短鏈脂肪酸對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞促炎因子、趨化因子和緊密連接蛋白表達(dá)量的影響

鄧波波，馮寶寶，詹康，霍永久，趙國琦

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

瘤胃是反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)最重要結(jié)構(gòu)之一，動(dòng)物食入的植物性飼料在瘤胃內(nèi)發(fā)酵成短鏈脂肪酸(short chain fatty acid,SCFA)來調(diào)節(jié)瘤胃的多種生理功能.瘤胃生理功能的正常運(yùn)行離不開健全的屏障保護(hù)作用，瘤胃保護(hù)屏障由微生物屏障、物理屏障和免疫屏障組成.微生物屏障是依據(jù)瘤胃中微生物間共生、拮抗、競(jìng)爭(zhēng)等方式來維持菌群平衡，抑制有害菌毒素的過度分泌；物理屏障是通過上皮細(xì)胞之間的緊密連接結(jié)構(gòu)，阻止毒素和病原體從瘤胃上皮進(jìn)入血液；免疫屏障是由腸相關(guān)的免疫細(xì)胞及分泌的細(xì)胞免疫因子組成[1].到目前為止，從瘤胃微生態(tài)環(huán)境因素到宿主本身的生理?xiàng)l件，已經(jīng)有很多因素被報(bào)道與這些屏障功能有關(guān).其中短鏈脂肪酸最受關(guān)注，短鏈脂肪酸包括乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，瘤胃上皮細(xì)胞可吸收50%～80%的短鏈脂肪酸，并有報(bào)道稱短鏈脂肪酸可影響瘤胃物理屏障和免疫屏障功能，如影響瘤胃上皮的完整性、瘤胃上皮生長、緊密連接的表達(dá)以及瘤胃上皮炎癥因子的調(diào)節(jié)等[2].瘤胃內(nèi)注射SCFAs可促進(jìn)幼齡反芻動(dòng)物瘤胃乳頭的發(fā)育[3].此外，SCFAs還可以刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活，促進(jìn)機(jī)體能量的消耗，減少脂肪的合成等[4].已有研究表明，G蛋白偶聯(lián)受體41(G protein-coupled receptor 41,GPR41)和G蛋白偶聯(lián)受體43(G protein-coupled receptor 43,GPR43)是人體短鏈脂肪酸的受體[5-7].GPR41 mRNA廣泛表達(dá)于胰臟、脾臟、淋巴結(jié)等組織器官中，在脂肪組織中更是尤為普遍[8].GPR41/43在胃腸道黏膜和內(nèi)分泌細(xì)胞中均有表達(dá)，這表明GPR41/43可能參與免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展.目前的研究中，主要是GPR41和GPR43對(duì)人和小鼠炎癥反應(yīng)的調(diào)控[7,15]，SCFA可誘導(dǎo)GPR43的表達(dá)，促進(jìn)小鼠骨髓中性粒細(xì)胞的趨化[9].小鼠體內(nèi)注射乙醇可誘導(dǎo)發(fā)生結(jié)腸炎癥，而小鼠在丟失了GPR41和GPR43基因的條件下，腸道白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白介素-12(Interleukin -12,IL-12)的表達(dá)量顯著降低[10].以此可以得出，GPR41和GPR43的激活可以增強(qiáng)促炎因子的高表達(dá).目前，GPR41和GPR43已在奶牛的不同組織中被鑒定[11].但本實(shí)驗(yàn)室建立的永生化奶牛瘤胃上皮細(xì)胞系不能表達(dá)GPR43，只能表達(dá)GPR41.并且，科研研究中關(guān)于SCFA用于調(diào)節(jié)瘤胃上皮先天免疫的分子機(jī)制研究較少，我們推測(cè)SCFA調(diào)節(jié)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)與GPR41的介導(dǎo)有關(guān).

本試驗(yàn)在永生化的瘤胃上皮細(xì)胞中添加20 mmol/L的短鏈脂肪酸，觀察隨著吸收時(shí)間的延長瘤胃上皮細(xì)胞中GPR41、促炎因子IL-1β、趨化因子2(CXCL2)、趨化因子3(CXCL3)、趨化因子8(CXCL8)、趨化因子20(CCL20)和緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1表達(dá)量的變化趨勢(shì)，為系統(tǒng)的研究SCFAs調(diào)節(jié)瘤胃上皮免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)分為4組，在瘤胃上皮細(xì)胞中添加20 mmol/L SCFAs ，0、2、5、8 h時(shí)收集細(xì)胞，提取總RNA.試驗(yàn)中乙酸、丙酸和丁酸的摩爾比為15∶5∶3.20 mmol/L SCFAs由12 mmol/L乙酸鈉、5 mmol/L丙酸鈉和3 mmol/L丁酸鈉組成.

1.2.2 總RNA提取 在奶牛瘤胃上皮細(xì)胞中添加SCFAs，分別在0、2、5、8 h后收集細(xì)胞，提取各組細(xì)胞RNA.棄掉培養(yǎng)基，每孔中加入1 mL的細(xì)胞裂解液，靜置5 min，將裂解好的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至無酶離心管中；在裂解液中加200 μL的三氯甲烷，閉蓋，混旋10 s，靜置3 min；4 ℃ 12 000 r/minm離心10 min，吸取最上層水相，將其轉(zhuǎn)移到全新無酶離心管中；加入0.5倍體積的無水乙醇，混勻，將溶液全部轉(zhuǎn)移至吸附柱中，4 ℃ 12 000 r/min離心45 s；棄廢液；加入去蛋白液RD 500 μL，4 ℃ 12 000 r/min離心45 s，棄廢液；再加入漂洗液RW 500 μL，靜置2 min，4 ℃ 12 000 r/min離心45 s，棄廢液；重復(fù)上述步驟；將吸附柱放回收集管，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min；棄廢液，打開蓋子室溫靜置15 min，徹底去除殘余的有機(jī)液體；將吸附柱放置新的1.5 mL無酶離心管中，加30 μL無酶水，靜置2 min，4 ℃ 12 000 r/min離心2 min.測(cè)定總RNA的濃度和純度.

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄成cDNA 本試驗(yàn)使用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒將樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，所有操作依據(jù)Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行.

1.2.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的奶牛IL-1β、CXCL8、CCL20、CXCL2、CXCL3、Claudin-1、ZO-1、Occludin、GPR41和GAPDH的mRNA序列，采用Primer Premier 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見表1.引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成.

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.One-Way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，顯著性檢驗(yàn)應(yīng)用LSD法.

表1 熒光定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 添加SCFAs后對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞GPR41表達(dá)的影響

在奶牛瘤胃上皮細(xì)胞中添加20 mmol/L的SCFAs，以不同時(shí)間點(diǎn)收集的細(xì)胞cDNA為模板，進(jìn)行qPCR分析.如圖1所示，8 h后GPR41的表達(dá)量顯著高于0、2、5 h時(shí)的表達(dá)量(P<0.05).

圖1 SCFA對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞GPR41表達(dá)的影響Figure 1 Effects of SCFA on expression of GPR41 in BRECs

2.2 添加SCFAs后對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞促炎因子和趨化因子表達(dá)的影響

免疫因子和趨化因子的表達(dá)量可反映上皮細(xì)胞免疫機(jī)能的強(qiáng)弱，瘤胃上皮細(xì)胞中添加20 mmol/LSCFAs，不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)免疫機(jī)能的影響見下圖，由圖2可知，添加20 mmol/L的SCFAs，2 h時(shí)IL-1β的表達(dá)量顯著上升，顯著高于0 h時(shí)(P<0.05)，在8 h時(shí)達(dá)到最高.由圖3和圖5可知，添加20 mmol/L SCFAs 5 h時(shí)，CXCL2和CXCL8的表達(dá)量顯著高于0 h組(P<0.05)，且在整組中表達(dá)量最高；CXCL8、CCL20的表達(dá)量在5 h時(shí)最高，但到了8 h時(shí)表達(dá)量顯著降低(P<0.05).由圖4可知，CXCL3的表達(dá)量隨著時(shí)間點(diǎn)的增加表達(dá)量逐漸升高，但未達(dá)到顯著水平(P>0.05).

圖2 SCFA對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響Figure 2 Effects of SCFA on expression of IL-1β in BRECs

圖3 SCFA對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞CXCL2表達(dá)的影響Figure 3 Effects of SCFA on expression of CXCL2 in BRECs

圖4 SCFA對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞CXCL3表達(dá)的影響Figure 4 Effects of SCFA on expression of CXCL3 in BRECs

圖6 SCFA對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞CCL20表達(dá)的影響Figure 6 Effects of SCFA on expression of CCL20 in BRECs

2.3 添加SCFAs后對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的影響

瘤胃上皮細(xì)胞中添加SCFA，對(duì)緊密連接蛋白ZO-1、Claudin-1和Occludin表達(dá)量的影響見下圖.由圖7可知，添加20 mmol/L SCFAs ZO-1的表達(dá)量在8 h時(shí)達(dá)到最高，但沒有達(dá)到顯著水平(P>0.05).由圖8、9可知，添加20 mmol/L SCFAs 2 h時(shí)Claudin-1和Occludin的表達(dá)量顯著高于0 h時(shí)(P<0.05)，而在5、8 h時(shí)，Claudin-1和Occludin的表達(dá)量逐漸降低，但均顯著高于0 h(P<0.05).

圖7 SCFA對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞ZO-1表達(dá)的影響Figure 7 Effects of SCFA on expression of ZO-1 in BRECs

圖8 SCFA對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞Claudin表達(dá)的影響Figure 8 Effects of SCFA on expression of Claudin in BRECs

圖9 SCFA對(duì)奶牛瘤胃上皮細(xì)胞Occludin表達(dá)的影響Figure 9 Effects of SCFA on expression of Occludin in BRECs

3 討論

反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵的重要產(chǎn)物是短鏈脂肪酸，它可調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)育、胰島素和胰高血糖素分泌以及參與一些重要的生理過程[4].腸道微生物可以積極的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)預(yù)防腸道炎癥疾病的發(fā)生[12-13].患有結(jié)腸炎的病人常常伴隨SCFAs的顯著減少[10].短鏈脂肪酸是反芻動(dòng)物瘤胃微生物降解日糧中碳水化合物所產(chǎn)生的有機(jī)酸[14].因此，我們推斷腸道微生物能夠積極的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)可能與微生物發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs有關(guān).參與免疫調(diào)節(jié)代謝產(chǎn)物的SCFAs可激活GPR41受體.前人已證明，GPR41和GPR43是短鏈脂肪酸的受體[5-6]，這表明GPR41和GPR43作為受體可能同樣介導(dǎo)SCFAs調(diào)控瘤胃上皮炎癥的反應(yīng).有研究顯示，瘤胃上皮中GPR41表達(dá)量下降，會(huì)導(dǎo)致瘤胃上皮屏障的損傷和炎癥反應(yīng)的發(fā)生[15].一旦瘤胃上皮通透性增加，瘤胃內(nèi)的脂多糖和細(xì)菌裂解物就有機(jī)會(huì)轉(zhuǎn)移到血液中，導(dǎo)致全身出現(xiàn)炎癥反應(yīng)[16].本試驗(yàn)在奶牛瘤胃上皮細(xì)胞中添加了20 mmol/L的SCFAs，8 h后GPR41的表達(dá)量顯著升高，再次驗(yàn)證了SCFAs和GPR41之間的相互作用關(guān)系.并且本研究發(fā)現(xiàn)加入SCFAs 8 h后GPR41表達(dá)量顯著升高，同時(shí)IL-1β的表達(dá)量也在添加SCFAs 8 h后達(dá)到了最高水平，IL-1β在促進(jìn)中性粒細(xì)胞的招募和抵抗金黃色葡萄球菌的感染中扮演十分重要的作用.有研究報(bào)道稱，小鼠體內(nèi)GPR41表達(dá)量降低可導(dǎo)致促炎因子IL-1β、IL-6、IL-11的表達(dá)量降低，并且缺乏GPR41會(huì)下調(diào)小鼠腸道炎癥介質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)[17].細(xì)胞中的趨化因子同樣是瘤胃上皮免疫屏障的重要組成部分，趨化因子可以趨化免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞到達(dá)組織受感染的部位，進(jìn)行免疫應(yīng)答來處理異物產(chǎn)生的抗原.奶牛在飼喂高精料的日糧時(shí)，可有效提高奶牛的產(chǎn)奶量.于此同時(shí)，瘤胃微生物對(duì)日糧纖維進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)生大量有機(jī)酸，降低了瘤胃中的pH，破壞革蘭氏陰性菌并釋放游離脂多糖，從而引發(fā)瘤胃上皮組織的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致反芻動(dòng)物出現(xiàn)拉稀的癥狀.飼喂高精料日糧雖會(huì)產(chǎn)生大量SCFAs，但也會(huì)增強(qiáng)瘤胃上皮GPR41的表達(dá)量，CCL型和CXCL型趨化因子表達(dá)量上調(diào)，促使更多的免疫細(xì)胞到達(dá)瘤胃上皮層，對(duì)瘤胃上皮形成保護(hù)性免疫應(yīng)答.有研究表明，機(jī)體組織GPR41的表達(dá)量與CCL20、CXCL2、CXCL3、CXCL8以及CXCL14 mRNA的表達(dá)量始終呈正相關(guān)[15].在敲除了GPR41基因的小鼠中，腸組織中CCL和CXCL型趨化因子的基因表達(dá)量顯著降低，并導(dǎo)致中性粒細(xì)胞浸潤異常減少[17].本試驗(yàn)中添加了20 mmol/L 的SCFAs 8 h時(shí)，GPR41的表達(dá)量顯著高于0 h，并且CXCL2、CXCL3和CXCL8的表達(dá)量也顯著升高，說明添加短鏈脂肪酸通過GPR41的介導(dǎo)可在一定程度上可以增強(qiáng)瘤胃上皮細(xì)胞的免疫機(jī)能.

瘤胃上皮細(xì)胞的連接方式主要分為緊密連接、橋粒連接、黏著連接和間隙連接，而緊密連接形式是細(xì)胞間最重要的連接方式[18]，它是防止有害物質(zhì)跨越上皮組織轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu).胃腸中的這種緊密連接形式主要位于顆粒層細(xì)胞之間，是形成胃腸黏膜保護(hù)屏障的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，也是決定細(xì)胞間通透性大小的主要因素.大量的研究表明，緊密連接蛋白基因的表達(dá)和分布與多種上皮疾病有關(guān)[19].病理狀態(tài)下，緊密連接屏障被破壞，細(xì)胞間隙增大，細(xì)菌、病毒等大分子物質(zhì)趁機(jī)進(jìn)入，黏膜的屏障功能減弱甚至消失.當(dāng)上皮組織緊密連接結(jié)構(gòu)發(fā)生變異、減少或缺失時(shí)，該組織的緊密連接再分配和基因表達(dá)便會(huì)下調(diào)，致使上皮細(xì)胞受損，屏障功能喪失，進(jìn)而使上皮細(xì)胞通透性增加[20]，如在腸炎時(shí)，屏障功能受損過多的水分進(jìn)入腸腔，造成腹瀉或更嚴(yán)重后果，這都是基于上皮組織緊密連接結(jié)構(gòu)的改變和緊密連接蛋白復(fù)雜性的降低造成的[21].本試驗(yàn)在瘤胃上皮細(xì)胞中添加20 mmol/L的短鏈脂肪酸，2 h后Claudin-1和Occludin的表達(dá)量顯著高于0 h時(shí)，而在5 h后Claudin-1和Occludin的表達(dá)量有所降低，但表達(dá)量仍顯著高于0 h時(shí)，說明在瘤胃上皮細(xì)胞中添加短鏈脂肪酸短時(shí)間內(nèi)便可以增加緊密連接蛋白的表達(dá)量.Tong等研究發(fā)現(xiàn)，丙酸和丁酸等可以增加腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)量，或通過增加AMP-激活蛋白激酶的活性，加速緊密連接組裝，從而加強(qiáng)細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)，抑制腸道通透性，增強(qiáng)屏障防御機(jī)能[22-23].Claudin蛋白是上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)中最主要的功能分子，它維持著緊密連接特有的屏障特性，嚴(yán)格控制微生物和毒性大分子通過，以此來保持組織內(nèi)部的穩(wěn)態(tài).Occludin蛋白是構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)的功能分子之一，但它不是此結(jié)構(gòu)必需的蛋白[24]，它的存在影響Clauddin蛋白的表達(dá)，使其更好的形成完整的緊密連接，來履行緊密連接特有的柵欄功能和屏障功能.所以從試驗(yàn)結(jié)果看短鏈脂肪酸是可以增強(qiáng)瘤胃上皮細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)量，對(duì)瘤胃上皮免疫屏障的形成起著積極促進(jìn)作用.

4 結(jié)論

瘤胃上皮細(xì)胞吸收短鏈脂肪酸后，可以上調(diào)GPR41的表達(dá)量，提高促炎因子IL-1β和趨化因子的表達(dá)量，并且瘤胃上皮細(xì)胞中緊密連接蛋白的表達(dá)量也顯著升高.炎癥因子、趨化因子、緊密連接蛋白表達(dá)量都有所上調(diào)，說明短鏈脂肪酸能夠增強(qiáng)瘤胃上皮的免疫屏障功能.