連續(xù)相變萃取靈芝多糖動力學(xué)球狀模型的建立及其結(jié)構(gòu)特征

張 軍,段 杉,全麗金,張杏思,曹 庸

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642)

靈芝(Ganodermalucidum)是屬于多孔菌科、靈芝屬的大型真菌,李時(shí)珍在《本草綱目》中對靈芝進(jìn)行了較為系統(tǒng)的闡述,它認(rèn)為靈芝具有“補(bǔ)肝氣”、“治胸中結(jié)”、“安神”等多種功效[1]。靈芝中化學(xué)成分主要有多糖類、三萜類化合物、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、甾醇類、生物堿類以及微量元素等[2]。其中靈芝多糖是靈芝重要的活性成分之一,具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抗衰老[5]、降血糖[6]以及免疫調(diào)節(jié)[7]等作用。

目前靈芝多糖的萃取方法多集中在通過優(yōu)化工藝條件來提高多糖得率上,主要有熱水浸提法、酶解法、超聲輔助萃取法、微波輔助萃取法以及超臨界萃取等。熱水浸提法遵循中藥的煎煮原則,利用了多糖微溶于冷水易溶于熱水的特性,為最常見的多糖萃取方法,但萃取率較低[8]。酶解法中酶的活性受溫度、pH、時(shí)間等因素影響較大,且酶制劑用量大成本高,難以規(guī)?；a(chǎn)[9]。超聲輔助萃取以及微波輔助萃取均是利用物理方法加速植物細(xì)胞壁的破壞從而溶出更多的多糖，但可能會對多糖結(jié)構(gòu)造成破壞[10-11]。超臨界萃取法其設(shè)備制造以及維護(hù)成本較高,且極高的壓力限制了設(shè)備體積的放大[12]。同時(shí)這些方法均存在萃取后料液分離困難、萃取溶劑回收不便等問題。本研究采用的新型連續(xù)相變萃取技術(shù)[13],利用水、乙醇、丁烷等作為萃取溶劑,利用萃取溶劑反復(fù)相變特性,能高效、穩(wěn)定地連續(xù)逆流萃取目標(biāo)物,該方法相比于傳統(tǒng)溶劑浸提法具有萃取率高、萃取時(shí)間短、溶劑回收方便、損失率低且粗提物無需過濾等優(yōu)點(diǎn),已應(yīng)用于多種天然活性物的萃取、中試以及工業(yè)化生產(chǎn)中。Zhao等[14]以丁烷為萃取溶劑,利用連續(xù)相變萃取技術(shù)結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化醬油渣中萃取油脂工藝,油脂產(chǎn)率達(dá)到28.43%。譚榮威等[15]以乙醇為萃取溶劑,從桉樹葉中成功萃取出桉葉多酚,多酚產(chǎn)率達(dá)到11.58%。但將連續(xù)相變技術(shù)應(yīng)用于多糖萃取過程中則未有文獻(xiàn)報(bào)道。故本實(shí)驗(yàn)旨在使用連續(xù)相變萃取裝置萃取靈芝多糖(GLP),以純水作為萃取溶劑,探究萃取溫度、萃取流速以及萃取時(shí)間對靈芝多糖萃取率的影響,同時(shí)基于Fick第二定律對靈芝多糖的萃取過程動力學(xué)以及熱力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,并研究了靈芝多糖的分子量、紅外光譜性質(zhì)以及微觀形態(tài),以期完善靈芝多糖萃取動力學(xué)的基礎(chǔ)研究,并對靈芝多糖的工業(yè)化生產(chǎn)、精深加工以及高附加值的開發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝 無限極(中國)有限公司;葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司;濃硫酸、苯酚、葡聚糖分析純 廣州市化學(xué)試劑廠。

LXXB-3型連續(xù)相變萃取設(shè)備 廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心自主研發(fā);119型中藥粉碎機(jī) 浙江溫嶺市藥材機(jī)械廠;RE-52 A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;SHZ-D循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市英峪高科儀器廠;Vertex 70型傅里葉紅外光譜儀 德國Bruker公司;AL 104型萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-1750型紫外可見分光光度計(jì)、LC-10 A型分析高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司;Evo 18型掃描電子顯微鏡 卡爾蔡司(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝多糖的制備 將靈芝子實(shí)體切片,在65 ℃烘箱干燥至恒重。粉碎過20目篩得到靈芝干粉,取靈芝干粉400.00 g,裝入3 L 連續(xù)相變萃取釜中密封,設(shè)置恒定流速28 L/h不變,在不同溫度(333.15、343.15、353.15、363.15、373.15 K)下進(jìn)行GLP萃取實(shí)驗(yàn),分別萃取10、30、50、70、90、110、130、150、170以及190 min后,將萃取液減壓濃縮并定容至1000 mL,得到靈芝多糖溶液,密封冷藏。同樣的切片、粉碎以及過篩方法,得到同樣質(zhì)量的靈芝干粉裝入3 L 連續(xù)相變萃取釜中密封,設(shè)置恒定溫度373.15 K不變,在不同流速(20、24、28、32、36 L/h)下進(jìn)行GLP萃取實(shí)驗(yàn)。分別萃取10、30、50、70、90、110、130、150、170以及190 min后,將萃取液減壓濃縮并定容至1000 mL,得到靈芝多糖溶液,密封冷藏。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及樣品多糖質(zhì)量濃度測定 采用苯酚-硫酸法[16],分別精密吸取100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mL,置于10 mL具塞比色管中,加蒸餾水補(bǔ)充至1.0 mL。加入5%苯酚溶液1.0 mL,混勻并加入5 mL濃硫酸后靜置5 min,將試管置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min,冷卻至室溫,使用紫外分光光度計(jì)于490 nm波長處測定吸光值,繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.01044 x-0.00109(y為吸光值,x為葡萄糖質(zhì)量濃度,g/mL),線性范圍為20～100 μg/mL,決定系數(shù)R2=0.9998。精密量取1.0 mL靈芝多糖溶液,按葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液測定方法測定靈芝多糖溶液吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算靈芝溶液多糖質(zhì)量濃度。

1.2.3 連續(xù)相變萃取GLP過程動力學(xué)模型 連續(xù)相變萃取GLP的傳質(zhì)過程可大致分為三個(gè)階段:一是溶劑經(jīng)高壓泵注入萃取釜中先浸潤靈芝物料表面,再逐漸向靈芝物料內(nèi)部滲透,GLP在溶劑中溶解;二是溶解了GLP的溶劑與靈芝物料外表面溶劑存在濃度差,GLP從靈芝物料內(nèi)部向其外表面遷移;三是GLP穿透靈芝物料表面并向外表面溶液主體中擴(kuò)散[17]。以上三個(gè)階段并沒有明確的界線,相互聯(lián)系連續(xù)進(jìn)行,又相互促進(jìn)和制約,對于整個(gè)溶出過程來說,第二步進(jìn)行的較慢,因此GLP從靈芝內(nèi)部擴(kuò)散到外表面主體溶液就是溶出過程的控制步驟,是影響萃取率的主要因素。

1.2.4 連續(xù)相變萃取GLP模型建立 將粉碎過20篩網(wǎng)后靈芝干粉假設(shè)為理想的球狀顆粒,同時(shí)連續(xù)相變萃取GLP是非穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散過程,顆粒中多糖擴(kuò)散沿顆粒內(nèi)部徑向進(jìn)行,且在任何時(shí)間內(nèi)顆粒內(nèi)多糖均勻分布;同一溫度以及流速下多糖擴(kuò)散系數(shù)恒定,無軸向擴(kuò)散系數(shù)以及無顆粒表面?zhèn)髻|(zhì)阻力[18]。

因此,采用基于Fick第二擴(kuò)散定律的一階擴(kuò)散模型來研究連續(xù)相變萃取GLP的動力學(xué)。

式(1)

式中:r為到球形顆粒中心的距離(m);C為在r和t(min)時(shí)GLP的有效擴(kuò)散濃度(mg/mL);t為萃取持續(xù)時(shí)間(min);D為有效擴(kuò)散系數(shù)(mm2/min)。

根據(jù)傅里葉變換法[19]求得:

式(2)

式中:C0和C∞分別為初始t時(shí)刻和溶出達(dá)到平衡時(shí)多糖有效擴(kuò)散濃度(mg/mL);在初始時(shí)C0=0,濃度的高次項(xiàng)趨近于零可以忽略不計(jì),因此n=1時(shí),兩邊取對數(shù)得:

式(3)

式(3)即為連續(xù)相變萃取GLP的動力學(xué)模型方程,該模型不僅表征了靈芝顆粒大小、萃取溫度、萃取流速以及萃取時(shí)間與多糖質(zhì)量濃度之間的關(guān)系,還可通過求解相關(guān)動力學(xué)參數(shù),驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與動力學(xué)模型計(jì)算值的吻合程度。

1.2.5 GLP分子量測定 采用島津高效液相色譜儀配備示差折光檢測器,凝膠色譜柱TSKgel G6000 PWxl與TSKgel G 3000PWxl串聯(lián),流動相為0.02 mol/L Na2SO4,流速為0.6 mL/min,檢測時(shí)間為50 min,柱溫為35 ℃,上樣體積為20 μL。稱取相對分子量為5×103、1.2×104、5×104、1.5×105、2.7×105、4.1×105、6.7×105以及1.5×106Da的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品用流動相溶解后過0.45 μm濾膜進(jìn)樣,記錄色譜圖。得到葡聚糖分子量對數(shù)lg M與洗脫體積的曲線,并對曲線進(jìn)行線性擬合,用于確定待測樣品多糖分子量分布范圍[20]。線性方程為y=-0.4726 x+12.70(x為洗脫體積,y為相對分子量對數(shù)lg M),線性決定系數(shù)R2=0.9921。在同等條件下測定GLP樣品,并利用樣品洗脫體積計(jì)算其分子量[21]。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析 稱取1 mg干燥的GLP與100 mg KBr 粉末于瑪瑙研缽中研磨混合均勻,壓成薄片,在波數(shù)4000～400 cm-1范圍內(nèi)利用紅外光譜儀進(jìn)行光譜掃描[22]。

1.2.7 掃描電鏡分析 利用掃描電子顯微鏡法分析GLP形態(tài)結(jié)構(gòu)。將凍干GLP裱在銅樁上面,置于離子濺射儀中,在10 mA電流的條件下噴鍍鉑金1.5 min,使材料表面上鍍上一層鉑膜,然后利用掃描電鏡觀察不同倍數(shù)(50×、2000×、5000×)下GLP形態(tài)特征[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次,結(jié)果以平均值表示,且標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過5%;采用GraphPad Prism 5.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 動力學(xué)模型的建立

圖1 不同溫度下與時(shí)間的關(guān)系圖

圖2 不同流速下與時(shí)間的關(guān)系圖

表1 不同溫度下與時(shí)間的回歸結(jié)果

表2 不同流速下與時(shí)間的回歸結(jié)果

由表1以及表2可知,在不同溫度以及不同流速下回歸方程均顯示出良好的決定系數(shù)(R2>0.94),說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與推導(dǎo)所得動力學(xué)模型式較符合。相同流速情況下,溫度對萃取速率影響較大,表觀速率常數(shù)k隨溫度升高而增大,表明升溫能夠加速GLP的溶出;相同溫度情況下,隨著流速的增加,速率常數(shù)k呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,在流速低于28 L/h時(shí),增加流速提高了靈芝干粉與溶劑間的接觸面積,有利于多糖的溶出,而當(dāng)流速繼續(xù)增加到28 L/h以上時(shí),k值減小,可能由于溶劑流速過大,難以在萃取容器出口端達(dá)到平衡條件,導(dǎo)致萃取速率放緩[24]。

表3 不同溫度下與時(shí)間的回歸結(jié)果

圖3 不同溫度下與時(shí)間的關(guān)系圖

表4 不同流速下與時(shí)間的回歸結(jié)果

圖4 不同流速下與時(shí)間的關(guān)系圖

由圖3、圖4可得,隨著萃取時(shí)間的增加,多糖相對萃余率呈指數(shù)趨勢下降,因此延長萃取時(shí)間有利于多糖溶出。在相同流速情況下,隨著溫度升高,相對萃余率逐漸減小,表明溫度越高越有利于多糖的溶出,在溫度為373.15 K時(shí)曲線有最大斜率值,表明在該溫度下萃取速率達(dá)到最快。在相同溫度情況下,當(dāng)流速低于28 L/h時(shí),相對萃余率隨著流速的增加而減小,表明增加物料與溶劑的接觸面積有利于多糖的溶出,繼續(xù)升高流速,相對萃取率則出現(xiàn)回升,表明物料與溶劑間存在最佳接觸面積以及接觸速率,過高或過低流速均不利于多糖的溶出。由表3、表4可以看出,在不同溫度以及不同流速下,擬合方程決定系數(shù)R2均在0.93以上,表明萃取過程較符合指數(shù)模型且試驗(yàn)數(shù)據(jù)與方程吻合程度也較高。

2.1.3 半衰期求解 由半衰期t1/2=ln2/k對萃取溫度作圖,并進(jìn)行擬合,方程為y=-7.440x+2864.4,R2=0.9337。由此可以計(jì)算出在最適萃取溫度下,萃取出一半靈芝多糖所需的時(shí)間。半衰期可反應(yīng)出萃取效率的高低,半衰期越小則萃取效率越高。由圖5可以看出半衰期隨著萃取溫度的增加不斷減小,表明升高溫度有利于GLP萃取,能明顯縮短萃取時(shí)間。

圖5 t1/2與溫度關(guān)系圖

2.1.4 相關(guān)熱力學(xué)性質(zhì) 由Van’t Hoff方程lnk=-ΔHθ/RT+ΔSθ/R以及ΔGθ=ΔHθ-TΔSθ可分別計(jì)算出吉布斯自由能ΔGθ、焓變ΔHθ以及熵變ΔSθ。

由表5中可以看出,萃取過程中的焓變ΔHθ和熵變ΔSθ均為正值,表示連續(xù)相變萃取靈芝干粉是一個(gè)吸熱過程,這個(gè)現(xiàn)象符合預(yù)期,因?yàn)槎嗵鞘菑墓滔?靈芝干粉)中轉(zhuǎn)移到液相溶劑(水)中。吉布斯自由能ΔGθ均為負(fù)值表明GLP的萃取過程是自發(fā)過程,自由能的變化趨勢與溫度的變化趨勢相反,自由能的大小隨著溫度的增加而減小,溫度越高自由能越小,萃取過程就越容易進(jìn)行。

表5 GLP萃取過程中的各熱力學(xué)參數(shù)

2.2 多糖結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 多糖分子量分布 圖6為GLP的HPGPC檢測圖譜,按出峰時(shí)間將GLP分為不同的組分。分子量分別為2.26×107、5.56×105、2.67×103以及1.35×103Da。低分子量比高分子量顯示了更大的峰面積,表明連續(xù)相變萃取GLP的主要組分為分子量<105Da的生物小分子[25]。

圖6 GLP的HPGPC圖譜

2.2.2 多糖紅外光譜分析 如圖7所示,紅外光譜顯示4000～400 cm-1呈多糖類物質(zhì)的特征吸收峰,3363.70 cm-1附近的強(qiáng)吸收峰、2939.40、1625.92以及1151.45 cm-1是多糖物質(zhì)的特征吸收峰表示為O-H伸縮振動、C-H伸縮振動、酰胺鍵的C=O吸收峰以及C-C骨架伸縮振動[26];1400～1200 cm-1存在兩個(gè)吸收峰,為C-H的變角振動和C-O的彎曲振動[27];1080.09和1045.37 cm-1為吡喃糖苷的特征吸收峰[28];885.28 cm-1是β-吡喃環(huán)C-H的彎曲振動特征峰[29];765.70 cm-1是α-端基差向異構(gòu)體的C-H變角振動[30];636.48、524.61 cm-1處弱的吸收峰可能是酰胺中的-NH2扭曲振動形成的[31];由此可知,GLP為β-吡喃型多糖。

圖7 GLP的紅外光譜圖

2.2.3 掃描電鏡分析 圖8(A)顯示在低倍鏡下可以看出多糖層疊到了一起、形狀不規(guī)則且表面有較多褶皺;圖8(B)可以看出其主要由碎片狀聚集體所堆積組成,規(guī)整性不強(qiáng),分布不均勻,并伴有少量絲帶狀連接結(jié)構(gòu);圖8(C)則能看到GLP呈現(xiàn)大量小碎片狀態(tài)并混有極少量的較大片層,碎片間聯(lián)系緊密,間距較小,同時(shí)可以觀察到表面平整光滑,這可能是由于許多不同結(jié)構(gòu)或分子量的多糖在較強(qiáng)的分子間作用力下聚集成不定型結(jié)構(gòu),形成宏觀狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和形貌特征[32]。

圖8 GLP的SEM圖

3 結(jié)論

以靈芝為原料,根據(jù)Fick第二定律建立起GLP的連續(xù)相變萃取一階擴(kuò)散模型,此模型在一定程度上可以反映靈芝顆粒半徑、萃取溫度、流速以及萃取時(shí)間與多糖萃取液質(zhì)量濃度之間的關(guān)系。并求得了不同溫度或不同流速下的速率常數(shù)、相對萃余率、半衰期等動力學(xué)參數(shù),確立了萃取過程中的速率常數(shù)從333.15 K下的0.0017 min-1變化到373.15 K下的0.0065 min-1,相對萃余率符合中草藥溶出指數(shù)方程模型,溫度越高,半衰期越小,萃取效率越高。在溫度373.15 K、流速28 L/h以及萃取時(shí)間190 min時(shí)有最大多糖得率2.04%。同時(shí)分析了熱力學(xué)過程,結(jié)果顯示GLP萃取是一個(gè)自發(fā)吸熱的過程,萃取過程中吉布斯自由能隨溫度的增加而逐漸減小。試驗(yàn)求得的動力學(xué)參數(shù)以及熱力學(xué)參數(shù)可為連續(xù)相變萃取靈芝多糖工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考和指導(dǎo)。本結(jié)果也可為天然活性物有效成分的生產(chǎn)工藝設(shè)計(jì)及操作條件的選擇和優(yōu)化提供有價(jià)值的依據(jù)。

高效凝膠滲透色譜法分析GLP分子量分布范圍為1.35×103～2.26×107Da,分子量分布范圍廣,不同分子量組分在GLP中占比差異大。紅外光譜表明GLP是一種β-吡喃型多糖,樣品中有少量蛋白質(zhì)或氨基酸分子基團(tuán)。掃描電鏡結(jié)果表明GLP呈褶皺狀,由碎片狀聚集體所組成,大小不均勻。因此,通過連續(xù)相變萃取得到的GLP可能具有較復(fù)雜的結(jié)構(gòu),而多糖具有的多種生物活性則與其較復(fù)雜的結(jié)構(gòu)有密切聯(lián)系,有必要進(jìn)行進(jìn)一步的生物活性評價(jià)如體外細(xì)胞抗氧化、抗衰老活性、體外細(xì)胞和動物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤活性等,從而為推廣靈芝食用菌資源的高效利用和其活性成分的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。