小麥莖基腐病病原假禾谷鐮刀菌與赤霉病之間的關(guān)系

江 航，祁 凱，馬立國(guó)，張 博，張悅麗，馬國(guó)蘋，齊軍山

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/山東省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100)

小麥莖基腐病(Fusarium crown rot，F(xiàn)CR)廣泛發(fā)生于干旱與半干旱小麥種植區(qū)。該病害最早發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)50年代的澳大利亞，之后相繼在美國(guó)、新西蘭、加拿大、阿根廷等國(guó)家被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[1-4]。小麥莖基腐病是由禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、假禾谷鐮刀菌(Fusariumpseudograminearum)、黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)等多種鐮刀菌復(fù)合侵染引起的一種土傳病害，在小麥整個(gè)生育期均可發(fā)生[5]。發(fā)病時(shí)，發(fā)病小麥莖基部逐漸變褐，濕度大時(shí)，在發(fā)病部位可見(jiàn)粉紅色霉層，嚴(yán)重時(shí)可引起小麥死亡，形成白穗[6]。小麥莖基腐病不僅嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量，其病原菌產(chǎn)生的真菌毒素還能夠影響小麥品質(zhì)[7]。由于秸稈還田導(dǎo)致病原菌在土壤中積累，加之主栽品種普遍感病[8-9]，小麥莖基腐病在黃淮地區(qū)快速蔓延，已經(jīng)成為小麥生產(chǎn)中潛在的重要病害，嚴(yán)重威脅中國(guó)的糧食安全。

2012年，中國(guó)首次報(bào)道由假禾谷鐮刀菌引起的小麥莖基腐病[10]。此后，在山東、河南、河北、陜西、甘肅、寧夏、新疆等大部分地區(qū)，發(fā)現(xiàn)假禾谷鐮刀菌是這些地區(qū)小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌[11-14]。假禾谷鐮刀菌不僅導(dǎo)致小麥莖基腐病，還能夠引起小麥赤霉病，但相關(guān)報(bào)道較少。2013年，在河北省發(fā)現(xiàn)假禾谷鐮刀菌可引起小麥赤霉病[15-16]。小麥赤霉病不僅造成小麥減產(chǎn)，其病原菌還能夠合成危害人畜健康的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)等毒素[7]。然而由假禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病在黃淮麥區(qū)的研究較少，需要進(jìn)一步的研究來(lái)明確兩者之間的關(guān)系。

小麥莖基腐病和赤霉病都是小麥生產(chǎn)上的重要病害。其中小麥莖基腐病已成為黃淮地區(qū)小麥生產(chǎn)上最主要的病害，其優(yōu)勢(shì)病原假禾谷鐮刀菌與小麥赤霉病的關(guān)系目前仍不清楚。本研究于2021年春從山東省小麥莖基腐病發(fā)生嚴(yán)重的田塊采集病株，對(duì)病株上分離到的菌株進(jìn)行鑒定，并測(cè)定這些菌株在小麥莖基部和小麥穗部的致病力；于小麥成熟期，在相同田塊采集小麥赤霉病病株，對(duì)病穗進(jìn)行組織分離并鑒定，以期明確假禾谷鐮刀菌與小麥赤霉病之間的關(guān)系，為預(yù)防假禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 小麥發(fā)病樣品采集

本試驗(yàn)所有小麥病株和病穗分別于2021年3月和6月采自山東省濟(jì)南市商河縣許商街道五里廟村，小麥品種為濟(jì)麥22。

1.2 發(fā)病組織真菌的分離純化

采用組織分離法對(duì)小麥苗期根部、莖基部和葉鞘以及小麥成株期穗部的真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。具體操作：將發(fā)病部位用自來(lái)水清洗干凈，在無(wú)菌環(huán)境中分別將根部、莖基部、葉鞘以及病穗組織放入70%的乙醇中消毒30 s，隨后轉(zhuǎn)入3%的NaClO溶液中消毒90 s，再用無(wú)菌水洗滌3遍。將消毒后的根部、莖基部、葉鞘以及小麥穗部分別轉(zhuǎn)接至提前倒好的PDA培養(yǎng)基中，置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。將長(zhǎng)出的真菌純化培養(yǎng)并進(jìn)行單孢分離，菌株純化后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 分離菌株鑒定

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)兩種方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定：將分離到的所有菌株分別轉(zhuǎn)接至PDA平板中，待菌落長(zhǎng)大后，根據(jù)菌落的形態(tài)對(duì)所有菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。分子生物學(xué)鑒定：用牙簽分別刮取不同菌株在PDA培養(yǎng)基上的菌絲，利用CTAB法分別提取不同菌株的基因組DNA，用引物ITS1/4[17]分別擴(kuò)增所有菌株的ITS序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行Blast比對(duì)分析。另外以提取的不同菌株的基因組DNA為模板，分別用禾谷鐮刀菌特異性引物Fg16NF/R[18]、假禾谷鐮刀菌特異性引物Fp1-1/2[19]和麥根腐平臍孺孢特異性引物COSE-F/R[20](表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增條帶的有無(wú)和大小進(jìn)行菌株鑒定。本研究中所有的PCR產(chǎn)物均用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)。

表1 本研究中使用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 病原菌對(duì)小麥莖基部致病力測(cè)定

取適量小麥種子(品種為濟(jì)麥22)，用3%的NaClO溶液進(jìn)行表面消毒，用無(wú)菌水沖洗3遍，然后置于鋪有3層無(wú)菌濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中催芽3 d，催芽期間，每隔12 h用無(wú)菌水沖洗小麥種子。將待測(cè)菌株在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)3 d，然后用5 mm打孔器在菌落邊緣打菌餅。借鑒套菌碟的方法測(cè)定不同菌株對(duì)小麥莖基部的致病力[21]，并對(duì)方法進(jìn)行部分改進(jìn)。具體方法：將菌餅貼在胚芽基部，然后用無(wú)菌紗布將菌餅與催芽3 d的胚芽卷起來(lái)，使菌餅緊貼胚芽，每塊紗布卷10株小麥胚芽，每個(gè)菌株重復(fù)3次，將處理后的胚芽置于鋪有3層濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，以未接菌的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。然后置于25 ℃的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(12 h黑暗，12 h光照)，培養(yǎng)期間，每天給培養(yǎng)皿中補(bǔ)充無(wú)菌水，7 d后調(diào)查發(fā)病情況并拍照。

1.5 病原菌對(duì)小麥穗部致病力測(cè)定

用牙簽挖取在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3 d的待測(cè)菌株的菌塊，移至CMC(羧甲基纖維素鈉)培養(yǎng)基中，置于25 ℃，175 rpm的搖床中培養(yǎng) 5 d，將分生孢子的濃度調(diào)為1×105個(gè)·mL-1(對(duì)于不產(chǎn)孢的菌株，用菌絲接種)。選取揚(yáng)花期的小麥穗(品種為濟(jì)麥22)，然后將10 μL的孢子懸浮液接種于小麥穗中部偏下的小穗中，分別在小麥穗部和保鮮袋中噴水，將保鮮袋套在小麥穗上保濕2 d，每個(gè)菌株接種8個(gè)小麥穗，14 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況并拍照。

2 結(jié)果

2.1 小麥莖基部病菌的分離

2021年3月，山東省濟(jì)南市商河縣五里廟村小麥苗長(zhǎng)勢(shì)整體較弱，部分小麥還出現(xiàn)了死苗的現(xiàn)象，經(jīng)初步判斷為該地區(qū)暴發(fā)了小麥莖基腐病，隨后在該發(fā)病嚴(yán)重的田塊采集小麥病株，并對(duì)發(fā)病小麥根部、莖基部和葉鞘處進(jìn)行組織分離和病原菌鑒定，結(jié)果共分離到21種真菌(表2)。

表2 小麥病株莖基部分離的菌株Table 2 Strains isolated from diseased wheat stem base

2.2 分離菌株的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

將分離到的菌株在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，可以看到，菌株CAJA211(C01)、CAJA215(C05)和CAJA218(C08)在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)迅速，菌絲稠密，顏色呈白色或黃色，在培養(yǎng)基中易產(chǎn)生紅色的色素(圖1)；菌株CAJA212(C02)、CAJA213(C03)、CAJA214(C04)、CAJA216(C06)、CAJA217(C07)、CAJA21A(C10)、CAJA21B(C11)、CAJA21C(C12)、CAJA21D(C13)、CAJA21G(C16)、CAJA21H(C17)、CAJA21J(C18)、CAJA21L(C20)和CAJA21M(C21)在PDA培養(yǎng)基上也生長(zhǎng)迅速，氣生菌絲稠密，呈絨毛狀，充滿整個(gè)培養(yǎng)皿，顏色呈白色，在培養(yǎng)基中形成粉紅色或紅色的色素(圖1)；菌株CAJA219(C09)、CAJA21F(C15)和CAJA21K(C19)的氣生菌絲較少，菌落顏色呈深灰色，菌落邊緣具有輪紋(圖1)；菌株CAJA21E(C14)的氣生菌絲稀疏，顏色呈白色，在培養(yǎng)基中形成黃色的色素。根據(jù)菌株的形態(tài)特征，初步將菌株C01、C05和C08鑒定為禾谷鐮刀菌(F.graminearum)，菌株C02、C03、C04、C06、C07、C10、C11、C12、C13、C16、C17、C18、C20和C21鑒定為假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum)，菌株C09、C15和C19鑒定為麥根腐平臍蠕孢(Bipolarissorokiniana)。

2.3 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

對(duì)所有菌株的ITS序列分別進(jìn)行Blast比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)菌株C01、C05和C08的ITS序列與禾谷鐮刀菌的ITS序列相似度最高；菌株C02、C03、C04、C06、C07、C10、C11、C12、C13、C16、C17、C18、C20和C21的ITS序列與假禾谷鐮刀菌的ITS序列相似度最高；菌株C09、C15和C19的ITS序列與麥根腐平臍蠕孢的ITS序列相似度最高；菌株C14的ITS序列與多生枝鼻菌(Cladorrhinumfoecundissimum)的ITS序列相似度最高(圖2A)。禾谷鐮刀菌特異性引物、假禾谷鐮刀菌特異性引物和麥根腐平臍孺孢特異性引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，菌株C01、C05和C08為禾谷鐮刀菌(圖2B)，菌株C02、C03、C04、C06、C07、C10、C11、C12、C13、C16、C17、C18、C20和C21為假禾谷鐮刀菌(圖2C)，菌株C09、C15和C19為麥根腐平臍蠕孢(圖2D)。其中，假禾谷鐮刀菌占比66.67%，禾谷鐮刀菌和麥根腐平臍蠕孢均占 14.29%。

A：ITS引物的PCR結(jié)果；B：禾谷鐮刀菌特異性引物的PCR結(jié)果；C：假禾谷鐮刀菌特異性引物的PCR結(jié)果；D：麥根腐平臍蠕孢特異性引物的PCR結(jié)果。M代表DL2000，1～21分別代表菌株C01～C21(對(duì)應(yīng)的菌株見(jiàn)表2)，CK代表陽(yáng)性對(duì)照(H2O)。

2.4 分離菌株對(duì)小麥莖基部的致病性

選取禾谷鐮刀菌菌株C01、C05和C08以及部分假禾谷鐮刀菌菌株C03、C04、C06、C10、C11、C13、C16、C17、C20和C21共13種菌株，測(cè)定其在小麥苗期對(duì)小麥莖基部的致病力。結(jié)果表明，選取的所有菌株都能引起嚴(yán)重的小麥莖基腐病癥狀，在莖基部出現(xiàn)了變褐、腐爛的現(xiàn)象，而對(duì)照小麥莖基部無(wú)此現(xiàn)象出現(xiàn)(圖3)。

CK：未接菌。 CK：Uninoculated.

2.5 分離菌株對(duì)小麥穗部的致病性

利用2.4的13個(gè)菌株，測(cè)定其對(duì)小麥穗部的致病力，結(jié)果表明，所有菌株均能引起典型的小麥赤霉病癥狀(圖4A)。對(duì)小麥穗部接種點(diǎn)進(jìn)行組織分離和病原菌鑒定，利用禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌特異性引物對(duì)重新分離到的真菌分別進(jìn)行PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)在小麥穗部分離到了與接種時(shí)相對(duì)應(yīng)的菌株(即接種假禾谷鐮刀菌的麥穗分離到的是假禾谷鐮刀菌，接種禾谷鐮刀菌的麥穗分離到的是禾谷鐮刀菌)(圖4B)。

A：小麥穗部接種禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌后的癥狀，CK代表接種無(wú)菌水；B：禾谷鐮刀菌特異性引物(左)和假禾谷鐮刀菌特異性引物(右)對(duì)發(fā)病穗部分離到的菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果，M代表DL2000，1～13分別代表菌株C01、C03、C04、C05、C06、C08、C10、C11、C13、C16、C17、C20和C21(對(duì)應(yīng)的菌株見(jiàn)表2)，CK代表陰性對(duì)照(H2O)。

表3 玉米秸稈和小麥病株穗部分離的菌株Table 3 Strains isolated from corn straw and diseased wheat heads

2.6 玉米秸稈上子囊殼的鑒定

2021年3月，在小麥莖基腐病重病田塊，發(fā)現(xiàn)部分還田的玉米秸稈上存在一些真菌的子囊殼(圖5A)，挑取這些子囊殼并將其壓開鏡檢，發(fā)現(xiàn)其中的子囊孢子尚未成熟(圖5B)，無(wú)法直接鑒定。將壓開子囊殼的水溶液涂布于PDA培養(yǎng)基上，次日挑選單菌落進(jìn)行培養(yǎng)并鑒定，發(fā)現(xiàn)從子囊殼水溶液中分離出的菌株P(guān)MAJ211(P01)和PMAJ212(P02)分別與禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌的形態(tài)相似(圖5C)；用禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌特異性引物進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)01是禾谷鐮刀菌，P02是假禾谷鐮刀菌(表3和圖5D)。2021年4月底，將菌株P(guān)01和P02分別接種小麥穗部，發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)01和P02都能引起嚴(yán)重的小麥赤霉病(圖5E)。

A：玉米秸稈上子囊殼的形態(tài)特征；B：子囊殼中子囊的形態(tài)特征；C：子囊殼分離菌株在PDA培養(yǎng)基上的表型，P01和P02對(duì)應(yīng)的菌株見(jiàn)表3；D：禾谷鐮刀菌特異性引物(左)和假禾谷鐮刀菌特異性引物(右)對(duì)子囊殼分離菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果，1和2分別代表菌株P(guān)01和P02，CK代表陰性對(duì)照(H2O)；E：小麥穗部接種子囊殼分離菌株的癥狀。

2.7 小麥赤霉病病原的分離鑒定

2021年6月于小麥成熟期，在同一地塊采集自然發(fā)生的小麥赤霉病病穗進(jìn)行組織分離和病原菌鑒定，得到HAJ211(H01)～HAJ219(H09)、HAJ21A(H10)、HAJ21B(H11)和HAJ21C(H12)共12種菌株(表3)，分別對(duì)這12種菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)(圖6A)和分子生物學(xué)鑒定(圖6B)，發(fā)現(xiàn)菌株H06和H08為假禾谷鐮刀菌，占 16.67%，其余10株為禾谷鐮刀菌，占83.33%。說(shuō)明在小麥莖基腐病重病田塊，能夠從發(fā)病的小麥穗部分離到假禾谷鐮刀菌，但假禾谷鐮刀菌的占比較低。

A：小麥赤霉病分離菌株在PDA培養(yǎng)基中的表型，H01～H12對(duì)應(yīng)的菌株見(jiàn)表3；B：禾谷鐮刀菌特異性引物(左)和假禾谷鐮刀菌特異性引物(右)對(duì)分離菌株的PCR檢測(cè)結(jié)果，M代表DL2000，1～12分別代表菌株H01～H12，CK代表陰性對(duì)照(H2O)。

3 討 論

在中國(guó)，假禾谷鐮刀菌是目前小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌。據(jù)報(bào)道，2009-2013年，在江蘇、安徽、河南和河北省小麥種植區(qū)，小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌是亞洲鐮刀菌(Fusariumasiaticum)，山東省是禾谷鐮刀菌[22-23]。2013-2016年，在河南、河北和山西省南部地區(qū)，小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌是假禾谷鐮刀菌；在山東和陜西中部地區(qū)，禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌所占的比例相當(dāng)；在江蘇北部和安徽北部地區(qū)，禾谷鐮刀菌是小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌[24-26]。本課題組在2016-2019年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，山東省小麥莖基腐病的優(yōu)勢(shì)病原菌是假禾谷鐮刀菌。這說(shuō)明引起中國(guó)黃淮地區(qū)小麥莖基腐病的假禾谷鐮刀菌所占的比例在不斷升高，已逐漸成為小麥莖基腐病最主要的病原菌。

目前，由假禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病只在河北省報(bào)道過(guò)[15-16]。本研究在山東省也發(fā)現(xiàn)了由假禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病，推測(cè)假禾谷鐮刀菌可能正在從侵染小麥莖基部擴(kuò)展為侵染小麥穗部。假禾谷鐮刀菌未能成為小麥赤霉病的優(yōu)勢(shì)病原菌，推測(cè)可能存在以下幾個(gè)因素：第一，子囊孢子是小麥赤霉病的主要初侵染源，禾谷鐮刀菌是同宗配合子囊菌，而假禾谷鐮刀菌是異宗配合子囊菌，在田間兩個(gè)交配型的菌株數(shù)量可能差別較大，難以配對(duì)形成子囊殼；第二，假禾谷鐮刀菌子囊殼在田間的成熟時(shí)間與小麥揚(yáng)花期錯(cuò)開，只有少數(shù)子囊殼在小麥揚(yáng)花期成熟并噴發(fā)；第三，田間環(huán)境條件(溫度、濕度、光照等)不利于假禾谷鐮刀菌形成大量子囊殼。由于黃淮地區(qū)小麥莖基腐病不斷加重，其優(yōu)勢(shì)病原菌假禾谷鐮刀菌在土壤中的含量逐漸積累，一旦遇到田間環(huán)境條件的改變以及假禾谷鐮刀菌兩個(gè)交配型菌株的均勻分布，形成利于假禾谷鐮刀菌侵染小麥穗部的條件，在小麥莖基腐病嚴(yán)重的地區(qū)可能會(huì)發(fā)生由假禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病，需要注意檢測(cè)。

研究發(fā)現(xiàn)，小麥莖基腐病的發(fā)生不會(huì)在小麥穗部積累過(guò)多的毒素，但小麥植株中積累的毒素會(huì)對(duì)人類及以小麥秸稈為食的動(dòng)物造成威脅[27]；同時(shí)，攜帶病原菌的小麥秸稈還田能夠增加土壤中病原菌的含量。目前尚未見(jiàn)到假禾谷鐮刀菌能夠侵染玉米的報(bào)道，但本研究發(fā)現(xiàn)在玉米秸稈上存在禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌的子囊殼，并從中分離出假禾谷鐮刀菌，推測(cè)可能是玉米收獲后在秸稈上腐生的，更多關(guān)于假禾谷鐮刀菌在玉米上定植的現(xiàn)象需要進(jìn)一步的田間觀察才能確定。秸稈還田耕作制度的推廣增加了田間土傳病害病原菌的累積，加重了小麥莖基腐病的發(fā)生[28]，這可能是小麥莖基腐病近年來(lái)突然暴發(fā)的重要原因。本研究調(diào)查結(jié)果進(jìn)一步證明了假禾谷鐮孢菌不僅可以導(dǎo)致小麥莖基腐病，還可以導(dǎo)致小麥赤霉病，從而增加了對(duì)小麥生產(chǎn)的威脅。