基于生物信息學(xué)分析的子宮內(nèi)膜異位癥miRNAmRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的初步構(gòu)建*

姜麗，章蒙蒙，王思雪，曹樂，周雨馨，方小玲

（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，湖南 長沙 410011）

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡期婦女的多發(fā)病、常見病，其臨床表現(xiàn)多種多樣，且具有一定異質(zhì)性，常見癥狀有疼痛、月經(jīng)異常、不孕等。該疾病組織學(xué)分類雖然為良性，但是在臨床行為學(xué)上卻具有類似惡性腫瘤的特點，如種植、侵襲、遠處轉(zhuǎn)移、容易復(fù)發(fā)等[1]。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機制至今仍未完全闡明，目前主要的理論學(xué)說包括異位種植學(xué)說、體腔上皮化生學(xué)說、誘導(dǎo)學(xué)說、遺傳因素、免疫與炎癥因素、在位內(nèi)膜決定論等，但是其中任何一種學(xué)說都不能完全解釋該疾病的所有方面[2]。

近年來基因芯片技術(shù)的發(fā)展和各大生物信息數(shù)據(jù)庫的建立，為子宮內(nèi)膜異位癥的研究提供有利工具并開拓新的思路和方向。本研究將GEO 數(shù)據(jù)庫中的mRNA 芯片和公共數(shù)據(jù)庫中挖掘的miRNA 進行聯(lián)合分析，構(gòu)建miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)，尋找子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的miRNA 及其主要作用的靶基因，并探索子宮內(nèi)膜異位癥的分子發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 基因表達譜數(shù)據(jù)來源

本研究從GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索并下載子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的表達譜數(shù)據(jù)集GSE7305[3]，該數(shù)據(jù)集包含從10 例卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者獲取的10 個卵巢異位內(nèi)膜樣本和10 個配對的在位內(nèi)膜樣本。所有樣本均采用GPL570 芯片平臺（Affymetrix human genome U133 Plus 2.0）進行差異表達基因的檢測。

1.2 差異表達基因的分析

首先使用R 語言軟件中Affy[4]程序包，讀取芯片原始數(shù)據(jù)，然后采用RMA（robust multi-array average）法[5]對數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化預(yù)處理（包括背景矯正、歸一化處理和表達值計算）。隨后利用GPL570 平臺注釋文件對探針進行注釋，去除沒有匹配到基因名稱的探針。當(dāng)不同探針映射到同一基因時，取不同探針的平均值作為這個基因最終的表達值。最后，采用LIMMA[6]程序包（linear models for microarray analysis）篩選差異表達基因，將P≤0.05 和|log2 FC|≥2 作為篩選差異表達基因的閾值。篩選出差異表達基因后，使用R 軟件中的Gplots、Pheatmap 等程序包繪制相應(yīng)的熱圖和火山圖。

1.3 差異表達基因的功能和通路富集分析

DAVID 在線網(wǎng)站（https://david.ncifcrf.gov/home/jsp）整合大規(guī)模的生物數(shù)據(jù)，是為大量基因提供功能注釋的有效工具。采用DAVID 在線網(wǎng)站對篩選到的差異表達基因進行基因本體論（gene ontology, GO）注釋（即基因功能富集分析）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號通路富集分析。采用Fisher檢驗和FDR 方法校驗，將P＜0.05 作為富集分析的閾值，并按照P值大小升序排序。

1.4 miRNA 數(shù)據(jù)來源

人類microRNA（miRNA）疾病數(shù)據(jù)庫HMDD v3.0（http://www.cuilab.cn/hmdd）是經(jīng)過實驗驗證的人類miRNA 和疾病關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)庫。以“endometriosis”為關(guān)鍵詞在HMDD 中查找已有文獻報道的和該疾病相關(guān)的miRNA，選取在組織中表達有差異且文獻研究報道頻次≥2 的相對高頻miRNA 共13 個（異位內(nèi)膜組織中高表達miRNA 6 個，低表達miRNA 7 個）作為本研究對象。

1.5 miRNA 靶基因預(yù)測

miRWalk 2.0（http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/）是目前可在線預(yù)測miRNA 靶基因的最大綜合性數(shù)據(jù)庫之一，提供來自人類、小鼠和大鼠的miRNA 靶基因信息。該數(shù)據(jù)庫內(nèi)容可分為預(yù)測模塊和驗證模塊，其中預(yù)測模塊提供了綜合各大數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA靶基因的功能。本研究使用miRWalk 2.0數(shù)據(jù)庫的預(yù)測模塊獲取miRNA 的預(yù)測靶基因，采用miRWalk、MicroT4、miRanda、RNA22、Target Scan 多種預(yù)測方法[7]完成預(yù)測。為降低假陽性率，同時被≥4 種預(yù)測工具標(biāo)記的靶基因最終被選為miRNA 的預(yù)測靶基因。

1.6 構(gòu)建miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)

將miRNA 的預(yù)測靶基因和從GSE7305 分析獲得的差異表達基因取得交集，通過綜合分析得到miRNA 和mRNA 相互作用關(guān)系對。使用可視化軟件Cytoscape v3.6.1 對miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行繪圖，并使用CytoHubba插件進行前20個樞紐基因及miRNA的篩選，構(gòu)建相應(yīng)的子網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 篩選出差異表達基因

通過R 語言軟件對數(shù)據(jù)集GSE7305 進行芯片數(shù)據(jù)處理及差異分析，共得到655 個差異表達基因，其中包括343 個上調(diào)基因和312 個下調(diào)基因。依據(jù)上述結(jié)果在R 語言軟件中繪制雙向聚類熱圖，橫坐標(biāo)為組織樣本，縱坐標(biāo)為差異表達基因。根據(jù)聚類熱圖（見圖1A）及火山圖（見圖1B）所示，不難發(fā)現(xiàn)來自異位內(nèi)膜組織的樣本和來自在位內(nèi)膜組織的樣本形成了相應(yīng)的兩大聚類群。

2.2 Go 和KEGG 富集分析結(jié)果

為明確差異表達基因的功能，本文通過DAVID 在線網(wǎng)站對篩選的差異表達基因進行GO 注釋和KEGG信號通路富集分析，其中GO 注釋主要分為生物進程、細(xì)胞組成和分子功能3 個部分。在生物進程中，基因主要富集于cell adhesion, extracellular matrix organization,mitotic nuclear division, cell division。在細(xì)胞組成，基因主要富集在extracellular space, extracellular matrix,proteinaceous extracellular matrix, extracellular exosome。在分子功能中，基因主要富集于heparin binding, integrin binding, sequence-specific DNA binding, serine-type carboxypeptidase activity。KEGG 信號通路富集分析提示，該差異表達基因主要富集于complement and coagulation cascades, p53 signaling pathway, cell adhesion molecules 等通路中。見圖2。

圖1 GSE7305 中異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜的mRNA 表達差異

圖2 差異表達基因GO 和KEGG 富集分析

2.3 子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)miRNA

通過HMDD v3.0 查詢經(jīng)實驗證實的與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的miRNA，初步發(fā)現(xiàn)在異位內(nèi)膜組織中差異表達的miRNA 共有77 個，而有≥2 篇文獻報道的miRNA 共有13 個。其中在異位內(nèi)膜組織表達上調(diào)的miRNA 有6 個： hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-100-5p、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-202-3p；而在異位內(nèi)膜組織中表達下調(diào)的miRNA 有7 個： hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200a-3p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-424-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-449b-3p。運用miRWalk 2.0 預(yù)測模塊，獲得上述13 個miRNA 的預(yù)測靶基因。miRNA 查找及預(yù)測靶基因篩選結(jié)果見表1。

2.4 子宮內(nèi)膜異位癥miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

由于目前已知miRNA 對靶基因的調(diào)控作用主要是負(fù)向調(diào)控關(guān)系，因此將7 個下調(diào)的miRNA 預(yù)測靶基因同GSE7305 上調(diào)的差異表達基因（343 個）取得交集，共獲得332 個靶基因；將6 個上調(diào)的miRNA預(yù)測靶基因同GEE7305 下調(diào)的差異表達基因（312 個）取得交集，共獲得114 個靶基因。利用Cytoscape v3.6.1分別繪制下調(diào)及上調(diào)miRNA 及相應(yīng)靶基因mRNA 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3A、B）。其中hsa-miR-20a-5p 調(diào)控的靶基因最多，共73 個，且下調(diào)的miRNA 調(diào)控的靶基因數(shù)均在30 個以上，推測在異位內(nèi)膜組織中以miRNA 表達下調(diào)、相應(yīng)靶基因表達上調(diào)為主。

表1 HMDD v3.0 及miRWalk 2.0 數(shù)據(jù)庫中與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的miRNA

圖3 異位內(nèi)膜組織中差異表達的miRNAs-mRNAs 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

使用CytoHubba 插件對下調(diào)miRNA-上調(diào)mRNA和上調(diào)miRNA-下調(diào)mRNA 2 個網(wǎng)絡(luò)進行前20 個核心基因及核心miRNAs 的篩選，并構(gòu)建相應(yīng)的子網(wǎng)絡(luò)（見圖4）。下調(diào)miRNA-上調(diào)mRNA 網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)絡(luò)中的核心miRNA 為hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-424-5p、hsamiR-34c-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200b-3p、hsamiR-200a-3p、hsa-miR-449b-3p，其調(diào)控的核心基因為PLXNA4、SGCD、ANKRD52、NFASC、DENND5B、CELF2、MYOCD、PRELP、TNS1、GATA6、FOXP1、PTGDR、NTRK2。上調(diào)miRNA-下調(diào)mRNA 網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)絡(luò)中的核心miRNA 為hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-29c-3p、hsa-miR-145-5p、hsa-miR-143-3p、hsa-miR-202-3p，其調(diào)控的核心基因為ADAM12、PGR、MMP11、FREM2、SHISA6、FXYD3、ITGA6、FRAS1、PAX8、HMGB3、FGFR3、ESR1、ERBB3、DIO2、CPM。通過觀察不難發(fā)現(xiàn)，圖4A 示miRNA 與靶基因的聯(lián)系更為密切，而圖4B 示miRNA 與靶基因之間及靶基因與靶基因之間聯(lián)系較少，網(wǎng)絡(luò)較為稀疏。

圖4 異位內(nèi)膜組織中差異表達的miRNAs-mRNAs 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)絡(luò)

3 討論

本研究利用GEO 數(shù)據(jù)集GSE7305 分析子宮內(nèi)膜異位癥異位內(nèi)膜組織和在位內(nèi)膜組織的mRNA 差異表達情況，共篩選出655 個差異表達基因（343 個上調(diào)基因和312 個下調(diào)基因）。通過GO 和KEGG 信號通路富集分析發(fā)現(xiàn)，這些差異表達基因主要和細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖分裂、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)等生物學(xué)過程和功能有關(guān)，同時富集于補體信號通路、P53 信號通路、細(xì)胞黏附相關(guān)信號通路中。

既往研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥是一種自身免疫性疾病，而補體激活導(dǎo)致的體液免疫異常是發(fā)病機制中的重要環(huán)節(jié)[8]。在子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位病灶、外周血和腹腔液中出現(xiàn)過各種非器官特異性的自身抗體，如抗多核苷酸類抗體、抗組蛋白抗體、抗磷脂抗體等；還出現(xiàn)特異性自身抗體，如抗子宮內(nèi)膜抗體和抗卵巢抗體。尤其是抗子宮內(nèi)膜抗體，可以和異位或在位內(nèi)膜產(chǎn)生抗原-抗體結(jié)合沉積于子宮和異位病灶中，通過激活補體，使患者血清及腹腔液中C3 補體相關(guān)蛋白水平升高，并通過激活一系列的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致患者產(chǎn)生更為廣泛的細(xì)胞免疫和體液免疫異常[9]。本研究也發(fā)現(xiàn)，差異表達基因中補體相關(guān)蛋白C7、C3、C1R、C1S、CFB、CFH、CFD、PROS1、SERPINE1 的升高，尤其C7、C3 和CFH 表達差異倍數(shù)均在log2 FC ＞4 倍以上。

P53作為抑癌基因，在正常人體細(xì)胞活動中發(fā)揮著促進細(xì)胞凋亡、促進DNA 修復(fù)、避免受損DNA 堆積以維持基因組穩(wěn)定的功能[10]。P53基因突變或失活，將通過影響下游增殖、凋亡等信號通路從而導(dǎo)致腫瘤。2000年，VOGELSTEIN 和LEVINE 等學(xué)者提出P53基因網(wǎng)絡(luò)的概念，認(rèn)為許多基因形成網(wǎng)絡(luò)協(xié)同效應(yīng)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生命活動，不應(yīng)該孤立地觀察單個基因的生物學(xué)功能[11]。本研究中富集在P53信號通路中的基因有CCNB1、CCNE2、CCNB2、CDK1、RRM2、CYCS、SERPINE1、PMAIP1、PERP、THBS1、GTSE1。其中，CCNB1、CCNB2、CCNB2、CDK1 也是影響細(xì)胞周期的重要分子。有研究發(fā)現(xiàn)，CCNB1 可通過與CDK1 結(jié)合形成成熟生長因子MPF，該Cyclin B-CDK1 復(fù)合物主要在G2 末期發(fā)揮作用，可引導(dǎo)細(xì)胞進入有絲分裂期。TANG 等[12]研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜CCNB1 表達量高于在位內(nèi)膜，說明CCNB1 升高促進異位內(nèi)膜增殖是重要的致病機制之一。但是其研究表明CDK1 表達無差異。同時YAMAMOTO 等[13]研究發(fā)現(xiàn)在與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的卵巢腫瘤中，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin A 和Cyclin E 的表達均升高。

細(xì)胞黏附分子是一類介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間黏附作用的膜表面糖蛋白，參與細(xì)胞的生長分化、組織修復(fù)、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移等過程[14]。已有研究表明多種細(xì)胞黏附分子與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，其通過調(diào)節(jié)異位內(nèi)膜細(xì)胞與腹膜的黏附，參與異位內(nèi)膜的種植[15]。本研究中細(xì)胞黏附分子NFASC、CLDN11、CDH3、VCAM1、NCAM1、CD22、SELE、NEGR1 表達均上調(diào)。其中血管細(xì)胞黏附分子VCAM1 在子宮內(nèi)膜異位癥中的研究最多，在子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位內(nèi)膜[16]、異位內(nèi)膜[17]、腹膜組織[16-17]及血清中[17-18]均有VCAM1 的表達升高，提示VCAM1 參與子宮內(nèi)膜異位癥形成的多個病理過程，并有希望作為子宮內(nèi)膜異位癥的診斷標(biāo)志物。

miRNA 通過作用于靶基因的mRNA 3'-非編碼區(qū)（3'-untranslated region, 3'-UTR）使得靶基因mRNA 表達沉默，在轉(zhuǎn)錄水平上參與基因的表達調(diào)控。已有研究表明，子宮內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜、在位內(nèi)膜和血清中均存在miRNA 的差異表達[19]，且這些差異表達的miRNA 通過調(diào)控缺氧、增殖、凋亡、血管新生、細(xì)胞外基質(zhì)重塑等病理過程介導(dǎo)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展[20]。本研究采用差異表達基因分析、miRNA靶基因預(yù)測等生物信息學(xué)方法，對篩選的異位內(nèi)膜組織中表達下調(diào)和上調(diào)的miRNA 構(gòu)建相應(yīng)的miRNAmRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并從中篩選出2 個最重要的子網(wǎng)絡(luò)。

在下調(diào)miRNA、上調(diào)mRNA 網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)絡(luò)中靶基因GATA6在子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)研究中被報道最多，屬于GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長分化及其功能的維持等方面有重要作用。IZAWA等[21]研究發(fā)現(xiàn)GATA6 在異位內(nèi)膜組織呈高表達狀態(tài)，同時去甲基化可增強GATA6 的表達水平；DYSON等[22]在異位病灶基質(zhì)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了GATA6 的去甲基化狀態(tài)，并和激素抵抗有關(guān)。本研究中hsamiR-20a-5p、hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200b-3p、hsa-miR-449b-3p 均可以靶向作用于GATA6，其中hsa-miR-141-3p、hsa-miR-200b-3p 均屬于miR-200家族,可在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起到抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用。DONG 等[23]通過熒光素酶基因報告驗證GATA6是miR-141 的靶基因，并且在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中驗證miR-141 可通過靶向作用于GATA6等多個基因從而抑制血管生成。FAN 等[24]在人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)miR-200a-3p 的上調(diào)，會抑制TNF-α 引起的GATA6 的表達。本研究均說明miR-200 家族和GATA6 之間存在靶向調(diào)控關(guān)系，但是該調(diào)控關(guān)系是否也在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制中起重要作用值得進一步研究。

在上調(diào)miRNA、下調(diào)mRNA 網(wǎng)絡(luò)的子網(wǎng)絡(luò)中，值得注意的是PGR、ESR1 均受到hsa-miR-125-5p的調(diào)控而處于下調(diào)狀態(tài)。子宮內(nèi)膜異位癥是一種激素依賴性疾病，臨床常使用孕激素來拮抗雌激素的作用，抑制異位內(nèi)膜生長或使之萎縮，達到緩解癥狀的目的，但是會出現(xiàn)孕激素抵抗而影響其療效?，F(xiàn)有研究推測這和子宮內(nèi)膜異位癥患者體內(nèi)孕激素受體表達失調(diào)，以及孕激素受體亞型分布異常有關(guān)，本研究中異位內(nèi)膜組織中孕激素受體下調(diào)與現(xiàn)有研究的結(jié)果一致，并且其下調(diào)有可能受到miRNA 的調(diào)控。另外，雌激素是強有絲分裂原，既可直接刺激異位病灶的細(xì)胞增殖，又可以促進新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞增生，同時還可以刺激多種炎癥相關(guān)因子參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病過程[25]。雌激素受體有2 種亞型： ESR1（ERα）和ESR2（ERβ），已有研究表明在異位病灶及異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，ESR1 表達下調(diào)，而ESR2 表達呈優(yōu)勢狀態(tài)[26]，同時TRUKHACHEVA 等[27]還證明在異位內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中，高表達的ESR2 可以抑制ESR1 的表達。本研究中ESR1 表達也出現(xiàn)下調(diào)，與前人研究結(jié)果相符。2016年ZHOU 等[28]曾發(fā)現(xiàn)，miR-196a 通過MEK/ERK 信號通路改變孕激素受體亞型在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達，因此本研究中的miR-125-5p 是否也可以通過調(diào)節(jié)雌、孕激素受體而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展值得進一步研究。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究與子宮內(nèi)膜異位癥中的關(guān)鍵miRNA 和差異表達基因的關(guān)系，為子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制及診斷標(biāo)志物的研究提供了思路。