基于適配體拉曼光譜技術(shù)快速檢測腸炎沙門氏菌方法

邵 琳,王 玥,曲 晗,郝良玉,王洪利,田栢會,李志萍,李乾學(xué),沈明浩,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué),吉林長春 130000;2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長春 130122;3.長春理工大學(xué),吉林長春 130022)

沙門氏菌是引起食物中毒極為重要的食源性致病菌[1]。近些年,世界范圍內(nèi)的食品安全惡性事件頻繁發(fā)生,防不勝防[2-3]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報道,全球每年感染沙門氏菌的人數(shù)過萬[4]。據(jù)資料統(tǒng)計,每年由沙門氏菌造成的食物中毒事件占食物中毒事件總數(shù)的40%～60%[5],在我國,由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位[6]。沙門氏菌(Salmonella)隸屬于腸桿菌科[7],它是寄生于生物腸道內(nèi),生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭氏陰性桿菌的統(tǒng)稱[8]。尤其以腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)為代表的病原菌在食品衛(wèi)生安全、疾病預(yù)防和環(huán)境監(jiān)測[9-11]等方面形成了巨大的威脅,對人體的健康也造成了很大危害。目前應(yīng)用于沙門氏菌的檢測方法包括熒光PCR檢測[12]、生物傳感器檢測[13]、ELISA檢測[14]等,這些檢測方法存在靈敏度低、耗時長,不適用于現(xiàn)場的快速檢測等缺點,無法滿足實際應(yīng)用需求。近年來,適配體技術(shù)已經(jīng)逐漸應(yīng)用于食源性致病菌的檢測領(lǐng)域。

適配體(Aptamer)是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)篩選得到的一段短的單鏈DNA或RNA[15]。近年來,適配體檢測技術(shù)在生化分析和食品安全等方面的應(yīng)用得到了全面的發(fā)展。適配體幾乎可與每一個目標(biāo)分子進行化學(xué)修飾,并且它能夠與相應(yīng)的靶標(biāo)分子例如金屬離子、有機小分子藥物、蛋白質(zhì)乃至整個細胞進行高親和力和強特異性的結(jié)合[16]。目前國內(nèi)外已成功篩選出了與食源性致病菌特異性結(jié)合的適配體,此項研究具有發(fā)展成快速檢測技術(shù)的潛力[17]。但所篩選出的適配體其特異性和親和力不好,并且與其配套的檢測設(shè)備檢測信號不夠靈敏,這對于實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測形成了一定的困難。對于沙門氏菌這種高威脅性的病原菌[18],迫切需要開發(fā)出一種簡易、快速、靈敏度高、低使用成本的檢測技術(shù)。

近些年,拉曼光譜技術(shù)迅猛發(fā)展,應(yīng)用領(lǐng)域也越來越多[19]。拉曼光譜可以通過透明材質(zhì)容器對被檢測樣品進行定性分析[20];并且其譜峰與被檢測樣品濃度呈正比關(guān)系,因此拉曼光譜還可對被檢測樣品進行定量分析[21-22]。目前拉曼光譜應(yīng)用于食品檢測方面的相關(guān)研究還相對較少。本研究將適配體篩選技術(shù)及表面增強拉曼光譜技術(shù)結(jié)合,可實現(xiàn)對腸炎沙門氏菌的快速、高效檢測,以期該方法在食品檢測領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis,CICC:21482)、阪崎克羅諾桿菌(Enterobactersakazakii,CICC:21560)、福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri,CICC:21534)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae,CICC:10870)、大腸埃希菌O157∶H7(EscherichiacoliEHEC O157∶H7,CICC:21530) 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC);PBS(Phosphate Buffered Solution) 美國HYclone公司；99.9999%硝酸銀(AgNO3) 德國Sigma-Aldrich(Taufkirchen)公司;LB液體培養(yǎng)基(LB Broth) 上海生工生物工程股份有限公司;PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 日本TAKARA公司;Lambde核酸外切酶 美國New England Biolabs公司;去離子水(DNaseRNase-Free Deionized Water) 北京天根生化科技有限公司;豬肉肉糜(Pork minced Pork) 購買于當(dāng)?shù)爻小?/p>

LabRAM HR Evolution拉曼光譜儀 HORIBA Xcientific;上海智城分析儀器制造有限公司；BSC-1300ⅡA2生物安全柜 蘇州凈化公司；ZXDP-A2080十段編程電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；GXSI PCR儀 德國艾本德公司。

1.2 腸炎沙門氏菌特異性適配體whole-bacteria-SELEX篩選

1.2.1 構(gòu)建隨機文庫 構(gòu)建腸炎沙門氏菌隨機單鏈DNA文庫:

5′-GCGATCCAAGCTTCTTCAATT-N50-GATACT AGACTGCACATCT-3′;

上游引物:5′-GCGATCCAAGCTTCTTCA-3′;

下游引物:5′-AGATGTGCAGTCTAGTAT-3′。

(以上均由上海生工生物工程有限公司合成,下游引物5′端磷酸化)。

1.2.2 細菌培養(yǎng) 將本實驗室保存的腸炎沙門氏菌20 μL加入5 mL LB液體培養(yǎng)基中,放入搖床200 r/min,37 ℃培養(yǎng)12 h。將菌液用PBS洗3次,每次3500 r/min離心5 min,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SELEX篩選腸炎沙門氏菌適配體

1.2.3.1 腸炎沙門氏菌與ssDNA隨機文庫的結(jié)合與分離 將合成的ssDNA隨機文庫120 μL金屬浴95 ℃ 15 min,立刻置于冰上15 min備用。將折疊后的ssDNA隨機文庫240 μL與1 mL腸炎沙門氏菌混合,室溫孵育2 h。將混合物3500 r/min洗滌5 min棄上清,用結(jié)合緩沖液洗3次,3500 r/min洗滌5 min。最后用200 μL去離子水溶解。將結(jié)合樣品金屬浴95 ℃ 15 min,立刻置于冰上15 min,12000 r/min離心5 min后收集上清,PCR擴增。剩余樣品-20 ℃保存[23]。

1.2.3.2 篩選后的ssDNA產(chǎn)物PCR擴增 以上一輪篩選所得的ssDNA產(chǎn)物為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系為:篩選后的適配體模板3 μL、2×Taq PCR Master Mix酶25 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、去離子水21 μL,總體積為50 μL。PCR擴增條件為a.95 ℃ 5 min,b.95 ℃ 45 s,c.69 ℃ 45 s,d.72 ℃ 45 s,e.72 ℃ 5 min,f.4 ℃保存。擴增時,步驟b～d擴增25個循環(huán)。

1.2.3.3 各輪PCR擴增結(jié)果瓊脂糖凝膠電泳鑒定 本實驗采用2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。將PCR產(chǎn)物中加入45 μL 3 mol/L乙酸鈉、5 μL Dr.GenTLE Precipitation Carrier和1 mL的無水乙醇,放入-20 ℃冰箱中沉淀過夜。4 ℃,12000 r/min離心30 min,棄上清,用1 mL 70%乙醇重懸,12000 r/min離心15 min,棄上清,洗滌2次,晾干備用。取100 μL去離子水將核酸溶解,加入12 μL 10×λ酶切反應(yīng)Buffer與8 μL λ外切酶,37 ℃ 40 min,75 ℃ 10 min。重復(fù)以上篩選至第九輪,從第十輪開始采用阪崎克羅諾桿菌、福氏志賀氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希菌O157∶H7進行扣除篩選至第十五輪。將PCR擴增第十五輪適配體篩選結(jié)果進行挑取單克隆測序。

1.3 ELISA評價適配體親和力

將腸炎沙門氏菌用PBS洗滌3次,每次3500 r/min,離心5 min棄上清,用15 mL ELSA包被緩沖液溶解稀釋細菌,每孔加入100 μL菌液,H行空白對照,4 ℃過夜。每孔用200 μL PBS洗滌3次。每個孔加5%胎牛血清200 μL,4 ℃封閉3 h,用0.5% PBST洗滌3次。將14條候選適配體分別稀釋為500 nmol/L,95 ℃ 15 min、迅速冰上15 min、室溫15 min折疊。每孔加入100 μL,37 ℃孵育2 h。再用200 μL 1×Binding Buffer洗滌3次,在每個孔里加100 μL鏈霉親和素標(biāo)記辣根過氧化物酶37 ℃ 45 min,200 μL Binding Buffer洗3次,TMB顯色液每個孔加入100 μL,37 ℃箱孵育20 min,50 μL硫酸終止反應(yīng),使用酶標(biāo)儀檢測A450處OD值,以A450處OD值表示適配體親和力的大小。

1.4 TEM樣品制備

腸炎沙門氏菌-Aptamer-AgNPs TEM樣品制備:分別將濃度為200、300、400、500 nmol/L的適配體與洗滌好的腸炎沙門氏菌均勻混合,室溫孵育1.5 h,3500 r/min離心5 min,棄上清,加入1 mL Binding Buffer緩沖液重懸,3500 r/min離心5 min,棄上清,重復(fù)此操作洗滌3次,加入新鮮配制的AgNO3溶液100 μL,充分混合均勻,避光孵育5 min,再勻速加入新鮮配制的NaBH4溶液100 μL,混合均勻,2000 r/min離心20 s,棄上清,用100 μL去離子水重懸,4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。漩渦振蕩將樣品混勻,將碳支持膜浸入樣品中,5 s后取出,用濾紙去除多余液體,加熱干燥5 s,固定,放置于透射電子顯微鏡中,觀測并拍照。

納米銀(AgNPs)TEM樣品制備:取0.017 g AgNO3溶解于10 mL去離子水中,AgNO3溶液濃度為0.1 mmol/L;將0.019 g NaBH4溶解于50 mL去離子水中,NaBH4溶液濃度為0.1 mmol/L。取100 μL AgNO3放入1.5 mL離心管中,勻速加入100 μL NaBH4,混勻。合成納米銀粒子為黃綠色膠體溶液,4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 表面增強拉曼技術(shù)快速檢測腸炎沙門氏菌方法的建立

1.5.1 腸炎沙門氏菌-AgNPs樣品制備 取1 mL腸炎沙門氏菌3500 r/min離心2 min,棄上清,用Binding Buffer,3500 r/min離心2 min,洗滌3次,棄上清;100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的AgNO3溶液重懸,避光孵育5 min,緩慢勻速加入100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的NaBH4溶液,混勻后順離20 s,棄上清,用100 μL去離子水重懸,取10 μL滴到載玻片上,涂勻晾干備用。

1.5.2 腸炎沙門氏菌-Aptamer-AgNPs樣品制備 取1.3中親和力較高的適配體折疊后與腸炎沙門氏菌室溫條件下結(jié)合孵育20 min,3500 r/min離心5 min,棄上清,用1 mL Binding Buffer洗滌3次,每次3500 r/min離心5 min,棄上清;沉淀用100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的AgNO3溶液重懸,避光孵育5 min,緩慢勻速加入100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的NaBH4溶液,混勻后2000 r/min離心20 s,棄上清,用100 μL去離子水重懸,取10 μL滴到載玻片上,涂勻晾干備用。此樣品用于腸炎沙門氏菌特異性適配體SERS檢測與腸炎沙門氏菌基于SERS技術(shù)重復(fù)性檢測。

1.5.3 混合細菌樣品制備 將腸炎沙門氏菌、阪崎克羅諾桿菌、福氏志賀氏菌、大腸埃希菌O157∶H7、肺炎克雷伯氏菌3500 r/min離心2 min,棄上清,1 mL Binding Buffeer洗滌2次,棄上清,用80 μL Binding Buffer重懸混合細菌,加入折疊好的適配體120 μL室溫條件下孵育1.5 h,3500 r/min離心5 min,棄上清,用1 mL Binding Buffer洗滌2次,每次3500 r/min離心5 min,棄上清;沉淀用100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的AgNO3溶液重懸,避光孵育5 min,緩慢勻速加入100 μL濃度為0.1 mmol/L的新鮮配制的NaBH4溶液,混勻后2000 r/min離心20 s,棄上清,用100 μL去離子水重懸,取10 μL滴到載玻片上,涂勻晾干備用[24]。

1.5.4 拉曼檢測 分別使用107、106、105、104、103、102和101CFU/mL 7個濃度洗滌好的腸炎沙門氏菌與300 nmol/L折疊后的腸炎沙門氏菌特異性適配體結(jié)合,在復(fù)合物表面原位還原納米銀殼,進行拉曼信號采集。

分別將等量的腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希菌O157∶H7、福氏志賀氏菌、阪崎克羅諾桿菌與折疊后的腸炎沙門氏菌特異性適配體結(jié)合,在復(fù)合物表面原位還原納米銀。將等量混合五種細菌與腸炎沙門氏菌特異性適配體結(jié)合,在復(fù)合物表面原位還原納米銀,分別采集拉曼信號。

參數(shù)設(shè)置為:激發(fā)光源532 nm,強度14 mW,物鏡50倍,積分時間5 s,積分次數(shù)2次,狹縫寬度100 μm,拉曼掃描范圍500～2000 cm-1。

1.6 豬肉樣品加標(biāo)實驗

取新鮮LB液體培養(yǎng)加入瓊脂粉15 g,加入1 L去離子水同時攪拌混勻,調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,高壓滅菌,倒入平板培養(yǎng)皿內(nèi)冷卻,4 ℃保存?zhèn)溆?。? g肉糜樣品浸泡在一定量的10 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液中,在滅菌鍋中進行滅菌處理。滅菌后的樣品在10000 r/min條件下離心15 min,去除掉樣品中的固形物雜質(zhì)。上層清液分裝在離心管內(nèi),利用本實驗建立的檢測方法進行檢測,得到結(jié)果與傳統(tǒng)平板計數(shù)法相比較,并計算其回收率[25]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理使用Origin software 8.5和GraphPad Prism 7軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸炎沙門氏菌特異性適配體whole-bacteria-SELEX篩選結(jié)果

共進行十五輪篩選,第一輪～第九輪為正向篩選,第十輪～第十五輪為扣除篩選,各輪篩選均有有效結(jié)果,其中第一輪、第八輪、第十五輪篩選電泳結(jié)果如圖1所示,第一輪～第十五輪結(jié)合力逐漸增強,條帶越來越清晰明亮,符合預(yù)期結(jié)果。

圖1 腸炎沙門氏菌適配體篩選結(jié)果電泳圖

2.2 腸炎沙門氏菌候選適配體ELISA親和力評價

將篩選后的第十五輪核酸適配體文庫進行PCR擴增、單克隆測序,將測序結(jié)果進行序列分析,繪制進化樹。從中選取拷貝數(shù)較高的14條候選核酸適配體進行后續(xù)評價。

對14條適配體進行親和力評價,結(jié)果如圖2所示。可以明顯看出4、10、12號候選核酸適配體OD值較高,因此,選擇4、10、12號候選核酸適配體進行后續(xù)SERS評價。

圖2 十四條候選適配體親和力評價

通過DNAMAN軟件對所選擇出的4、10、12號候選核酸適配體進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,所得結(jié)果如圖3所示,由預(yù)測圖可以看出含有凸環(huán)與莖環(huán)結(jié)構(gòu),在莖環(huán)的鏈接處分析可能是目標(biāo)腸炎沙門氏菌的結(jié)合位點,通過堿基堆積、帶電基團的靜電作用、芳香化合物堆積與氫鍵相作用形成腸炎沙門氏菌穩(wěn)定的結(jié)合位點。

圖3 候選適配體二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖

2.3 表面增強拉曼光譜對腸炎沙門氏菌候選適配體親和力評價

從圖4可以看出,該光譜735 cm-1處有明顯特征譜峰,并且735 cm-1處峰形尖銳,對拉曼增強掃描信號結(jié)果峰圖進行歸屬峰分析表明,735 cm-1來自胞嘧啶與尿嘧啶的代謝產(chǎn)物。且腸炎沙門氏菌-Aptamer4-AgNPs的圖譜明顯高于腸炎沙門氏菌-Aptamer10-AgNPs與腸炎沙門氏菌-Aptamer12-AgNPs的圖譜,由ELISA與SERS實驗結(jié)果均表明4號適配體親和力最高,特異性最好。腸炎沙門氏菌特異性核酸適配體序列Aptamer4為:TTTTTGCGATCCAAGCTTCTTCAAT TGGAGTGCTACCGAGATACATGGGTGGGCTCAAACAA TCGTGGGCTCGCTTGATACTAGACTGCACATCT。結(jié)果表明本研究方法能特異性增強腸炎沙門氏菌檢測的信號,峰強高,峰形明顯,直觀可見。

圖4 腸炎沙門氏菌SERS檢測結(jié)果圖

2.4 腸炎沙門氏菌電子顯微鏡表征

結(jié)果如圖5所示,在一定的濃度范圍內(nèi),適配體濃度增加,納米銀的吸附量也隨之增加,因此SERS檢測信號也得到了增強。

圖5 腸炎沙門氏菌及腸炎沙門氏菌與不同濃度適配體結(jié)合后原位還原樣品的TEM表征

將單獨制作的納米銀粒子(AgNPs)樣品取出,對其均一度進行透射電子顯微鏡表征,掃描結(jié)果如圖6所示,納米銀粒子的均一度良好,粒子的直徑在4～5 nm左右。

圖6 AgNPs TEM表征

2.5 基于SERS適配體技術(shù)檢測腸炎沙門氏菌

2.5.1 腸炎沙門氏菌基于SERS技術(shù)重復(fù)性檢測 對腸炎沙門氏菌-Aptamer4-AgNPs樣品進行5次隨機拉曼光譜掃描,掃描結(jié)果如圖7所示,拉曼掃描結(jié)果顯示5次峰圖重復(fù)性良好,峰強與峰形幾乎沒有偏差,吻合度高。

圖7 腸炎沙門氏菌SERS重復(fù)性檢測

2.5.2 不同濃度腸炎沙門氏菌SERS檢測 如圖8所示,隨著細菌濃度升高,拉曼增強掃描光譜信號強度隨之升高,當(dāng)細菌濃度低至102CFU/mL時,仍能獲得拉曼響應(yīng)信號。這說明該方法檢測限能夠達到102CFU/mL細菌濃度。細菌濃度與拉曼信號強度成線性相關(guān),線性方程為Y=0.05X-0.85,R2=0.95。

圖8 腸炎沙門氏菌SERS檢測靈敏度評價

2.5.3 腸炎沙門氏菌與其他菌混合樣品SERS檢測 如圖9所示,五種混合細菌-Aptamer4-AgNPs與腸炎沙門氏菌-Aptamer4-AgNPs能檢測出明顯的峰。從這組數(shù)據(jù)看出此研究方法能夠在混合細菌樣品中準確地檢測出目標(biāo)細菌腸炎沙門氏菌。

圖9 混合細菌樣品中腸炎沙門氏菌檢測結(jié)果

2.6 豬肉樣品加標(biāo)回收率測定

本研究的新檢測方法與傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法所測得的結(jié)果相對照,結(jié)果如表1所示,腸炎沙門氏菌的檢測回收率在93.37%～100.18%之間,所得回收率高。與傳統(tǒng)平板計數(shù)法相比,本實驗所建立的檢測方法的一致性良好,可以應(yīng)用于豬肉實際樣品中腸炎沙門氏菌的檢測。

表1 豬肉樣品中腸炎沙門氏菌的檢測回收率

3 討論與結(jié)論

本文以腸炎沙門氏菌為研究目標(biāo),采用whole-bacteria-SELEX篩選技術(shù)進行篩選核酸適配體,與其他SELEX篩選方法相比,本實驗僅需十五輪就篩選出親和力高、特異性強的核酸適配體。與傳統(tǒng)ELISA檢測相比,本實驗采用ELISA與表面增強拉曼光譜技術(shù)相結(jié)合的檢測方法,該方法不僅延用了ELISA檢測的優(yōu)點,例如成本低、操作簡單等,還結(jié)合表面增強拉曼光譜技術(shù),使檢測方便快捷,且具有高靈敏度、高選擇性,能快速準確識別被測樣品。本研究通過SERS技術(shù)快速檢測腸炎沙門氏菌和篩選特異性適配體重復(fù)性良好,在五次隨機檢測中得到基本吻合的峰,與其他類似拉曼檢測實驗相比,本實驗的重復(fù)性吻合度更好,峰強更高。

本實驗通過SERS技術(shù)對篩選出的適配體進行特異性檢測,采用類似文獻中的實驗方法,本實驗也可從五種混合細菌中特異性檢測出腸炎沙門氏菌,峰形明顯,說明本實驗篩選出的適配體具有高特異性。本實驗還對SERS檢測腸炎沙門氏菌的細菌濃度進行探究,發(fā)現(xiàn)細菌濃度在102～107CFU/mL與拉曼信號強度呈線性關(guān)系,且R2=0.95,與相類似實驗的結(jié)果相近,最低檢測限為102CFU/mL,也符合實驗要求,本實驗SERS檢測全過程僅需45 min左右,比其他檢測方法節(jié)省了許多時間,且根據(jù)拉曼光譜的特性,SERS檢測的靈敏度高,準確性好。同時將此研究方法應(yīng)用于市售豬肉樣品中腸炎沙門氏菌的實際檢測發(fā)現(xiàn),所建立方法準確度好、靈敏度高,可適用于豬肉實際樣品的在線監(jiān)測[26]和快速預(yù)警[27],可有效避免由腸炎沙門氏菌感染等引發(fā)的食品安全問題[28],并有效提高食品安全水平。