基于COSMORS方法篩選低共熔溶劑及銀杏葉類黃酮提取工藝優(yōu)化

姚金昊,劉芝涵,李春露,吳倩文,翟子琦,李 翔,崔志芳

(山東科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院,山東青島 266590)

黃酮類化合物是銀杏葉中主要成分之一(含量可達6%～8%),生理活性和藥理活性十分廣泛[1]。該類化合物通過抗氧化和去除氧自由基而具有抗衰老的功效[2-3],還可增強機體免疫力,具有抗炎、抗病毒等功能[4]。

銀杏葉中類黃酮常采用一定體積分數(shù)的乙醇等極性有機溶劑加以提取[5]。近年來有學(xué)者采用超聲或微波來加速黃酮類成分溶出,進而縮短提取時間[6-7],但提取時仍然多采用易燃易爆、易揮發(fā)的有機溶劑。采用超臨界流體CO2從銀杏葉中提取得到類黃酮[8],但需要高額的設(shè)備投資以及維護費用,成為制約該技術(shù)得到實際應(yīng)用的一大瓶頸。所以,尋找易于制備、經(jīng)濟且更為綠色的新型提取溶劑,并對提取工藝進行優(yōu)化,對于該資源的有效開發(fā)利用具有十分重要的意義。

天然低共熔溶劑(Natural Deep Eutectic Solvents,NADESs)是由氫鍵受體(Hydrogen Bond Acceptor,HBA,常見的有季銨鹽)與氫鍵供體(Hydrogen Bond Donor,HBD)按照一定摩爾配比所組成的一類新型溶劑,其凝固點顯著低于各個純組分的熔點[9]。HBA與HBD均為天然衍生物,具有無蒸汽壓、無毒可降解、易于制備成本低等優(yōu)點,在萃取分離、有機合成等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景[10-12]。無論是小分子的肉桂酸、紫杉醇,亦或是大分子木質(zhì)素等,都能在合適的NADESs體系中有很好的溶解度[13-14]。Wei等[15]采用NADESs氯化膽堿/乙二醇萃取木豆葉中的酚類物質(zhì),Dai等[16]使用不同的NADESs對長春花中的花青素進行提取,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其得率大大高于傳統(tǒng)溶劑,說明NADESs在天然產(chǎn)物萃取分離方面具有較大開發(fā)潛力。

因不同NADESs對類黃酮的溶解能力差別很大,如通過實驗逐一篩選,所需實驗工作量很大[17],若能利用相關(guān)軟件對不同NADESs溶解類黃酮能力進行模擬計算篩選,再對較優(yōu)的NADESs進行實驗驗證,則可極大節(jié)省實驗過程中人力及時間、資金投入。真實溶劑類導(dǎo)體屏蔽模型(Conductor-like Screening Model for Real Solvents,COSMO-RS)基于單分子量子力學(xué)計算與統(tǒng)計熱力學(xué)方法相結(jié)合[18],用體系中分子結(jié)構(gòu)等作為輸入數(shù)據(jù),來預(yù)測特定分子的熱力學(xué)性質(zhì),計算出無限稀釋活度系數(shù)γ,初步篩選哪些溶劑能對特定物質(zhì)的溶解效果較好[19],該模型已幫助不同研究方向的團隊找到適合不同產(chǎn)物提取的最佳溶劑[20-21]。

本研究采用模擬計算與實驗相結(jié)合的方法,通過COSMO-RS計算,以γ為指標,從多組NADESs組合中篩選出提取類黃酮較優(yōu)的NADESs。利用響應(yīng)面法試驗設(shè)計,對影響類黃酮提取的工藝條件如固液比、溫度、提取時間等因素進行優(yōu)化,得到最優(yōu)的NADESs提取類黃酮工藝,并為天然產(chǎn)物的NADESs提取相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏葉 2018年秋季收集于山東科技大學(xué)校園(青島),用流動自來水洗滌后自然晾干,粉碎機粉碎,過100目篩,105 ℃烘箱烘干后放于氣密容器中備用;蘆丁對照品 純度91.7%,購于中國藥品生物制品檢定所;氯化膽堿 分析純,上海麥克林生化科技有限公司;實驗所用其它試劑 均為國產(chǎn)分析純,購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

WFJ 7200型可見分光光度計 優(yōu)尼柯(上海)儀器有限公司;TGL-16M臺式高速冷卻離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 杭州市明遠儀器有限公司;FA2004N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;計算模擬所用軟件為Materials Studio7.0 美國Accelrys。

1.2 實驗方法

1.2.1 COSMO-RS軟件模擬計算篩選NADESs 計算所用NADESs:基于成本低廉、生物相容性好等方面考慮,選取氯化膽堿為HBA,尿素、甘油、乳酸、檸檬酸、丙二酸、草酸作為HBD,組成6類NADESs體系[7],每類溶劑體系下分別討論3種HBA與HBD摩爾配比:2∶1、1∶1和1∶2(共18組NADESs)。

基于COSMO-RS模型的相關(guān)計算部分主要流程如圖1所示。以蘆丁作為模型溶質(zhì)分子,并將每組NADESs作為提取所用溶劑,對蘆丁這一溶質(zhì)分子的γ值進行計算,γ值較低則意味著該溶劑體系對于蘆丁的溶解能力較強[19]。選取γ值較低的NADESs進行后續(xù)類黃酮提取實驗。

圖1 基于COSMO-RS計算模擬篩選類黃酮提取所用NADESs流程圖

1.2.2 NADESs的配制 將氯化膽堿為HBA,尿素、甘油、乳酸、檸檬酸、丙二酸、草酸為HBD所組成的6類NADESs,在保證HBA和HBD總質(zhì)量為100 g的基礎(chǔ)上,以HBA和HBD摩爾比例為2∶1、1∶1和1∶2分別稱取相應(yīng)量的HBA和HBD,置于500 mL的圓底燒瓶中,用橡膠塞密封后,置于70 ℃磁力攪拌水浴鍋中攪拌,直至瓶內(nèi)液體均相、無色透明液體時停止加熱,取出圓底燒瓶逐漸冷卻至室溫,即得NADESs,將其作為提取溶劑提取銀杏葉中的類黃酮。

1.2.3 NADESs提取類黃酮工藝流程 稱取0.2 g(計為W g)銀杏葉粉末,取一定體積NADESs(按料液比)加入20 mL鉗口瓶中,將銀杏葉粉末加入,放入磁力攪拌子后壓蓋密封,置于一定溫度磁力攪拌水浴鍋中攪拌提取一定時間。將其轉(zhuǎn)移到離心管中,8000 r/min下離心25 min,上清液即為粗提液,記錄粗提液體積V mL。

1.2.4 單因素實驗 在模擬篩選的基礎(chǔ)上對所得較優(yōu)的NADESs——氯化膽堿/甘油(摩爾比1∶2)進行銀杏葉類黃酮提取單因素實驗,對影響類黃酮得率的主要因素如提取時間、提取溫度、固液比進行單因素實驗。采用80 ℃,固液比1∶30 (g/mL)的初始條件,本研究先考察時間(0.5、1、2、3、4、5、6、7 h)對類黃酮提取的影響,再在較優(yōu)提取時間及固液比1∶30 (g/mL)的條件下研究提取溫度(40、50、60、70、80、90 ℃)的影響,最后在較優(yōu)提取時間、溫度下研究固液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g/mL)對類黃酮提取的影響。

1.2.5 響應(yīng)面試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken試驗設(shè)計原理,進行響應(yīng)面試驗設(shè)計[22],以類黃酮得率為主要考察指標,對于固液比、提取時間、提取溫度三個因素進行優(yōu)化。響應(yīng)面試驗的因素與水平如下表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗的因素與水平表

1.2.6 指標計算

1.2.6.1 蘆丁標準曲線測定 黃酮類化合物均以2-苯基色原酮為母核結(jié)構(gòu),具有相同的吸光特性,常用蘆丁作為類黃酮標準品。具體測定方法在前人報道的基礎(chǔ)上略作改進[23]:用NADESs配制0.25 mg/mL蘆丁標準溶液。吸取一定量蘆丁標準溶液,用NADESs補足到3.2 mL。依次加入顯色劑5% NaNO2、10% Al(NO)3各1.4 mL,搖勻、靜置,再加入4.0 mL 4% NaOH,搖勻放置15 min。3800 r/min離心10 min,空白試劑為3.2 mL NADESs,其余成分同測定管,用分光光度計在510 nm處測定各組吸光值并繪制標準曲線。所得標準曲線線性回歸方程為y=9.5788x+0.0033,R2為0.9993。式中y為蘆丁濃度(mg/mL),x為溶液的吸光度。

1.2.6.2 提取液中類黃酮含量測定及得率計算 吸取適量稀釋后銀杏葉類黃酮提取液,用NADESs補足至3.2 mL,其余操作與標準曲線測定步驟一樣,采用下式計算類黃酮得率:

式(1)

式中:c -稀釋后提取液中類黃酮濃度,mg/mL;n-稀釋倍數(shù);V - 所得提取液總體積,mL;W - 銀杏葉質(zhì)量,g。類黃酮含量測定每個樣品測定三次,取平均值進行計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有的提取實驗均平行重復(fù)3 次,每個提取液濃度測定時重復(fù)3次,單因素實驗結(jié)果繪制采用Excel 2013,實驗設(shè)計以及相關(guān)實驗數(shù)據(jù)的回歸分析、等高圖以及三維圖繪制均采用Design Expert9.0(StatEase Inc.,美國)?；貧w方程采用方差分析進行多重比較,擬合模型的判斷通過方差分析中的F值檢驗,P<0.05 被認為有統(tǒng)計學(xué)意義,并結(jié)合失擬項確定。模型的擬合度和合理性則可通過回歸系數(shù)R2以及校正決定系數(shù)等進行評判。

2 結(jié)果與分析

2.1 計算機模擬篩選NADESs

采用圖1所示的COSMO-RS計算模擬流程圖進行NADESs篩選,得到不同溶劑對于蘆丁的無限稀釋活度系數(shù)γ,發(fā)現(xiàn)以本研究所考察的三個HBA∶HBD配比下,摩爾比為1∶2時,所得NADESs最易配制、且γ相較其他摩爾比要小。

對于該摩爾比下的六組NADESs體系進行銀杏葉類黃酮的初步提取實驗,提取條件為80 ℃,2 h,固液比1∶30 (g/mL),所得不同體系下類黃酮得率如表2所示(同時列出該體系對蘆丁的γ)。由表2可見,甘油做HBD時對應(yīng)蘆丁的γ最小,同時提取類黃酮得率也最高,表明計算所得γ與類黃酮得率有一定相關(guān)性。

表2 基于氯化膽堿的不同NADESs(HBA與HBD摩爾比1∶2)模擬計算及初步提取結(jié)果

因此后續(xù)的實驗中采取摩爾比為1∶2的氯化膽堿/甘油所組成的NADESs,對于銀杏葉中類黃酮進行提取工藝優(yōu)化。

2.2 NADESs提取類黃酮單因素實驗

根據(jù)1.2所述的流程和方法對類黃酮提取進行單因素實驗,所得結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時間(A)、提取溫度(B)和固液比(C)對銀杏葉類黃酮得率的影響

由圖2A可以看出:提取的前2 h,類黃酮得率隨時間上升速率最快;在2～6 h之間則隨著時間的延長,類黃酮得率呈緩慢上升趨勢,提取時間為6 h時,得率可達4.18%,之后呈降低趨勢,提取時間為5、6 h時,類黃酮得率基本持平，可達4.18%,之后呈降低趨勢。結(jié)合上述提取率的變化趨勢,同時考慮到提取時間過長會導(dǎo)致提取成本增加,后續(xù)響應(yīng)面試驗擬定提取時間如表1所示的2、4、6 h三個水平。李保同[1]以銀杏葉為原料,采取纖維素酶50 ℃作用1 h,之后用70%乙醇溶劑采用微波輔助提取,累計微波時間2 min,類黃酮得率達到最高為3.96%。說明本研究所用NADESs較傳統(tǒng)有機溶劑得率較高,但所需提取時間較長,這主要是NADESs相比較傳統(tǒng)有機溶劑的粘度較高,因而達到傳質(zhì)平衡所需時間相對較長[9]。

溫度升高可促進傳質(zhì),在一定程度上提高生物活性物質(zhì)從固體原料中的脫出并溶解擴散到提取溶劑中的速度。采取固液比1∶30 (g/mL),在較優(yōu)的提取時間5 h的提取條件下,對不同提取溫度的影響進行了研究。由圖2B溫度對得率影響可以看出,隨溫度增加,得率逐漸增加,但是90 ℃下的得率略低于80 ℃,從節(jié)省加熱耗能以及類黃酮這一生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性保障兩方面考慮,不建議后續(xù)實驗中提取溫度高于90 ℃。因50 ℃時所得NADESs較為粘稠，傳質(zhì)較慢,也在一定程度上限制了類黃酮的提取,故響應(yīng)面試驗擬定選取55、70、85 ℃三個水平的提取溫度加以優(yōu)化。

由圖2C可以看出,當(dāng)采取相同量的銀杏葉進行提取時,隨提取所用溶劑量的增加,得率升高,但固液比1∶35和1∶40 g/mL條件下,平均得率均為4.28%,從節(jié)省溶劑損耗的角度而言,后續(xù)響應(yīng)面試驗中最高液固比設(shè)定為1∶35 g/mL。其它兩個水平分別為1∶25、1∶30 g/mL。

2.3 NADESs提取類黃酮響應(yīng)面試驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,進行NADESs提取類黃酮響應(yīng)面試驗,所得實驗結(jié)果如表3所示。

表3 NADESs提取類黃酮響應(yīng)面試驗結(jié)果

對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析,結(jié)果進行二次多元回歸擬合,得到因變量類黃酮得率和自變量X(固液比A,提取時間B和提取溫度C)之間的關(guān)系式如下:

得率(%)=3.21 +2.28A+0.094B+1.11C-0.0019AB-0.13AC-0.31BC-0.54A2-0.21B2-1.92C2

本實驗所得回歸模型方差分析如表4所示,方差分析表明,F值234.83且P<0.0001表明該模型具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義,失擬項P值為0.1266>0.05,說明該模型與實驗擬合程度差異并不顯著,可認為無失擬因素存在,可用該回歸方程對實驗結(jié)果進行分析[24]。校正決定系數(shù)R2(Adj R-Squared)為0.9934和變異系數(shù)CV為 2.22%,進一步說明模型具有較好的擬合性和合理性,可用來對NADESs提取銀杏葉中類黃酮的工藝進行初步分析和預(yù)測。預(yù)測校正決定系數(shù)(Pred R-Squared)為0.9650,與校正決定系數(shù)很接近,衡量有效信號與噪聲的信噪比為42.752(大于4.0視為合理)。

表4 回歸模型方差分析

自變量一次項C,二次項BC、B2和C2對結(jié)果影響極顯著(P<0.01),提取溫度、溫度與提取時間的交互作用、提取時間的平方以及提取溫度的平方,這幾個因素均對類黃酮得率的影響極顯著(P<0.01);而固液比與固液比的平方這兩個因素對類黃酮得率的影響顯著(P<0.05)。

對于響應(yīng)面實驗所得的實驗結(jié)果進行繪圖,得到各因素在不同水平下對于類黃酮得率的等高線(左)和三維圖(右)如圖3所示。固液比和提取時間的等高線(圖3A)最接近圓形,說明兩者交互作用最不顯著,而提取時間與提取溫度所得橢圓形最明顯(圖3E),說明兩者之間交互作用較大,該結(jié)果與表4方差分析的顯著性結(jié)果對應(yīng)。

圖3 固液比、提取時間、提取溫度對于類黃酮得率的響應(yīng)面實驗結(jié)果

利用擬合模型對銀杏葉中類黃酮的NADESs(氯化膽堿/甘油摩爾比1∶2)提取工藝進行優(yōu)化,得到最優(yōu)提取工藝為:固液比1∶30.7 (g/mL),73.2 ℃下提取4.1 h,模型預(yù)測類黃酮得率為5.70%。在預(yù)測最優(yōu)提取工藝下進行驗證實驗(3次重復(fù)),類黃酮得率為5.68%,與模型預(yù)測結(jié)果僅相差0.02%,高于文獻中以銀杏葉為原料提取類黃酮的得率。歐陽娜娜等[25]采用一定濃度乙醇作為提取溶劑,分別采取微波法和超聲波法輔助法進行優(yōu)化,得到銀杏葉中類黃酮得率分別為4.09%和3.68%。于文萃[7]采用正交實驗對銀杏葉中類黃酮的微波提取進行優(yōu)化,在70%乙醇濃度下,通過微波輔助,類黃酮得率最高可達4.71%。以上所得類黃酮得率的數(shù)據(jù)比對可以看出,盡管不同產(chǎn)地、不同生長周期的銀杏葉中,類黃酮含量可能存在差別,本研究所得銀杏葉中類黃酮得率遠高于采用傳統(tǒng)有機溶劑提取所得的結(jié)果。

3 結(jié)論

采用COSMO-RS計算方法,通過量子力學(xué)模擬計算,篩選出銀杏葉中類黃酮提取較優(yōu)的NADESs。在此基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法實驗設(shè)計,對影響類黃酮提取的工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明:采用氯化膽堿/甘油(摩爾比1∶2)的NADESs、固液比1∶30.7 (g/mL)、73.2 ℃下提取4.1 h,類黃酮得率可達5.68%。本研究通過計算機模擬計算和實驗相結(jié)合的方式,在節(jié)省人力、物力及時間投入的同時,得到一種綠色、高效、低成本的銀杏葉類黃酮NADESs最優(yōu)提取工藝,為銀杏葉資源的有效利用提供參考。