB對耐受時間的延長作用存在劑量依賴性。在醉睡時間方面,與醉酒模型組對比,TFTB組及聯(lián)苯雙酯組的醉睡時間均極顯著縮短(P<0.01)。

表1 TFTB對小鼠耐受時間及醉酒時間的影響

2.3.2 TFTB對血清指標的影響 由表2可知,與醉酒模型組對比,TFTB組與聯(lián)苯雙酯組的AST水平均顯著降低(P<0.05)。其中TFTB低劑量組降低轉(zhuǎn)氨酶的效果與目前公認的降酶保肝藥物聯(lián)苯雙酯的作用相當,與醉酒模型組對比具有極顯著性差異(P<0.01)。

表2 TFTB對小鼠AST的影響

2.3.3 TFTB對肝臟指標的影響 由表3知,與醉酒模型組相比,TFTB組和聯(lián)苯雙酯組肝臟中SOD活性均極顯著提升(P<0.01),但不同劑量組TFTB間無顯著的量效關(guān)系。在肝組織MDA指標方面,與醉酒模型組對比,TFTB各組肝臟中MDA的含量均顯著降低(P<0.05)。

表 3 TFTB對小鼠SOD、MDA的影響

3 討論與結(jié)論

醉酒主要是指因大量飲酒而造成急性酒精中毒,使得機體中樞神經(jīng)呈現(xiàn)出一種興奮或抑制狀態(tài)[28]。目前開發(fā)出的解酒產(chǎn)品主要是通過抑制胃腸等消化系統(tǒng)對酒精的吸收或直接作用于肝代謝酶系而加速酒精在體內(nèi)的代謝而起到解酒效果[29]。朱振元等[30]研究葛根素的防醉解酒效果,結(jié)果顯示,葛根素能夠降低小鼠血清中的酒精濃度從而延長小鼠的醉酒耐受時間,縮短醉睡時間,具有良好的防醉解酒藥效。本實驗的研究結(jié)果表明,同醉酒模型組對比,給藥300 mg/kg·bw TFTB能夠延長醉酒耐受時間(P<0.05),同時TFTB各組小鼠醉睡時間均顯著縮短(P<0.01)。結(jié)果表明,TFTB具有較好的防醉解酒作用。

AST主要存在于肝臟細胞的線粒體中,而酒精在肝臟代謝時產(chǎn)生的大量ROS將會損傷肝細胞線粒體膜及細胞膜,使得肝臟細胞中的AST大量釋放至血液中引起指標的升高,因此血清中AST指標的含量是判斷肝損傷的重要指標[31]。與醉酒模型組相比,TFTB各組及聯(lián)苯雙酯組血清中AST含量均顯著降低(P<0.05),表明TFTB對小鼠酒精所致肝臟損傷具有一定的保護作用。Sun等[32]通過研究表明一種膳食類黃酮醇非瑟酮可以抑制酒精造成的氧化應(yīng)激、肝細胞凋亡,脂質(zhì)蓄積進而實現(xiàn)對肝臟的保護作用,因此TFTB對肝臟的保護作用可能與其體內(nèi)抗氧化活性有關(guān)。

SOD在機體中的主要功能是清除體內(nèi)的自由基,其在一定程度上反映了氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度。酒精的刺激會造成肝臟中的SOD活性水平下降,導致機體內(nèi)的氧化還原平衡的破壞[33]。MDA作為脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物,可使核酸、蛋白質(zhì)等大分子出現(xiàn)交聯(lián)或斷裂而影響細胞的正常生理活性,因此,MDA水平是脂質(zhì)過氧化損傷的標志性產(chǎn)物,反映了活性氧對肝臟的損傷程度;酒精的攝入導致機體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加,從而會引起肝臟中MDA含量的升高[33-34]。肝組織指標測定結(jié)果顯示,與醉酒模型組對比,TFTB各組小鼠肝臟中SOD活力均極顯著提升(P<0.01),且肝臟中MDA的含量均顯著降低(P<0.05)。相關(guān)研究結(jié)果顯示,黃酮類化合物可通過抑制氧化應(yīng)激,改善脂質(zhì)代謝,減輕線粒體損傷,誘導細胞凋亡等方式改善肝臟損傷[35]。也有研究表明蘆丁可以減輕t-BHP誘導的小鼠肝臟的氧化應(yīng)激損傷,有助于由氧化應(yīng)激引起的相關(guān)疾病的預防和治療[36]。而蘆丁作為TFTB中主要的黃酮化合物,其作為一種膳食因子可能有助于改善機體細胞內(nèi)氧化還原平衡。這提示TFTB對酒精造成肝損傷的保護作用可能是通過提高小鼠體內(nèi)SOD酶活力加速細胞對自由基的清除并抑制細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)進而改善了氧化應(yīng)激反應(yīng)實現(xiàn)。