血清microRNA-497定量檢測與結(jié)直腸癌血管生成的關(guān)系及其臨床意義

劉少平 談惠群 胡亞華 張海 章國星

鄂東醫(yī)療集團黃石市中心醫(yī)院湖北理工學院附屬醫(yī)院1全科醫(yī)學科，2消化內(nèi)科（湖北黃石435000），3武漢科技大學職業(yè)危害識別與控制湖北省重點實驗室（武漢430081）

新生血管的形成過程是腫瘤維持自身生長和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并參與腫瘤的復發(fā)過程。結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是新生血管豐富的實體腫瘤，活躍的血管生成能力和轉(zhuǎn)移能力是其兩大重要特征。評估CRC 新生血管狀態(tài)對其指導治療和預后評價具有重要意義［1-2］。近年研究顯示RNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［3-7］；miR-497 是重要的腫瘤抑制因子，可調(diào)控細胞分化、增殖、凋亡、上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成等多個腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學事件［8-14］。本研究定量檢測CRC 患者血清miR-497 表達量變化，探討其與CRC 血管生成、侵襲轉(zhuǎn)移及預后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇黃石市中心醫(yī)院2016年1月-2017年1月經(jīng)病理確診并行根治性手術(shù)治療的CRC 患者93 例為CRC 組，所有患者術(shù)前未行放化療及其他抗腫瘤治療，無其他系統(tǒng)惡性疾病，且全程完成術(shù)后3年預后隨訪；其中男51 例，女42例；年齡（57.6 ± 12.5）歲；臨床病理資料按照UICC第6 版標準進行評估；所有患者術(shù)后治療按2010版衛(wèi)生部結(jié)直腸癌診療規(guī)范進行。術(shù)后預后隨訪中定期復查結(jié)腸鏡、增強CT 等檢查，確診CRC 復發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移患者24 例。記錄術(shù)后生存時間。30 例健康志愿者為對照組，年齡、性別與CRC 組具有可比性；30 例正常結(jié)直腸黏膜組織標本均來源黃石市中心醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心。

1.2 標本的處理和RNA 的抽提抽取CRC 患者手術(shù)前1 d及對照組受試者清晨空腹肘靜脈血8 mL，抗凝離心，取血清低溫-80 ℃保存以備提取RNA；加入Trizol 1 mL（invitrogen 公司）后，用經(jīng)典的方法抽提總RNA。將適量手術(shù)切除的CRC 新鮮癌組織和內(nèi)鏡中心提供的正常結(jié)直腸黏膜組織置于多聚甲醛中用于石蠟包埋。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA用RNA 電泳證實RNA未降解，測定所抽提RNA 濃度。Oligo dT18（10 pmol）1 μL 加入RNA 2 μg，混勻后置65 ℃水浴5 min；迅速取出轉(zhuǎn)置冰上，順序加入5 × 緩沖液5.0 μL、10 mmol/L dNTPs 2.5 μL、200 U/μL 逆轉(zhuǎn)酶（MMLV）1.0 μL、400 U/ μL RNA 酶抑制劑0.5 μL，最后加DEPC 水至總體積25 μL。反應條為件：37 ℃1 h，95 ℃5 min。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-80 ℃冰箱保存待測。

1.4 miR-497 熒光定量RT-PCR 檢測以U6 為內(nèi)參照，應用Universal PCR Mater Mix 試劑盒（ABI 公司產(chǎn)品）在ABI Prism 7300 型實時熒光定量PCR 儀上檢測，以cDNA 為模板擴增miR-497 和U6 基因。用ABI 公司的引物設(shè)計軟件Primer Express 設(shè)計引物；miR-497 上游引物為5′-CATACCTGACTGTGTTGCTAAA-3′，下游引物5′-CTTTTGAGTGTTGGTGATTTGG-3′；U6 上游引物為5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應條件為：95 ℃變性10 min，95 ℃15 s 和60 ℃1 min，共40 個循環(huán)。實時熒光定量PCR 儀采集miR-497 及內(nèi)參照U6 擴增各循環(huán)熒光信號，以SDS1.4 軟件分析其△△Ct 值及相對表達量（relative quantity，RQ），RQ=2-△△Ct。

1.5 CD34 檢測和MVD 計算采用免疫組化方法檢測CRC 癌組織及正常結(jié)直腸黏膜組織中CD34 表達，檢測試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，實驗步驟嚴格按試劑盒操作說明進行。CD34 標記血管內(nèi)皮細胞，染色呈棕黃色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞膜，作為一個血管記數(shù)。每張免疫組化切片由兩名病理醫(yī)師分別計數(shù)；先在低倍顯微鏡下確定3 個血管著色最密集區(qū)域，再在高倍視野下計算微血管，取3 個視野的均值作為MVD。兩人計數(shù)相差10%以上者重新計數(shù)。腫瘤內(nèi)的硬化區(qū)域、腫瘤細胞稀少區(qū)域內(nèi)的微血管不進行計數(shù)。

1.6 血清VEGF、Ang-2 檢測取適量凍存血清，采用ELSIA 法檢測；VEGF 檢測試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，Ang-2 檢測試劑盒購自睿信生物科技有限公司，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)以±s表示，應用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多樣本比較采用單因素方差分析，兩樣本比較用t檢驗，多因素分析采用Cox 回歸模型。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清miR-497 表達量，VEGF、Ang-2 含量及MVD 的比較CRC 癌組織中CD34 表達，見圖1。CRC 組癌血清miR-497 表達量顯著低于正常對照組（P＜0.01），而血清VEGF、Ang-2 含量及MVD 均顯著高于正常對照組（P＜0.01）；CRC 組血清miR-497 表達量與血清VEGF、Ang-2 含量、癌組織MVD 均呈負相關(guān)（r= -0.437，-0.461，-0.383，均P＜0.01），血清VEGF、Ang-2 含量與癌組織MVD 均呈正相關(guān)（r= 0.605，0.669，P＜0.01）見表1。以CRC 組血清miR-497 表達量的均值3.03（2-△△Ct）為界值，將患者分為高表達組，n= 62 例，低表達組，n= 31 例。血清miR-497 低表達組血清VEGF、Ang-2 含量及癌組織MVD 均顯著高于血清miR-497 高表達組（均P＜0.01），見表2。

2.2 CRC 組血清miR-497 表達量與腫瘤臨床病理特征及預后的關(guān)系CRC 組術(shù)前血清miR-497表達量與CRC 分化程度、TNM 分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否遠處轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)（P＜0.01），與是否術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)（P＜0.01）、與生存期長短呈正相關(guān)（P＜0.01），而與患者年齡、性別、腫瘤大小及部位均無相關(guān)性（P ＞0.05），見表3。

圖1 CD34 表達于血管內(nèi)皮細胞Fig.1 CD34 expression in vascular endothelial cells

表1 各組血清miR-497 表達量，VEGF、Ang-2 含量及MVD 的比較Tab.1 Comparison of miR-497 expression levels and VEGF，Ang-2 levels in serum in CRC groups and control group ±s

表1 各組血清miR-497 表達量，VEGF、Ang-2 含量及MVD 的比較Tab.1 Comparison of miR-497 expression levels and VEGF，Ang-2 levels in serum in CRC groups and control group ±s

注：與正常對照組比較，aP ＜0.01

分組正常對照組結(jié)直腸癌組例數(shù)30 93 miR-497 表達量（2-△△Ct）4.87±1.14 3.03±1.75a VEGF 含量（ng/L）166.20±116.44 298.36±192.65a Ang-2 含量（ng/L）885.34±283.26 2 460.43±495.38a MVD 值3.4±1.3 7.3±2.9a

表2 CRC 組血清miR-497 表達量與血清VEGF、Ang-2 含量及MVD 的關(guān)系Tab.2 Relationship between the miR-497 expression levels and VEGF，Ang-2 levels in serum in the CRC group ±s

表2 CRC 組血清miR-497 表達量與血清VEGF、Ang-2 含量及MVD 的關(guān)系Tab.2 Relationship between the miR-497 expression levels and VEGF，Ang-2 levels in serum in the CRC group ±s

注：與miR-497 高表達組比較，aP ＜0.01

檢測指標miR-497 高表達組miR-497 低表達組例數(shù)62 31 VEGF 含量（ng/L）231.47±163.38 332.36±208.26a Ang-2 含量（ng/L）1 562.43±381.28 3 490.69±474.62a MVD 值5.1±2.3 8.8±2.8a

2.3 多因素Cox 回歸分析CRC 患者術(shù)后生存期的影響因素Cox 回歸模型多因素分析CRC 組術(shù)后生存期的影響因素，結(jié)果顯示腫瘤分化程度、TNM 分期、術(shù)前血清miR-497 表達量、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移均是影響本組患者預后的獨立危險因素（P＜0.05），見表4。

3 討論

研究證實，作為腫瘤抑制因子的miR-497 能夠調(diào)控腫瘤細胞分化、增殖、凋亡、上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和血管生成，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［8-14］；miR-497 可通過分泌進入血液循環(huán)，血清中miR-497 表達穩(wěn)定且不易降解，故其被認為是新的潛在腫瘤生物標志物，可用于腫瘤的非侵入性診斷和監(jiān)測復發(fā)、評價預后［6，8］。

新生血管的生成在實體腫瘤CRC 的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用；新生血管不僅供給腫瘤快速生長所需的充足養(yǎng)份，而且成為其轉(zhuǎn)移的重要通道［1-2］。越來越多研究顯示miR-497 在腫瘤血管生成中起著重要作用。RUAN 等［10］研究證實，在人骨肉瘤細胞中miR-497 通過抑制血管抑素結(jié)合蛋白基因表達的作用，來抑制腫瘤血管生成、從而抑制腫瘤細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移。QIU 等［2］研究證實VEGF-A 是miR-497 的作用靶點，后者過表達可改變VEGF-A/ERK/MMP-9 信號通路中關(guān)鍵分子的表達，從而抑制CRC 血管生成、侵襲與轉(zhuǎn)移。WU 等［16］研究顯示過表達的miR-497 可減少VEGF和HIF-1α 蛋白水平，發(fā)揮抑制腫瘤生長和減少血管生成的作用。TU 等［1］研究亦顯示，過表達的miR-497 通過Raf/MEK/ERK 信號通路，抑制VEGFR2 的激活，從而起到抑制腫瘤血管生成和腫瘤生長的作用。

本研究結(jié)果顯示CRC 組血清miR-497 表達量顯著低于正常對照組，這表明血清miR-497 低表達量與CRC 發(fā)生相關(guān)，與ZOU 等［8］研究相同。腫瘤微血管密度（microvessel density，MVD）是衡量血管生成活躍程度的定量指標；采用免疫祖化方法以血管內(nèi)皮細胞標志性分子CD34 標記微血管，可計數(shù)MVD 值，反映血管生成狀態(tài)［1］。本研究顯示CRC 癌組織中MVD 值顯著高于正常對照組，表明CRC 癌組織新生血管生成能力明顯增加，這會促進CRC 的侵襲與轉(zhuǎn)移。VEGF 和Ang-2 在血管生成過程中起著中樞協(xié)同作用，均可刺激血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移、誘導新生血管的生成［1-2］。本研究顯示血清VEGF、Ang-2 含量均顯著高于正常對照組，且均與MVD 呈正相關(guān)，表明VEGF、Ang-2 發(fā)揮促進CRC 腫瘤新生血管生成的作用。本研究還顯示CRC 組血清miR-497 表達量下降，且與血清VEGF、Ang-2 含量、癌組織MVD 均呈負相關(guān)，這表明miR-497 表達下調(diào)發(fā)揮了促進VEGF、Ang-2 表達，從而促進腫瘤血管生成的作用，進而促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，這與ZOU 等［3］研究結(jié)果相似。

表3 CRC 組術(shù)前血清miR-497 表達量與腫瘤臨床病理特征及預后的關(guān)系Tab.3 Relationship between the preoperation miR-497 expression levels in serum and clinicpathological features and prognosis in the CRC group ±s

表3 CRC 組術(shù)前血清miR-497 表達量與腫瘤臨床病理特征及預后的關(guān)系Tab.3 Relationship between the preoperation miR-497 expression levels in serum and clinicpathological features and prognosis in the CRC group ±s

注：結(jié)直腸多發(fā)腫瘤時，其腫瘤最大徑為各腫瘤最大徑之和

分組年齡(歲)＜60≥60性別男女腫瘤分化程度高、中分化低、未分化腫瘤最大徑(cm)＜5≥5腫瘤部位結(jié)腸直腸TNM 分期Ⅰ+ⅡⅢ+Ⅳ淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有無遠處轉(zhuǎn)移有無術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移有無術(shù)后生存期（年）＜3≥3例數(shù)30 63 52 41 38 55 66 27 61 32 23 70 51 42 11 82 24 69 23 70 miR-497 表達量（2-△△Ct）2.83±1.05 3.21±1.36 2.94±1.16 3.19±1.38 3.51±1.32 2.68±1.53 3.22±1.35 2.80±1.48 2.88±1.28 3.16±1.30 3.56±1.31 2.62±1.50 2.58±1.57 3.59±1.40 2.04±1.63 3.31±1.55 2.21±1.58 3.28±1.43 2.17±1.61 3.35±1.52 t 值1.343 0.962 2.984 1.485 1.078 3.235 3.016 3.528 2.970 3.364 P 值＞0.05＞0.05＜0.01＜0.05＞0.05＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

表4 多因素Cox 回歸分析結(jié)直腸癌術(shù)后生存期的影響因素Tab.4 Cox multivariate regression analysis of postoperative survival in the CRC group

近年研究顯示，miR-497 與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及預后密切相關(guān)。在前列腺癌、宮頸癌、人神經(jīng)膠細胞瘤中高表達的miR-497 發(fā)揮抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移侵襲的作用，而表達下調(diào)的miR-497 則起著促進侵襲轉(zhuǎn)移的作用［17-19］；ZHANG 等［20］及QIU 等［2］在CRC研究中也得到同樣的結(jié)論。FENG 等［15］通過Meta分析發(fā)現(xiàn)miR-497 可能是多種不同類型腫瘤的預后評價因子。ZOU 等［8］研究亦發(fā)現(xiàn)血清miR-497有望成為CRC 診斷和預后評價的腫瘤標志物。本研究結(jié)果顯示CRC 組術(shù)前血清miR-497 表達量與CRC 分化程度、TNM 分期、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及是否遠處轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，與術(shù)后復發(fā)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，與生存期長短呈正相關(guān)，這表明血清miR-497 表達量越低，CRC 惡性程度越高，TNM 分期越晚，更易出現(xiàn)侵襲轉(zhuǎn)移，術(shù)后復發(fā)率越高、生存期越短；Cox 回歸模型多因素分析顯示術(shù)前血清miR-497 表達量是影響CRC 預后的獨立危險因素。

綜上，血清miR-497 表達量降低可促進CRC 新生血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移，與CRC 不良預后相關(guān)；術(shù)前血清miR-497表達量可成為CRC預后評價指標。