草坪草外源功能基因轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展

張婷婷，陳靜波

(1.江蘇山水建設(shè)集團(tuán)有限公司,江蘇 句容 212400；2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所,江蘇 南京 210014)

隨著基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了一場(chǎng)新的革命。草坪草作為一類重要的運(yùn)動(dòng)場(chǎng)和綠化用的植物[1]，在世界范圍內(nèi)有了廣泛的使用和研究，尤其在歐美發(fā)達(dá)國家[2]。旱、鹽、寒、熱等環(huán)境脅迫及病蟲草等生物脅迫的加劇，增加了栽培管理成本以及由此帶來的環(huán)境破壞。在強(qiáng)調(diào)生態(tài)、低碳的背景下，抗逆、優(yōu)質(zhì)、低養(yǎng)護(hù)草坪的新品種選育顯得越來越重要[3]。草坪草分子生物學(xué)研究已有很大發(fā)展[4]，尤其是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，為選育出低養(yǎng)護(hù)的草坪草新品種提供了一條的新途徑。關(guān)于草坪草的再生體系、轉(zhuǎn)化方法等已有詳細(xì)的總結(jié)報(bào)道[5-9]，本研究主要從近年來轉(zhuǎn)入的外源功能基因角度來討論草坪草的轉(zhuǎn)基因問題。

1 草坪草上已經(jīng)轉(zhuǎn)入的外源功能基因

轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在許多草坪草上得到了應(yīng)用，并獲得了轉(zhuǎn)入外源基因的植株。根據(jù)轉(zhuǎn)入基因的功能，主要分為以下幾類。

1.1抗除草劑基因(bar基因) 草坪雜草的防除較耗人力、物力。人工防除雖然環(huán)境友好，但費(fèi)工費(fèi)時(shí)，成本很高；除草劑防治容易污染環(huán)境，而且許多雜草與草坪草同科甚至同屬，很難用除草劑防治，并且容易對(duì)草坪草產(chǎn)生毒害。選育抗除草劑的草坪草品種，然后使用廣譜除草劑，可以殺死草坪上所有的雜草，達(dá)到快速簡(jiǎn)捷除草的目的。草丁膦屬于有機(jī)磷類的非選擇性廣譜除草劑，具有強(qiáng)烈抑制細(xì)菌和植物的氨基酸生物合成酶——谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)的作用。GS在植物氨同化及氨代謝調(diào)節(jié)中起重要作用，抑制其活性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨的含量迅速積累，產(chǎn)生氨毒害，引起植物死亡。bar基因的作用是使草丁膦的自由氨基乙?；瘡亩鴮?duì)其解毒，使之不能抑制GS的活性。因此，含有該基因的植物對(duì)草丁膦具有抗性。bar基因是草坪草上早期轉(zhuǎn)入最多的一類基因，主要作為選擇標(biāo)記基因應(yīng)用，后期才逐漸用于生產(chǎn)抗除草劑方面，這也是目前草坪草上轉(zhuǎn)化最多的一個(gè)基因，已經(jīng)在高羊茅(Festucaarundinacea)[10-14]、草地早熟禾(Poapratensis)[15-16]、多年生黑麥草草(Loliumperenne)[17-19]、匍匐剪股穎(Agrostisstolonifera)[20-24]、雜交狗牙根(Cynodondactylon×C.transvaalensis)[25-26]、結(jié)縷草(Zoysiajaponica)[27-29]、巴哈雀稗(Paspalumnotatum)[30-32]等多種草坪草上得到轉(zhuǎn)Bar基因的植株。

1.2抗病基因 病害是草坪草上另一個(gè)主要的生物脅迫問題，尤其在冷季型草坪草上。草坪草的病害有很多種，不同病害一般由不同病原侵染導(dǎo)致，因此轉(zhuǎn)入草坪草的抗病基因也多種多樣。將抗真菌病的幾丁質(zhì)酶基因(Chi)和β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu)轉(zhuǎn)入高羊茅，轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)出較好的抗禾谷鐮刀菌病害[33]；轉(zhuǎn)入苜蓿(Medicagosativa)的AGLU1基因和青蛙(Phyllomedusasauvagei)表皮的SI基因均能使高羊茅抗灰色葉斑病和褐斑病，而轉(zhuǎn)入水稻(Oryzasativa)的Pi9基因僅能抗褐斑病[34]。轉(zhuǎn)入葡萄糖氧化酶(GO)基因后，草地早熟禾轉(zhuǎn)基因植株可以不同程度地抗褐斑病[35]。Chi基因的轉(zhuǎn)入，獲得了抗冠銹病的多花黑麥草(L.multiflorum)轉(zhuǎn)基因植株[36]。分別將類似Chi基因的cDNA(hs2)[37]和Chi基因[38]轉(zhuǎn)入匍匐剪股穎，獲得的轉(zhuǎn)基因植株可以分別抗褐斑病和幣斑病。把水稻tlpD34基因轉(zhuǎn)入匍匐剪股穎，轉(zhuǎn)基因植株的抗幣斑病能力提高[39]。用美洲商陸(Phytolaccaamericana)的抗病蛋白基因(PAP)轉(zhuǎn)化匍匐剪股穎，也證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)幣斑病具有一定的抗性[40]。Guo等[41]用擬南芥(Arabidopsisthaliana)的病原相關(guān)蛋白的同源片段PR5K轉(zhuǎn)化匍匐剪股穎，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株接種幣斑病菌，發(fā)現(xiàn)其感染日期要比野生型延后29～45 d。病毒病是一類幾乎無法用農(nóng)藥防治的病害，Xu等[42]開展的RNA介導(dǎo)的病毒抗性，把不可翻譯的多年生黑麥草花葉病毒(RgMV)的外殼蛋白基因轉(zhuǎn)入多年生黑麥草內(nèi)，提高了其抗RgMV的能力。由于暖季型草坪草的抗病性較強(qiáng)，有關(guān)病害的研究較少，目前鮮見暖季型草坪草轉(zhuǎn)抗病基因的報(bào)道。

1.3抗蟲基因 (Bt基因) 草坪草上蟲害的發(fā)生比病害輕，這方面的研究相對(duì)較少，目前轉(zhuǎn)入草坪草的抗蟲基因主要為Bt基因。佘建明等[43]把Bt基因轉(zhuǎn)入草地早熟禾，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因植株(T0代)采用室內(nèi)人工飼喂棉鈴蟲的方法進(jìn)行抗蟲性鑒定，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性比野生型有很大提高，對(duì)1～2齡棉鈴蟲均具有抗性，其中用轉(zhuǎn)基因植株6號(hào)飼喂的棉鈴蟲幼蟲校正死亡率超過70%。匍匐剪股穎[44]和結(jié)縷草[45]也獲得了轉(zhuǎn)抗蟲基因的植株，但未做抗蟲性鑒定，其中結(jié)縷草上的研究認(rèn)為，其T1代植株抗蟲基因的分離符合孟德爾遺傳規(guī)律。

1.4抗旱基因 由于全球氣候變暖，水資源短缺，旱災(zāi)頻發(fā)，而草坪草要取得較高的坪用質(zhì)量，通常需消耗大量水。因此，選育抗旱節(jié)水的草坪草品種是草坪草育種的主要目標(biāo)。轉(zhuǎn)入草坪草的抗旱基因主要有以下幾大類：第1類是與抗逆相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子，屬于AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族，這類轉(zhuǎn)錄因子可激活多種抗逆基因，增強(qiáng)植株對(duì)多種逆境(旱、鹽和寒等)的抗性[46]。吳關(guān)庭等[47]和Zhao等[48]分別把來自擬南芥的CBF1和DREB1A/CBF3基因轉(zhuǎn)入到高羊茅中，獲得了抗旱性增加的轉(zhuǎn)基因植株，其中Zhao等[48]研究表明，在T1后代，外源基因可穩(wěn)定地遺傳表達(dá)，且轉(zhuǎn)基因植株可提高P5CS2基因的表達(dá)水平，促進(jìn)脯氨酸合成。信金娜等[49]和韓烈保等[50]將DREB1A基因轉(zhuǎn)入草地早熟禾，但無抗性鑒定結(jié)果。楊鳳萍等將CBF1基因[51]和DREB1B基因[52]分別轉(zhuǎn)入多年生黑麥草，獲得了脯氨酸含量增加、抗旱性顯著提高的轉(zhuǎn)基因植株。張磊等[53]把ABP9基因轉(zhuǎn)入多年生黑麥草，獲得了抗旱性增強(qiáng)的植株。把擬南芥的ABF3基因轉(zhuǎn)入蒙古剪股穎(A.mongolica)，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株比野生型具有更低的氣孔開度、更高的葉片含水量和存活率[54]。把抗旱植物野大麥(Hordeumspontaneum)的HsDREB1A基因轉(zhuǎn)入巴哈雀稗，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株存活率提高[55]。王渭霞等[56]和齊春輝等[57]也分別把CBF1基因和DREB1A基因轉(zhuǎn)入結(jié)縷草，但未做抗性鑒定。第2類是編碼滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成關(guān)鍵酶的基因，如脯氨酸合成的關(guān)鍵酶△-吡咯啉-5-羧酸合成酶的基因P5C5，已經(jīng)在高羊茅[58]和黑麥草[18]上得到轉(zhuǎn)化植株，并在高羊茅上證明正常生長(zhǎng)條件下轉(zhuǎn)基因植株的脯氨酸含量比野生型高31%～83%，干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株萎蔫比野生型晚[58]；海藻糖合成的關(guān)鍵基因海藻糖合酶的基因，已經(jīng)轉(zhuǎn)化到高羊茅[59]和多年生黑麥草[60]；果聚糖合成關(guān)鍵酶基因果聚糖-1-果糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Ac1-FFT)轉(zhuǎn)化到多年生黑麥草[61]；甜菜堿合成的關(guān)鍵基因膽堿單氧化物酶和甜菜堿醛脫氫酶的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)化到早熟禾[49]；胚胎晚期發(fā)育蛋白(LEA)合成的基因HVA1已經(jīng)轉(zhuǎn)化到匍匐剪股穎[62]，均獲得了抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植株。第3類是與激素合成有關(guān)的基因，如脫落酸(ABA)合成關(guān)鍵基因VuNCED1，轉(zhuǎn)入到匍匐剪股穎，干旱脅迫下ABA含量劇烈增加，存活率提高[63]。另一個(gè)關(guān)鍵的基因是細(xì)胞分裂素合成有關(guān)的基因(如異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因，ipt)。由于冷季型草坪草在夏季高溫干旱雙重脅迫下，內(nèi)源細(xì)胞分裂素合成受到抑制，植株容易衰老而死亡。通過轉(zhuǎn)入細(xì)胞分裂素合成有關(guān)的ipt基因，能提高內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量，從而提高植株的抗旱性。目前已經(jīng)把ipt基因轉(zhuǎn)入到匍匐剪股穎上，提高其在干旱脅迫下水分使用能力和根系活性，進(jìn)而提高抗旱性[64]。

1.5抗鹽基因 鹽堿地的開發(fā)、冬季融雪鹽的使用、含鹽的非飲用水在草坪灌溉中的使用，均要求選育和使用抗鹽性強(qiáng)的草坪草品種。鹽脅迫使草坪草產(chǎn)生離子脅迫和滲透脅迫，因此，轉(zhuǎn)化的基因主要是與離子調(diào)節(jié)和滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的基因，以及前面抗旱部分講述的跟多種抗逆有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。離子調(diào)節(jié)的基因主要是Na+/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其作用是把鹽離子隔離在液泡中，已經(jīng)在高羊茅[65-67]和多年生黑麥草[68]上得到抗鹽性提高的轉(zhuǎn)化植株，并在高羊茅上證明，外源抗鹽基因能夠在T1和T2代穩(wěn)定遺傳[67]；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)甜菜堿合成有關(guān)的酶已經(jīng)轉(zhuǎn)化到早熟禾[49]和多年生黑麥草[69]上，并獲得了抗鹽性提高的多年生黑麥草轉(zhuǎn)基因植株；與抗逆有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子類的基因轉(zhuǎn)化到高羊茅[53]、匍匐剪股穎[70]、早熟禾[49]、結(jié)縷草[56]上，獲得了抗鹽性提高的轉(zhuǎn)基因高羊茅和匍匐剪股穎植株。

1.6延長(zhǎng)草坪綠期(包括抗寒和抗熱)的基因 綠期是草坪質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，由于暖季型草坪草冬季枯黃和冷季型草坪草夏季枯黃甚至死亡，絕大多數(shù)草坪草無法做到單個(gè)草種四季常綠(除了一些熱帶地區(qū))，因此，提高暖季型草坪草的抗寒性和冷季型草坪草的抗熱性，在延長(zhǎng)這兩類草坪草的綠期上具有重要作用。目前轉(zhuǎn)入到草坪草上能夠提高抗極端溫度、延長(zhǎng)綠期的基因主要有下面幾類：第1類是與抗逆相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子類基因，已轉(zhuǎn)化到高羊茅[47]、匍匐剪股穎[54]、結(jié)縷草[56]和中華結(jié)縷草(Z.sinica)[71]等草坪草上，獲得了抗寒性或抗熱性提高的高羊茅、匍匐剪股穎和中華結(jié)縷草植株；第2類是與細(xì)胞分裂素合成有關(guān)的基因(如異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因ipt)，因?yàn)榧?xì)胞分裂素是一種能延緩衰老的基因，已轉(zhuǎn)到高羊茅[72]、匍匐剪股穎[73]和中華結(jié)縷草[74]，分別獲得了高羊茅抗寒性和匍匐剪股穎抗熱性提高以及中華結(jié)縷草綠期延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株；第3類是與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，因?yàn)榈蜏叵绿岣邼B透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，能夠增加細(xì)胞汁濃度，降低冰點(diǎn)，從而提高植物抗寒性，目前已在多年生黑麥草上轉(zhuǎn)入小麥(Triticumaestivum)的果聚糖轉(zhuǎn)移酶基因wftl和wft2，其轉(zhuǎn)基因植株積累了大量的果聚糖，提高了植株抗寒力[75]。

1.7耐重金屬的基因 植物利用螯合肽(PCs)來螯合進(jìn)入植物體內(nèi)的重金屬離子，降低重金屬活性，是植物抗重金屬毒害的一種重要機(jī)制。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GCS)是植物螯合肽合成途徑中的一個(gè)限速酶。Zhao等[76]從耐重金屬的蘆葦(Phragmitesaustralis)中克隆到的GCS基因轉(zhuǎn)入到匍匐剪股穎上，得到了GCS轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)和PC合成增加的轉(zhuǎn)基因植株，其耐Cd2+脅迫能力有很大提高。

2 問題與展望

從目前的研究來看，草坪草上轉(zhuǎn)入的外源基因主要是一些與提高抵抗生物和非生物逆境有關(guān)的基因，并獲得了一些抗性有所提高的轉(zhuǎn)基因植株。由于抗逆性通常是一個(gè)數(shù)量性狀，由多基因控制，而且不同基因?qū)μ岣呖鼓嫘缘呢暙I(xiàn)有差異，轉(zhuǎn)入單個(gè)的功能基因，通常對(duì)提高其抗逆性比較有限。進(jìn)一步深入了解不同草坪草抵抗不同逆境的內(nèi)在機(jī)理，選擇關(guān)鍵的一個(gè)或多個(gè)抗逆基因，然后轉(zhuǎn)入草坪草，可能有利于更好地提高其抗逆性。對(duì)于草坪草而言，除提高抗逆性外，還有一個(gè)重要的性狀是降低草坪草直立生長(zhǎng)的高度(即矮化)，增加草坪密度，對(duì)于有匍匐莖的草坪草則要求增加匍匐性，這樣能降低修剪高度、減少修剪頻度和草坪養(yǎng)護(hù)成本，提高草坪質(zhì)量。另一個(gè)重要的問題是草坪上大量施用化肥引起環(huán)境富營(yíng)養(yǎng)化，因此，如何提高草坪草的養(yǎng)分吸收效率，減少肥料施用和提高養(yǎng)分利用率是草坪草育種上尚未重視但很重要的一個(gè)方向。所以，轉(zhuǎn)入能夠降低草坪草高度和匍匐性的基因以及養(yǎng)分高效吸收的基因，對(duì)草坪業(yè)的發(fā)展非常重要。

草坪草轉(zhuǎn)基因研究的目的是為了解決生產(chǎn)上存在的問題，而把外源功能基因轉(zhuǎn)入草坪草體內(nèi)只是轉(zhuǎn)基因研究的第1步。就目前的研究來看，草坪草轉(zhuǎn)基因工作主要停留在把外源基因轉(zhuǎn)入各種草坪草內(nèi)，部分研究做了目標(biāo)性狀的鑒定，而多數(shù)研究缺乏或很少有轉(zhuǎn)入以后的一些工作，如外源基因在后代中的分離和遺傳穩(wěn)定性、不同世代(種子繁殖型)或不同生長(zhǎng)年限(多年生、營(yíng)養(yǎng)繁殖型)外源基因的表達(dá)狀況分析、轉(zhuǎn)基因草坪草的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等，這些是以后研究的關(guān)鍵問題。 另外，盡管轉(zhuǎn)基因草坪草能夠快速改良目標(biāo)性狀，縮短育種周期，但轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)只是一種輔助的育種手段，不能代替雜交育種等其他的傳統(tǒng)育種方法，應(yīng)該與傳統(tǒng)育種手段相結(jié)合，才有真正的生存空間。

[1]陳志明.南京地區(qū)足球場(chǎng)草坪建植技術(shù)初探[J].草業(yè)科學(xué)，2011,28(3)：372-375.

[2]劉建秀，周久亞，郭海林，等.草坪·地被植物·觀賞草[M].南京：東南大學(xué)出版社，2001:1-6.

[3]張靜,張巨明.低養(yǎng)護(hù)草坪草種研究進(jìn)展[J].草業(yè)科學(xué)，2010,27(7)：35-40.

[4]鄭軼琦，劉建秀.草坪草分子遺傳圖譜的構(gòu)建與應(yīng)用研究進(jìn)展[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2009，18(1)：155-162.

[5]郭振飛，盧少云.基因工程在草坪草育種上的應(yīng)用[J].草地學(xué)報(bào)，2002，10(3)：184-189.

[6]張俊衛(wèi),包滿珠,孫振元.草坪草的遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展[J].林業(yè)科學(xué)研究，2003，16(1)：87-94.

[7]宗俊勤，劉建秀，宣繼萍，等.草坪草植株再生體系研究進(jìn)展[J].草原與草坪，2005(4)：9-14.

[8]柴明良，王賀飛.草坪草轉(zhuǎn)基因的回顧和展望[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2006，32(3)：276-282.

[9]李雪，韓烈保，劉君.多年生黑麥草轉(zhuǎn)基因育種及其安全性的研究進(jìn)展[J].中國草地學(xué)報(bào)，2008，30(4)：93-99.

[10]Cho M J,Ha C D,Lemaux P G.Production of transgenic tall fescue and red fescue plants by particle bombardment of mature seed-derived highly regenerative tissues[J].Plant Cell Reports,2000,19:1084-1089.

[11]馬生健，曾富華，徐碧玉，等.基因槍介導(dǎo)的高羊茅基因轉(zhuǎn)化體系的建立[J].園藝學(xué)報(bào)，2004，31(5)：691-69.

[12]Hu Z H,Chen J Q,Wu G T.Highly efficient transformation and plant regeneration of tall fescue mediated byAgrobacteriumtumefaciens[J].Journal of Plant Physiology and Molecular Biology,2005,31(2):149-159.

[13]李志亮，黃叢林，王剛，等.利用基因槍法向高羊茅導(dǎo)入bar基因的研究[J].河北師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2006，30(2)：217-221.

[14]Zong J,Liu J,Huang J.Introducing bar gene intoFestucaarundinaceacv.Houndog 5 via pollen-tube pathway[J].Acta Horticulturae,2008，783:261-264.

[15]Chai B,Liang A,Wang W,etal.Agrobacterium-mediated transformation of Kentucky bluegrass[J].Acta Botanica Sinica,2003,45(8):966-973.

[16]Gao C,Jiang L,Folling M,etal.Generation of large numbers of transgenic Kentucky bluegrass (PoapratensisL.)plants following biolistic gene transfer[J].Plant Cell Reports,2006,25:19-25.

[17]張永彥，徐子勤，高麗美，等.多年生黑麥草成熟胚再生體系的建立及基因槍轉(zhuǎn)化[J].中國生物工程雜志，2005，25(3)：53-59.

[18]楊成民，王宏芝，孫振元，等.利用基因槍共轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)bar與P5CS基因黑麥草[J].草地學(xué)報(bào)，2005，13(1)：34-38.

[19]易自力，陳智勇，蔣建雄，等.多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其轉(zhuǎn)化植株的獲得[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2006，15(4)：99-103.

[20]Reichman J R,Watrud L S,Lee E H,etal.Establishment of transgenic herbicide-resistant creeping bentgrass (AgrostisstoloniferaL.)in nonagronomic habitats[J].Molecular Ecology,2006,15:4243-4255.

[21]Asano Y,Ito Y,Fukami M,etal.Herbicide-resistant transgenic creeping bentgrass plants obtained by electroporation using an altered buffer[J].Plant Cell Reports,1998,17:963-967.

[22]Chai M,Wang B,Kim J,etal.Agrobacterium-mediated transformation of herbicide resistance in creeping bentgrass and colonial bentgrass[J].Joumal of Zhejiang University SCIENCE,2003,4(3):346-351.

[23]Luo H,Kausch A P,Hu Q,etal.Controlling transgene escape in GM creeping bentgrass[J].Molecular Breeding,2005,16:185-188.

[24]Hartman C L,Lee L,Day P R,etal.Herbicide resistant turfgrass (AgrostispalustrisHuds.)by biolistic transformation[J].Nature Biotechnology,1994,12:919-923.

[25]Goldman J J,Hanna W W,Fleming G H,etal.Ploidy variation among herbicide-resistant bermudagrass plants of cv.TifEagle transformed with thebargene[J].Plant Cell Reports,2004,22:553-560.

[26]Hu F,Zhang L,Wang X,etal.Agrobacterium-mediated transformed transgenic triploid bermudagrass (Cynodondactylon×C.transvaalensis)plants are highly resistant to the glufosinate herbicide Liberty[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2005,83:13-19.

[27]Toyama K,Bae C,Kang J,etal.Production of herbicide-tolerant Zoysiagrass by Agrobacterium-mediated transformation[J].Molecules and Cells,2003,16(1):19-27.

[28]Bae T,Kim J,Song I,etal.Production of unbolting lines through gamma-ray irradiation mutagenesis in genetically modified herbicide-tolerantZoysiajaponica[J].Breeding Science,2009,59:103-105.

[29]Bae T W,Vanjildorj E,Song S Y,etal.Environmental risk assessment of genetically engineered herbicide-tolerantZoysiajaponica[J].Journal of Environment Quality,2008,37:207-218.

[30]Smith R L,Grando M F,Li Y Y,etal.Transformation of bahiagrass (PaspalumnotatumFlugge)[J].Plant Cell Reports,2002,20:1017-1021.

[31]Sandhu S,James V A，Quesenberry K H,etal.Risk assessment of transgenic apomictic tetraploid bahiagrass,cytogenetics,breeding behavior and performance of intra-specific hybrids[J].Theoretical and Applied Genetics,2009,119:1383-1395.

[32]Sandhu S,Blount A R,Quesenberry K H,etal.Apomixis and ploidy barrier suppress pollen-mediated gene flow in field grown transgenic turf and forage grass (PaspalumnotatumFlugge)[J].Theoretical and Applied Genetics,2010,121:919-929.

[33]馬生健，徐碧玉，曾富華，等.高羊茅抗真菌病基因轉(zhuǎn)化的研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2006，33(6)：1275-1280.

[34]Dong S,Tredway L P,Shew H D,etal.Resistance of transgenic tall fescue to two major fungal diseases[J].Plant Science,2007,173:501-509.

[35]佘建明，張保龍，梁流芳，等.草地早熟禾轉(zhuǎn)葡萄糖氧化酶基因植株的獲得[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006,22(3)：217-221.

[36]Takahashi W,Fujimori M,Miura Y,etal.Increased resistance to crown rust disease in transgenic Italian ryegrass (LoliummultiflorumLam.)expressing the rice chitinase gene[J].Plant Cell Reports,2005,23:811-818.

[37]Chai B,Maqbool S B,Hajela R K,etal.Cloning of a chitinase-like cDNA (hs2),its transfer to creeping bentgrass (AgrostispalustrisHuds.)and development of brown patch (Rhizoctoniasolani)disease resistant transgenic lines[J].Plant Science,2002,163:183-193.

[38]Wang Y,Kausch A P,Chandlee J M,etal.Co-transfer and expression of chitinase,glucanase,andbargenes in creeping bentgrass for conferring fungal disease resistance[J].Plant Science,2003,165:497-506.

[39]Fu D,Tisserat N A,Xiao Y,etal.Overexpression of rice TLPD34 enhances dollar-spot resistance in transgenic bentgrass[J].Plant Science,2005,168:671-680.

[40]Dai W D，Bonos S，Guo Z，etal.Expression of pokeweed antiviral proteins in creeping bentgrass[J].Plant Cell Reports，2003，21：497-502.

[41]Guo Z F，Bonos S，Meyer W A，etal.Transgenic creeping bentgrass with delayed dollar spot symptoms[J].Molecular Breeding，2003，95：95-101.

[42]Xu J，Schubert J，Altpeter F.Dissection of RNA-mediated ryegrass mosaic virus resistance in fertile transgenic perennial ryegrass (LoliumperenneL.)[J].Plant Journal，2001，26(3)：265-274.

[43]佘建明，梁流芳，張保龍，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得草地早熟禾轉(zhuǎn)Bt基因植株[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，21(2)：102-105.

[44]胡繁榮.農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得轉(zhuǎn)基因抗蟲匍匐剪股穎植株[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13(2)：262-263.

[45]Zhang L,Wu D,Zhang L,etal.Agrobacterium-mediated transformation of Japanese lawngrass (ZoysiajaponicaSteud.)containing a synthetic cryIA(b)gene fromBacillusthuringiensis[J].Plant Breeding,2007,126:428-432.

[46]王舟，劉建秀.DREB/CBF類轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展及其在草坪草和牧草抗逆基因工程中的應(yīng)用[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2011,20(1)：222-236.

[47]吳關(guān)庭，陳錦清，胡張華，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化獲得耐逆性增強(qiáng)的高羊茅轉(zhuǎn)基因植株[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(12)：2395-2402.

[48]Zhao J,Ren W,Zhi D,etal.Arabidopsis DREB1A/CBF3 bestowed transgenic tall fescue increased tolerance to drought stress[J].Plant Cell Reports,2007,26:1521-1528.

[49]信金娜，韓烈保，劉君，等.基因槍轉(zhuǎn)化法獲得草地早熟禾(PoapratensisL.)轉(zhuǎn)基因植株[J].中國生物工程雜志，2006，26(8)：10-14.

[50]韓烈保，信金娜，劉君，等.影響草地早熟禾(PoapratensisL.)基因槍轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素研究術(shù)[J].中國生物工程雜志，2006，26(8)：1-4.

[51]楊鳳萍，梁榮奇，張立全，等.抗逆調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子CBF1基因提高多年生黑麥草的抗旱能力[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006，21(1)：14-18.

[52]楊鳳萍，梁榮奇，張立全，等.抗逆調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子DREB1B基因轉(zhuǎn)化多年生黑麥草的研究[J].西北植物學(xué)報(bào)，2006，26(7)：1309-1315.

[53]張磊,吳金霞,董芳，等.抗逆轉(zhuǎn)ABP9基因黑麥草和高羊茅植株的鑒定[J].草業(yè)科學(xué)，2010，27(7)：72-77.

[54]Vanjildorj E,Bae T,Riu K,etal.TransgenicAgrostismongolicaRoshev.with enhanced tolerance to drought and heat stresses obtained from Agrobacterium-mediated transformation[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2006,87:109-120.

[55]James V A,Neibaur I，Altpeter F.Stress inducible expression of theDREB1Atranscription factor from xeric,HordeumspontaneumL.in turf and forage grass (PaspalumnotatumFlugge)enhances abiotic stress tolerance[J].Transgenic Research,2008,17:93-104.

[56]王渭霞，朱廷恒，胡張華，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CBF1基因?qū)λ赡辖Y(jié)縷草的遺傳轉(zhuǎn)化[J].園藝學(xué)報(bào)，2005，32(5)：953.

[57]齊春輝，韓烈保，梁小紅，等.以基因槍法轉(zhuǎn)化日本結(jié)縷草獲得轉(zhuǎn)基因植株[J].北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(3)：71-75.

[58]李志亮，黃叢林，張秀海，等.利用基因槍法向高羊茅導(dǎo)入P5CS基因的研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2005，32(4)：653-657.

[59]王飛，謝樹蓮.轉(zhuǎn)基因(TPS)高羊茅草的抗旱性檢測(cè)研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(21)：6355-6356.

[60]賈煒瓏，胡鳶雷，張彥芹，等.海藻糖合酶基因轉(zhuǎn)化黑麥草及耐旱性研究[J].分子植物育種，2007，5(1)：27-31.

[61]張小蕓，何近剛，孫學(xué)輝，等.轉(zhuǎn)果聚糖合成關(guān)鍵酶基因多年生黑麥草的獲得及抗旱性的提高[J].草業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20(1)：111-118.

[62]Fu D,Huang B,Xiao Y,etal.Overexpression of barley hva1 gene in creeping bentgrass for improving drought tolerance[J].Plant Cell Reports,2007,26:467-477.

[63]Aswath C R,Kim S H,Mo S Y,etal.Transgenic plants of creeping bent grass harboring the stress inducible gene,9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase,are highly tolerant to drought and NaCl stress[J].Plant Growth Regulation,2005,47:129-139.

[64]Merewitz E B,Gianfagna T,Huang B.Photosynthesis,water use,and root viability under water stress as affected by expression of SAG12-iptcontrolling cytokinin synthesis inAgrostisstolonifera[J].Journal of Experimental Botany,2011,62(1):383-395.

[65]趙軍勝，支大英，薛哲勇，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高羊茅遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].遺傳學(xué)報(bào)，2005，32(6)：579-585.

[66]Tian L,Huang C,Yu R,etal.Overexpression AtNHX1 confers salt-tolerance of transgenic tall fescue[J].African Journal of Biotechnology,2006,5(11):1041-1044.

[67]Zhao J,Zhi D,Xue Z,etal.Enhanced salt tolerance of transgenic progeny of tall fescue (Festucaarundinacea)expressing a vacuolar Na+/H+antiporter gene fromArabidopsis[J].Journal of Plant Physiology,2007,164:1377-1383.

[68]Wu Y,Chen Q,Chen M,etal.Salt-tolerant transgenic perennial ryegrass (LoliumperenneL.)obtained byAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of the vacuolar Na+/H+antiporter gene[J].Plant Science,2005,169:65-73.

[69]劉萍，張振霞，蘇喬，等.應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的多年生黑麥草遺傳轉(zhuǎn)化研究[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，4(3)：126-128.

[70]王渭霞，朱廷恒，玄松南.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的匍匐剪股穎胚性愈傷組織的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)CBF1基因植株的獲得[J].中國草地學(xué)報(bào)，2006，28(4)：59-64.

[71]Li R,Wei J,Wang H,etal.Development of highly regenerable callus lines and Agrobacterium-mediated transformation of Chinese lawngrass (ZoysiasinicaHance)with a cold inducible transcription factor,CBF1[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2006,85:297-305.

[72]Hu Y,Jia W,Wang J,etal.Transgenic tall fescue containing theAgrobacteriumtumefaciensiptgene shows enhanced cold tolerance[J].Plant Cell Reports,2005,23:705-709.

[73]Xu Y,Gianfagna T,Huang B.Proteomic changes associated with expression of a gene (ipt)controlling cytokinin synthesis for improving heat tolerance in a perennial grass species[J].Journal of Experimental Botany,2010,61(12):3273-3289.

[74]章家長(zhǎng)，孫振元，李召虎，等.轉(zhuǎn)PsAGl2-ipt基因結(jié)縷草的獲得及其衰老特性分析[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2005，15(7)：818-823.

[75]Hisano H，Kanazawa A，Kawakami A，etal.Transgenic perennial ryegrass plants expressing wheat fructosyltransferase genes accumulate increased amounts of fructan and acquire increased tolerance on a cellular level to freezing[J].Plant science，2004，167：861-868.

[76]Zhao C,Qiao M,Yu Y,etal.The effect of the heterologous expression ofPhragmitesaustralisg-glutamylcysteine synthetase on the Cd2+accumulation ofAgrostispalustris[J].Plant,Cell and Environment 2010,33:877-887.