適于南瓜汁原料益生酵母菌的分離鑒定及發(fā)酵工藝優(yōu)化

杜靜婷,施俊鳳,賈慧文,雷亞堃

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山西太原 030006)

益生菌是對人和動物健康有益的一類活菌的總稱,不僅能賦予食物特殊風(fēng)味和口感[1],還能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境[2],對健康大有裨益。常見的用于飲品的益生菌有雙歧桿菌(Bifidobacterium)和乳桿菌(Lactobacillus)[3-4]。但越來越多的研究發(fā)現(xiàn),酵母菌與乳酸菌具有共生互補作用[5],可作為益生菌在腸道中發(fā)揮有益作用,可將其應(yīng)用于果蔬汁發(fā)酵中[6-8]。

南瓜(CucurbitamoschataDuch.)是一種高經(jīng)濟價值作物,營養(yǎng)豐富,富含多糖、β-胡蘿卜素、生育酚等多種天然活性物質(zhì)[9-11],具有降脂保肝[12]、防癌[13]、降血糖[14]、增強免疫等功效[10]。雖然南瓜有豐富的營養(yǎng)價值,但目前仍以鮮食為主,人們對其的攝入量有限。將南瓜加工制成發(fā)酵型飲料,既可以改善風(fēng)味,滿足人們對南瓜攝入量的需求,又可以達到營養(yǎng)保健的效果。目前關(guān)于南瓜發(fā)酵的研究較少,且大多采用現(xiàn)有菌種對南瓜進行發(fā)酵,并以其理化指標為響應(yīng)值進行工藝優(yōu)化[15-16],不能很好地反映飲料成品的口感。本研究以南瓜為原料,從山西傳統(tǒng)發(fā)酵醬菜白蘿卜中篩選適合于南瓜發(fā)酵的益生菌株,對其進行分子生物學(xué)鑒定及胃腸道耐受性實驗,采用單因素實驗和響應(yīng)面試驗結(jié)合的方法,以固酸比及感官評價作為指標,對南瓜發(fā)酵飲品的發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化,以期為新型飲品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜品種為“蜜本” 山西省河津市;傳統(tǒng)醬菜 山西省代縣農(nóng)家;2×Power Taq PCR Mastermix,gold view Ⅰ型核酸染色劑 Solarbio公司。

Purifier Logic+型生物安全柜 美國Labconco公司;TC-96/G/H/B/C型Lifeeco基因擴增儀 杭州博日科技有限公司;Geldol-Lt 315型凝膠成像系統(tǒng) 美國UVP公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵菌株的篩選和鑒定 將傳統(tǒng)方法發(fā)酵的醬菜白蘿卜切丁后打漿,加少量蒸餾水稀釋至不同濃度梯度后涂板,30 ℃培養(yǎng)48 h,劃線法進行單菌落分離純化,將純化后的菌株對南瓜進行發(fā)酵,篩選口感風(fēng)味好的菌株進行鑒定和發(fā)酵工藝優(yōu)化。

根據(jù)真菌DNA基因組提取試劑盒的方法提取酵母菌DNA,采用ITS1(5′-TCCGTA GGTGAA aCCTGCG G-3′)和ITS4(5′-TCCTCC GCTTAT TGATAT GC-3′)引物對進行PCR擴增,反應(yīng)體系為50 μL:2×MasterMix 25 μL,ITS1/4各2 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性40 s,58 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán),72 ℃終延伸10 min。擴增完成后,取5 μL擴增產(chǎn)物電泳檢測,用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Gel Extraction mini Kit W5221)回收純化目的片段,純化產(chǎn)物送Invitrogen公司測序。將測序結(jié)果與GenBank序列進行同源性比較,以登錄號NR 111405為外參,以鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,重復(fù)1000次,計算進化樹中每個分支的Boostrap值,確定酵母菌種類[17]。

1.2.2 體外胃腸道模擬耐受性實驗 按云月英等[18]的方法配制人工胃腸液,28 ℃、160 r/min培養(yǎng)目標菌液24 h后,制成母液。接種1 mL母液至9 mL人工胃液中,于28 ℃、160 r/min條件培養(yǎng)2 h,隨后取1 mL于人工腸液中發(fā)酵,分別于0、2、4、6、8 h進行菌落計數(shù),測試菌株存活率,公式如下:

式(1)

式中:N1表示于各時間測得的菌落數(shù);N0表示起始菌落數(shù)。

1.2.3 發(fā)酵南瓜汁工藝流程及操作要點 南瓜發(fā)酵的工藝流程如下:挑選南瓜→去皮、切塊→預(yù)煮→打漿→稀釋加糖→貼標簽→裝瓶→滅菌→冷卻→接種→恒溫發(fā)酵→指標測定。

操作要點:

a. 選料。選用完全成熟、色澤金黃、無機械傷及霉變、品質(zhì)較好的南瓜。

b. 去皮、切塊。清洗去瓤后去皮,將南瓜切成5 cm×5 cm塊狀。

c. 預(yù)煮。將切塊后的南瓜于沸水浴中煮10 min。

d. 打漿。將預(yù)煮后的南瓜撈出打漿,按1∶10加入蒸餾水后過60目篩,去除未打碎顆粒物。

e. 裝瓶滅菌。將稀釋加糖后的南瓜汁裝入250 mL的絲口試劑瓶中,虛擰瓶蓋按實驗條件進行滅菌,滅菌結(jié)束后擰緊瓶蓋。

f.接種。于生物安全柜中進行,將發(fā)酵種子液加入南瓜汁中,進行恒溫發(fā)酵。

1.2.4 感官評價 發(fā)酵飲料的可溶性固形物和總酸含量的測定參考程晨的方法[19]。感觀評價采用評分的方法,評分人員共15人,分別對其評分并取其平均值。感官評價標準如表1。

表1 南瓜發(fā)酵飲料感官評定標準

1.2.5 單因素實驗 對可能影響南瓜汁發(fā)酵工藝的各因素進行單因素實驗,各單因素的不同水平如表2。進行各單因素實驗時,其它固定因素水平分別為:南瓜濃度30%,加糖量5%,105 ℃滅菌20 min,接菌量5%,發(fā)酵時間48 h,發(fā)酵溫度32 ℃,其中菌株母液濃度為5×1010CFU/mL。各處理設(shè)3個重復(fù),以固酸比(式2)和感官分值作為評價指標。

表2 單因素實驗因素水平表

式(2)

式中:NSSC表示可溶性固形物,°Brix;NTA表示可滴定酸含量,g/100 mL。

1.2.6 響應(yīng)面試驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果選擇接菌量、發(fā)酵時間、南瓜濃度、加糖量4因素設(shè)計Box-Behnken(BBD)實驗。以感官評分作為響應(yīng)值,實驗設(shè)計見表3。

表3 BBD實驗因素水平表

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用NCBI BLASTn比對測序結(jié)果,MAGA-X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,SPSS 17.0對單因素實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析,Design expert 10.0.4.0進行Box-Behnken實驗設(shè)計及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵菌種的篩選

從傳統(tǒng)醬菜發(fā)酵蘿卜中共分離細菌115株,酵母菌86株,將各菌株經(jīng)過初步發(fā)酵實驗,以感官評價為響應(yīng)值進行篩選,感官評價結(jié)果如表4所示。發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同菌株發(fā)酵后,南瓜汁的品質(zhì)性狀差異較大,其中菌株JC-1發(fā)酵后南瓜汁色澤鮮亮、香氣濃郁、風(fēng)味獨特,其口感和色澤最優(yōu),因此選擇該菌株為發(fā)酵菌株。

表4 發(fā)酵產(chǎn)香實驗感官評定結(jié)果

2.2 發(fā)酵菌種的鑒定

以提取的純化菌株基因組DNA為模板,應(yīng)用通用引物ITS1/4進行PCR擴增,獲得長度為500～750 bp的DNA片段(圖1)。將其進一步測序,發(fā)現(xiàn)其堿基長度為611 bp,與GenBank序列比對發(fā)現(xiàn)與登錄號MK394104.1的菌株同源性為100%。

圖1 菌株JC-1的PCR產(chǎn)物電泳圖

采用MEGA-X軟件,以登錄號NR 111405菌株為外參構(gòu)建JC-1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹?？梢钥闯?JC-1與登錄號為MK394104、LC413220、NR12006、MH782058、KY103245的5株D.hansenii菌株聚在一支,自展支持率為87%,表明JC-1菌株與D.hansenii親緣關(guān)系最近。確定JC-1菌株為漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)。

圖2 基于ITS基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 人工胃腸液耐受實驗

在進食后1 h,胃酸pH大約為3.0,腸液中膽鹽濃度最高約為1.8%[20],在此條件下模擬菌株在胃腸道中的生存能力,結(jié)果如圖3?？煽闯鼋?jīng)過共10 h的人工胃液和人工腸液培養(yǎng)后,菌株存活率可達78.48%(圖3),與同類益生菌發(fā)酵飲料產(chǎn)品相比,存活率高20%左右[18,21-22]。

圖3 人工胃腸液環(huán)境下JC-1菌株存活率

2.4 各因素對發(fā)酵南瓜飲品指標的影響

固酸比能反映發(fā)酵后南瓜汁的口感。實驗中發(fā)現(xiàn),當(dāng)固酸比在7～13時菌株發(fā)酵后酸甜適口,口感較好。故以感官評分為主要依據(jù),結(jié)合固酸比,對發(fā)酵南瓜汁的品質(zhì)作出評價。結(jié)果表明,不同因素對發(fā)酵南瓜汁品質(zhì)的影響也不同(圖4),其中接菌量、發(fā)酵時間、南瓜濃度、加糖量4因素對南瓜汁感官評價值和固酸比的差異較大,而滅菌溫度和發(fā)酵溫度影響相對較小?？傻贸鰡我蛩貙嶒炛懈饕蛩刈顑?yōu)值分別為接菌量12.5%、發(fā)酵時間60 h、南瓜濃度40%、加糖量7.5%、發(fā)酵溫度32 ℃、滅菌溫度110 ℃。故固定發(fā)酵溫度32和110 ℃滅菌條件,設(shè)計4因素3水平響應(yīng)面實驗,進一步優(yōu)化發(fā)酵工藝。

圖4 各因素對南瓜飲品品質(zhì)的影響

2.5 發(fā)酵南瓜汁工藝響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.5.1 回歸模型的建立 以感官評分為因變量,設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗。由于滅菌溫度和發(fā)酵溫度對感官評分影響較小,所以固定發(fā)酵溫度為32 ℃,滅菌條件為110 ℃ 20 min,以接菌量、發(fā)酵時間、南瓜濃度和加糖量為自變量,設(shè)計4因素3水平的BBD實驗。實驗設(shè)計及結(jié)果如表5。

表5 BBD實驗設(shè)計及結(jié)果

利用Design Expert 10.0.4.0對數(shù)據(jù)進行回歸擬合,所得多元二次方程為:Y=90.08+7.51A+0.55B-1.54C+1.09D-4.56AB-0.44AC-0.95AD+2.22BC+1.03BD-2.15CD-8.03A2-7.27B2-10.38C2-7.36D2。

2.5.2 回歸模型方差分析 對表4的響應(yīng)面實驗結(jié)果進行方差分析,如表6所示。

表6 回歸模型方差分析表

同時可看出,A因素影響極顯著(P<0.01),C因素影響顯著(P<0.05),與單因素實驗相一致;B、D兩因素影響不顯著(P>0.05),與單因素實驗存在一定差異,可能是因為在四個因素的綜合作用下,對漢遜德巴利酵母的發(fā)酵能力有所影響,從而導(dǎo)致南瓜汁品質(zhì)發(fā)生一定變化。本實驗四因素對發(fā)酵南瓜汁的影響大小排序為接菌量>南瓜濃度>加糖量>發(fā)酵時間;兩因素交互作用中,AB交互作用影響極顯著(P<0.01)。

2.5.3 響應(yīng)曲面分析 根據(jù)表5中的實驗結(jié)果,繪制響應(yīng)面曲面圖(圖5),分析交互作用對發(fā)酵南瓜汁的感官評價的影響。由圖5可知,當(dāng)接菌量位于13.5%～17.5%,發(fā)酵時間在54～66 h時,南瓜汁的評分最高。接菌量在7.5%～13.5%,南瓜汁品質(zhì)急速上升,說明添加一定量的菌種對南瓜品質(zhì)的保證是必要的;隨后趨勢趨于平緩,說明菌種添加過多對品質(zhì)的提升無顯著影響。隨著發(fā)酵時間的延長,南瓜汁品質(zhì)先上升達到最高點后下降,說明在一定時間階段發(fā)酵南瓜汁的品質(zhì)最優(yōu),但時間過長或過短均不利于品質(zhì)的提升。

圖5 各因素交互作用的響應(yīng)面圖

2.5.4 驗證實驗 在BBD實驗設(shè)計合理的前提下,優(yōu)化實驗最佳條件為接菌量15.0277%,加糖量7.73653%,發(fā)酵時間58.391 h,南瓜濃度38.9553%,在此條件下,感官評分為92.0093?？紤]實驗可行性,修正上述最優(yōu)條件為:接菌量為15.0%,加糖量為7.7%,發(fā)酵時間為58 h,南瓜濃度為39.0%。在此條件下重復(fù)實驗三次,進行感官評價,得分為91.68±2.35,與預(yù)測值92.0093相差0.37%,說明該方法所得結(jié)論可信。

3 討論與結(jié)論

本實驗所用菌株由山西傳統(tǒng)發(fā)酵醬菜白蘿卜中篩選,經(jīng)18S rDNA鑒定,確定為漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)。有研究表明,該酵母對其他致病菌有毒害作用[23],能促進干酪、香腸及傳統(tǒng)醬菜風(fēng)味的形成[24-26],是一種有益微生物。將該菌株應(yīng)用于食品發(fā)酵工業(yè),可擴展酵母菌產(chǎn)業(yè)的多功能發(fā)展,促進酵母菌的研究與發(fā)展。

衡量益生菌能否發(fā)揮功能作用的一個重要指標是抵抗胃酸、膽鹽的能力。不同菌株其耐受力不同,有學(xué)者分析了菌株在低pH和/或高膽鹽濃度條件下菌株的存活情況。云月英等[18]對4株乳酸菌進行體外耐酸、耐膽鹽測定,其中有2個菌株存活率達到50%以上。相比普通乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB),漢遜德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)具有高耐鹽特性[27],能更好地適應(yīng)胃腸道微環(huán)境。實驗室研究也證明這一點,與前人研究結(jié)論相同[28]。

經(jīng)響應(yīng)面進行發(fā)酵工藝的優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)在接菌量為15.0%,加糖量為7.7%,發(fā)酵時間為58 h,南瓜濃度為39.0%,發(fā)酵溫度32 ℃,110 ℃滅菌20 min條件下,南瓜汁得分為91.68,口感最佳、組織結(jié)構(gòu)及狀態(tài)最好。以果蔬為基質(zhì)生產(chǎn)發(fā)酵飲品是目前發(fā)酵行業(yè)中一個新興產(chǎn)業(yè)。單一菌株與復(fù)合菌種發(fā)酵飲料相比,口感略單薄,將不同菌種按一定比例混合后發(fā)酵果蔬汁,可形成口感更豐富的功能性飲料。研究表明酵母菌與乳酸菌之間有共生作用,段小果等[5]研究表明不同菌種有互補機制,且代謝產(chǎn)物能相互促進或抑制,也有學(xué)者開始嘗試將不同配比的菌種應(yīng)用于發(fā)酵果蔬汁[6,29]。同時還可配比形成復(fù)合果蔬,經(jīng)發(fā)酵形成一種口感清爽、有果蔬清香的功能飲料[30]。Xu等[31]將不同益生菌加入混合果蔬汁中發(fā)酵后產(chǎn)生了多種芳香類物質(zhì),并發(fā)現(xiàn)部分益生菌有富集硒的功能。復(fù)合菌種及復(fù)合果蔬發(fā)酵從而形成口感和諧、營養(yǎng)全面的新型發(fā)酵飲料是以后果蔬飲料發(fā)展的必然趨勢。