硫酸乙酰肝素在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及其臨床意義*

宋雨茜，李鑫，周高雅，王珊

（1.中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 制藥工程系，湖南 長沙 410083；2.湖南省腦科醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 長沙 410007）

腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤[1]。硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）是由重復(fù)的葡萄糖胺和己糖醛酸殘基組成的二糖單元[2]。1 個或多個HS 鏈以共價鍵方式與核心蛋白結(jié)合形成的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）[3]是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成部分。HS 鏈可與生長因子、趨化因子、成形素等多種細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白相互作用，在腦膠質(zhì)瘤的生長、侵襲及血管生成中發(fā)揮重要作用。然而HS 在腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)水平及與預(yù)后的關(guān)系尚未見報道。本研究選用171 例腦膠質(zhì)瘤患者的組織芯片，檢測HS在腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)水平，分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 材料與試劑

人腦膠質(zhì)瘤組織芯片HBraG171Su01 購自上海芯超生物科技有限公司，包含171 例腦膠質(zhì)瘤患者的腫瘤組織，所有腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理資料完整。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)，將腦膠質(zhì)瘤分為Ⅰ～Ⅳ級[4]。其中，Ⅰ級20 例，Ⅱ級79 例，Ⅲ級51 例，Ⅳ級21 例。

HS 鼠單克隆抗體購自美國Amsbio 公司，免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB 顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，蘇木精購自美國Sigma 公司。

1.2 方法

組織芯片采用免疫組織化學(xué)Envision 二步法染色。首先對組織芯片常規(guī)脫蠟、水化，用檸檬酸修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù)后自然冷卻、封閉，取出片子，用PBS 沖洗3 次，滴加1∶1 000 稀釋的HS 抗體，于4℃冰箱過夜孵育。用標(biāo)記辣根過氧化物酶的鼠二抗在室溫下孵育45 min，DAB 試劑盒顯色后在流動的自來水下沖洗5 min。最后用蘇木精復(fù)染5 s，自來水下沖洗5 min，室溫晾干后用中性樹膠固定、封片。為證明HS 抗體對免疫組織化學(xué)染色的特異性，以鼠IgG 為空白對照進(jìn)行染色，結(jié)果為陰性。用PBS 代替一抗對HS 陽性的片子進(jìn)行染色，結(jié)果為陰性。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn)

結(jié)果的判讀采用雙盲法。聘請2 位病理學(xué)專家對組織芯片的免疫組織化學(xué)結(jié)果進(jìn)行評分。①根據(jù)HS在腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的染色強(qiáng)度分別進(jìn)行評分： （-）陰性為0 分，（+）弱陽性為1 分，（++）陽性為2 分， （+++）強(qiáng)陽性為3 分。②根據(jù)染色陽性率進(jìn)行評分： 0%為0 分，＞0%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分， ＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分。最終總評分為染色強(qiáng)度評分與染色陽性率評分的乘積[5]?？傇u分≤ 4 分為HS 低表達(dá)，總評分＞4 分為HS 高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以構(gòu)成比或率（%）表示，比較用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗；影響因素的分析用Cox 比例風(fēng)險回歸模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HS 在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，HS 的陽性表達(dá)定位于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，且HS 在腦膠質(zhì)瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的染色程度及范圍隨腫瘤分級升高而加深或擴(kuò)大。見圖1。

2.2 HS 與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的關(guān)系

圖1 不同腫瘤分級腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中HS 的表達(dá) （免疫組織化學(xué)染色×200）

不同年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤分級、生存狀態(tài)的腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤細(xì)胞中HS 的表達(dá)水平比較，經(jīng)χ2檢驗，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見 表1。

不同腫瘤位置、腫瘤分級、生存狀態(tài)的腦膠質(zhì)瘤患者血管內(nèi)皮細(xì)胞HS 表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同年齡、性別的腦膠質(zhì)瘤患者血管內(nèi)皮細(xì)胞HS 表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

2.3 HS 表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者生存時間的關(guān)系

腦膠質(zhì)瘤組織腫瘤細(xì)胞中HS 表達(dá)水平不同的患者的生存時間比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.432，P=0.510）。腦膠質(zhì)瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中HS 表達(dá)水平不同的患者的生存時間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.820，P=0.000），腦膠質(zhì)瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞HS 表達(dá)水平越高，總生存期越短。見圖2。

以腦膠質(zhì)瘤患者是否死亡為因變量，以其他參數(shù)為自變量，其中年齡＞35 歲、男性、腫瘤位置為額葉、病理分級Ⅰ級、腫瘤細(xì)胞HS 高表達(dá)、血管內(nèi)皮細(xì)胞HS 高表達(dá)賦值為1。逐步多因素Cox 比例風(fēng)險回歸分析結(jié)果顯示，HS 在腦膠質(zhì)瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)和腫瘤分級高是腦膠質(zhì)瘤患者生存時間的影響因素（P＜0.05）。見表2。

表1 不同臨床病理特征腦膠質(zhì)瘤患者的HS 表達(dá)水平比較 例（%）

圖2 不同HS 表達(dá)水平腦膠質(zhì)瘤患者的生存曲線

表2 腦膠質(zhì)瘤患者生存時間的多因素Cox 比例風(fēng)險回歸分析參數(shù)

3 討論

HS 與核心蛋白結(jié)合，以HSPG 的方式出現(xiàn)在細(xì)胞膜和細(xì)胞外基質(zhì)表面，HS 鏈?zhǔn)羌?xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的重要調(diào)節(jié)者。HS 鏈的硫酸化序列對HS 鏈與生長因子、細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)的相互作用有影響[6]。在腫瘤微環(huán)境中，高度硫酸化的HS 鏈通過與血管生成因子、成纖維細(xì)胞生長因子2 （fibroblast growth factor 2,FGF2）、肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）、血管生成素1 等 促血管生成因子結(jié)合，激活下游信號通路，促進(jìn)腫瘤血管生成，進(jìn)一步加速腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，HS 鏈特異性結(jié)構(gòu)或組成變化都會影響腫瘤生長[8]。在黑色素瘤中，高度硫酸化的HS 鏈促進(jìn)FGF2 生成，刺激細(xì)胞增殖。HS 鏈與HGF、血小板釋放生長因子、脂蛋白脂肪酶的結(jié)合都依賴于HS鏈的6-O-硫酸化[9]。作用于HS 鏈生物合成和降解途徑中的酶可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)過程，對腫瘤發(fā)展也有重要調(diào)控作 用[10]。硫酸酯酶1（SULF1）和硫酸酯酶2（SULF2）可特異性切掉6-O-硫酸鹽，影響FGF2、細(xì)胞外基質(zhì)、HGF、膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放的神經(jīng)營養(yǎng)因子等生長因子與HS 結(jié)合，并發(fā)生相互作用，從而影響腫瘤生長的信號通路[11]。已證實SULF2 在膠質(zhì)瘤組織高表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)HSPG 依賴的受體酪氨酸激酶信號通路，促進(jìn)腫瘤的增殖[12]。

有研究結(jié)果表明，HS 主要在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，只有少數(shù)幾個組織樣本在細(xì)胞外有HS 表達(dá)，且HS 主要出現(xiàn)在壞死區(qū)域或腺性結(jié)構(gòu)邊界，與細(xì)胞類型無關(guān)[13]。事實上，除了腫瘤組織，HS 在腦血管系統(tǒng)亦有表達(dá)[14]。鑒于血管增生在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的重要作用，本實驗檢測了HS 在腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞HS 表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度無關(guān)，但血管內(nèi)皮細(xì)胞HS 表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤惡性程度有關(guān)，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞HS 的表達(dá)可能參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展，可能是反映腦膠質(zhì)瘤惡性程度的重要指標(biāo)。此外，本研究結(jié)果表明腦膠質(zhì)瘤患者血管內(nèi)皮細(xì)胞HS 表達(dá)水平越高，總生存期越短，且HS 在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)是腦膠質(zhì)瘤患者總生存期的影響因素，而腫瘤細(xì)胞HS 表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度無關(guān)。

綜上所述，血管內(nèi)皮細(xì)胞的HS 可能在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。